本發(fā)明涉及乙型肝炎生物治療研究領(lǐng)域，尤其涉及一種逆轉(zhuǎn)乙型肝炎病毒慢性感染的抗tim-3抗體和α-galcer的組合以及α-galcer聯(lián)合抗tim-3抗體免疫療法在清除乙型肝炎病毒中的作用。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)為嗜肝dna病毒，hbv感染可誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)，造成肝細(xì)胞損傷。hbv持續(xù)感染可誘發(fā)肝纖維化，甚至肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)，是危害人類身體健康的重要危險(xiǎn)因素。

hbv慢性感染與hbv誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生肝免疫耐受有關(guān)。慢性感染患者的肝固有免疫細(xì)胞，肝適應(yīng)性免疫細(xì)胞均處在對(duì)hbv低應(yīng)答、甚至無(wú)應(yīng)答狀態(tài)，這使hbv產(chǎn)生免疫逃逸并在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)擴(kuò)增?，F(xiàn)有hbv臨床治療方案多傾向于藥物抗病毒療法，但藥物治療只能抑制病毒復(fù)制，并不能徹底清除肝細(xì)胞內(nèi)hbv，且長(zhǎng)時(shí)間藥物治療易對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定毒副作用并導(dǎo)致hbv耐藥株的出現(xiàn)。而通過(guò)干預(yù)免疫檢查點(diǎn)并結(jié)合其他免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)劑的聯(lián)合治療將有助于逆轉(zhuǎn)肝免疫耐受、恢復(fù)機(jī)體自身免疫細(xì)胞功能、增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，在阻斷hbv慢性感染中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

慢性hbv感染的形成機(jī)制非常復(fù)雜，關(guān)于細(xì)胞免疫的調(diào)控機(jī)制原理也一直是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。inkt(invariantnaturekillert)細(xì)胞，又稱經(jīng)典型或恒定nkt細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)nk細(xì)胞表面標(biāo)志以及恒定的vαl4-jα18鏈tcr。inkt細(xì)胞，識(shí)別由cd1d提呈的脂類抗原分子，可被α-半乳糖?；拾贝?α-galcer)特異性激活。被活化的inkt細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，尤其是il-4和ifn-γ，參與多種途徑的免疫調(diào)節(jié)。inkt細(xì)胞可以被cd1d-β2m復(fù)合物(第一信號(hào))激活，第二信號(hào)既可通過(guò)cd28、icos等通路傳遞正向活化信號(hào)，也可通過(guò)ctla-4、pd-1、tim-3等通路傳遞負(fù)向抑制信號(hào)。

作為聯(lián)系機(jī)體固有免疫、適應(yīng)性免疫的橋梁，inkt(invariantnaturalkillert)細(xì)胞在肝免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。活化inkt細(xì)胞可增強(qiáng)肝固有免疫、適應(yīng)性免疫應(yīng)答。α-galcer可有效活化inkt細(xì)胞，但臨床研究證實(shí)，常用α-galcer治療劑量可有效活化inkt細(xì)胞并降低hbvdna病毒載量，但毒性作用太大。而降低α-galcer劑量雖可降低度副作用，但活化inkt和抑制hbv復(fù)制的作用卻大大降低，治療效果很不理想。

tim-3(tcellimmunoglobulin-andmucin-domain-containingmolecule-3)是關(guān)鍵的免疫負(fù)調(diào)控分子，與其配體galectin-9相互作用可負(fù)向調(diào)控ifn-γ的產(chǎn)生，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮重要作用。tim-3最初發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于th1細(xì)胞中，但最近研究顯示tim-3在cd8+t、dc、nk、nkt和單核巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上均有表達(dá)，并通過(guò)影響這些細(xì)胞的功能，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。靶向tim-3的免疫療法已在多種腫瘤中展現(xiàn)了很好的治療作用，但目前靶向tim-3對(duì)于逆轉(zhuǎn)hbv慢性感染的作用和機(jī)制尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有hbv清除方法的缺乏與不足，本發(fā)明闡明抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer清除hbv的可行性，為hbv轉(zhuǎn)歸臨床治療提供理論依據(jù)和治療方案。

具體的，本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hbv感染患者cd8+t、nk、inkt和單核巨噬細(xì)胞表面tim-3表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度升高，tim-3高表達(dá)與hbv患者肝固有免疫、適應(yīng)性免疫耐受密切相關(guān)。基于這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種inkt細(xì)胞表面tim-3表達(dá)水平檢測(cè)的診斷試劑，所述診斷試劑用于檢測(cè)inkt細(xì)胞表面tim-3的表達(dá)水平。

在具體實(shí)施方案中，所述診斷試劑用于檢測(cè)inkt細(xì)胞表面tim-3的蛋白表達(dá)水平，例如可以借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)inkt細(xì)胞表面tim-3蛋白表達(dá)水平。

更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述診斷試劑包含抗tim-3的抗體，例如wo2016161270a1公開(kāi)了一系列抗tim-3的抗體，在此一并納入本發(fā)明。

其次，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)除α-galcer外，某些免疫檢查點(diǎn)負(fù)性調(diào)控因素(tim-3)在阻礙hbv清除過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在α-galcer活化inkt的同時(shí)，干預(yù)免疫細(xì)胞檢查點(diǎn)tim-3，有可能逆轉(zhuǎn)hbv肝免疫耐受，實(shí)現(xiàn)hbv轉(zhuǎn)歸，并且通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer可有效清除hbv，顯著降低hbv病毒載量及hbsag及肝組織pgrna水平。本發(fā)明涉及的聯(lián)合生物治療方案，將為hbv聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

基于這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種用于hbv慢性感染治療的藥物組合物，該組合物包括抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物。

抗tim-3抗體包括但不限于現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的針對(duì)tim-3的抗體，例如wo2016161270a1公開(kāi)了一系列抗tim-3的抗體，在此一并引入本發(fā)明。

α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-galcer)是一種從海綿體中提取有cd1d遞呈的糖酯，由親水性的碳酸化合物部分與疏水性的?；拾贝疾糠滞ㄟ^(guò)α連接形成，α-galcer是nkt細(xì)胞的配體，在體內(nèi)外均能有效激活nkt細(xì)胞。

α-galcer功能衍生物，是指α-galcer的衍生物或其改性糖酯，其作用機(jī)制同α-galcer，能有效激活nkt細(xì)胞。例如cn105339379a公開(kāi)了改性的糖酯及其制備方法，在此一并納入本發(fā)明。

優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物的質(zhì)量比為(30-80)：1，例如，50:1。所述抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物的用量比可相應(yīng)調(diào)劑，使其既可以發(fā)揮阻斷tim-3的作用又可以發(fā)揮α-galcer效果、有效激活nkt細(xì)胞，從而顯著降低hbv病毒載量及hbsag及肝組織pgrna水平。

本發(fā)明所述的藥物組合物除包括抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物外，還可以包括常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑等，以滿足制劑過(guò)程中的需要。

此外，本發(fā)明還公開(kāi)了抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物在制備hbv慢性感染治療的藥物中的用途。

具體的實(shí)施方案中，所述藥物(抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物)可有效清除hbv、顯著降低hbv病毒載量、降低hbsag量、降低肝組織pgrna水平。

為增強(qiáng)肝免疫細(xì)胞功能，強(qiáng)化其清除hbv病毒作用，本發(fā)明重點(diǎn)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究并取得了相應(yīng)有益效果：

(1)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了tim-3在hbv感染肝inkt細(xì)胞高表達(dá)的結(jié)果；通過(guò)檢測(cè)inkt細(xì)胞表面tim-3的表達(dá)水平可以輔助用于hbv慢性感染的診斷。

(2)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射抗tim-3抗體，對(duì)inkt細(xì)胞具有活化作用，并且活化的inkt細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)nk、cd8+t細(xì)胞功能；為hbv聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

(3)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer可有效清除hbv，顯著降低hbv病毒載量及hbsag及肝組織pgrna水平，克服了單純應(yīng)用α-galcer活化inkt細(xì)胞不能有效降低hbvdna病毒載量的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1流式檢測(cè)inkt細(xì)胞表面tim-3的表達(dá)結(jié)果：圖1a為流式檢測(cè)cd3+cd1d+inkt細(xì)胞圖，圖1b為細(xì)胞表面tim-3分子表達(dá)情況，圖1c為tim-3在hbv-tg小鼠和對(duì)照小鼠之間的差異表達(dá)情況。

圖2阻斷tim-3促進(jìn)α-galcer誘導(dǎo)的inkt細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2a為流式檢測(cè)α-galcer+atim-3組ifn-γ，圖2b為α-galcer+atim-3組ifn-γ檢測(cè)結(jié)果，圖2c為流式檢測(cè)α-galcer+atim-3組cd107a，圖2d為α-galcer+atim-3組cd107a檢測(cè)結(jié)果。

圖3α-galcer聯(lián)合抗tim-3中和抗體結(jié)果：圖3a為nk細(xì)胞流式結(jié)果，圖3b為cd8+t細(xì)胞流式結(jié)果。

圖4α-galcer及聯(lián)合抗tim-3中和抗體方案對(duì)hbv復(fù)制的影響結(jié)果：圖4a為抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer降低血清hbsag，圖4b為抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer降低血清hbv-dna，圖4c、圖4d為抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer降低肝組織pgrna水平。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中雖然α-galcer可有效活化inkt細(xì)胞，并被應(yīng)用于hbv臨床治療，但單純應(yīng)用α-galcer活化inkt細(xì)胞，并不能有效降低hbvdna病毒載量，為了解決如上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明發(fā)明人展開(kāi)研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hbv感染患者cd8+t,nk，inkt，單核巨噬細(xì)胞表面tim-3均呈現(xiàn)不同程度升高，tim-3高表達(dá)與hbv患者肝固有免疫、適應(yīng)性免疫耐受密切相關(guān)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)除α-galcer外，免疫檢查點(diǎn)負(fù)性調(diào)控因素(tim-3)在阻礙hbv清除過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在α-galcer活化inkt的同時(shí)，干預(yù)免疫細(xì)胞檢查點(diǎn)tim-3，有可能逆轉(zhuǎn)hbv肝免疫耐受，實(shí)現(xiàn)hbv轉(zhuǎn)歸，并且通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer可有效清除hbv，顯著降低血清hbv病毒載量及hbsag及肝組織pgrna水平。

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于hbv慢性感染治療的藥物組合物，該組合物包括抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物。

抗tim-3抗體包括但不限于現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的針對(duì)tim-3的抗體，例如wo2016161270a1公開(kāi)了一系列抗tim-3的抗體，在此一并引入本發(fā)明。

α-半乳糖?；拾贝?α-galcer)是一種從海綿體中提取有cd1d遞呈的糖酯，由親水性的碳酸化合物部分與疏水性的?；拾贝疾糠滞ㄟ^(guò)α連接形成，α-galcer是nkt細(xì)胞的配體，在體內(nèi)外均能有效激活nkt細(xì)胞。

α-galcer功能衍生物，是指α-galcer的衍生物或其改性糖酯，其作用機(jī)制同α-galcer，能有效激活nkt細(xì)胞。例如cn105339379a公開(kāi)了改性的糖酯及其制備方法，在此一并納入本發(fā)明。

優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物的質(zhì)量比為(30-80)：1，例如，50:1。所述抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物的用量比可相應(yīng)調(diào)劑，使其既可以發(fā)揮阻斷tim-3的作用又可以發(fā)揮α-galcer效果、有效激活nkt細(xì)胞，從而顯著降低hbv病毒載量及hbsag及肝組織pgrna水平。

本發(fā)明所述的藥物組合物除包括抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物外，還可以包括常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑等，以滿足制劑過(guò)程中的需要。

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物在制備hbv慢性感染治療的藥物中的用途。

具體的實(shí)施方案中，所述藥物(抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物)可有效清除hbv、顯著降低hbv病毒載量、降低hbsag量、降低肝組織pgrna水平。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了hbv慢性感染治療的聯(lián)合治療方法，包括采用抗tim-3抗體和α-galcer或其功能衍生物的聯(lián)合治療方案。通過(guò)該方案，實(shí)現(xiàn)hbv轉(zhuǎn)歸。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1流式檢測(cè)hbv-tg小鼠肝inkt細(xì)胞表面tim-3表達(dá)

1.處死小鼠，消毒皮膚，打開(kāi)腹腔，取出肝臟，pbs保持其濕潤(rùn)。

2.在研缽中將肝臟剪碎，研磨，200目銅網(wǎng)過(guò)濾，15ml或50ml離心管收集細(xì)胞濾液。

3.400rpm，離心1min，收集上清。

4.1500rpm，離心8min，棄掉上清。

5.紅細(xì)胞裂解液5ml重懸細(xì)胞沉淀，混勻，4度孵育5min，再以1500rpm離心8min，棄上清。期間配置40％percoll溶液。

6.離心完畢加入8ml40％percoll溶液，重懸、混勻細(xì)胞，水平轉(zhuǎn)子離心25min，轉(zhuǎn)速為2500rpm。

7.離心完畢，溶液分三層，吸棄上面兩層，保留底層細(xì)胞沉淀。

8.5mlpbs重懸、混勻細(xì)胞，1500rpm離心8min，棄上清，再加1mlpbs重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1*10⁶～1*10⁷/ml。

9.取100μl細(xì)胞懸液到流式管，加入cd1dtetramer(pbs-57,美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院nih贈(zèng)送)或其對(duì)照(unloaded，nih贈(zèng)送)10μl，4℃孵育30min，再加入anti-cd3e(克隆號(hào)145-2c11，ebioscience)和抗tim-3抗體(克隆號(hào)rmt3-23，ebioscience)，繼續(xù)孵育30min。

10.孵育結(jié)束，加入2mlpbs洗細(xì)胞，1500rpm離心6min，棄上清，再加入2mlpbs洗細(xì)胞一次，方法同前。

11.取1％的多聚甲醛pbs液500μl重懸、混勻細(xì)胞沉淀，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果如圖1所示，圈出cd3+cd1d+inkt細(xì)胞(圖1a)，分析其表面tim-3分子表達(dá)(圖1b)，并統(tǒng)計(jì)比較tim-3表達(dá)在hbv-tg小鼠和對(duì)照小鼠之間的差異(圖1c)，hbv-tg鼠inkt細(xì)胞表面tim-3表達(dá)顯著升高。

實(shí)施例2α-galcer預(yù)處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)inkt細(xì)胞ifn-γ和cd107a的分泌

1.選取6-8周齡hbv-tg小鼠，尾靜脈注入2μgα-galcer溶液，注入總體積為200μl，注射完畢觀察小鼠狀態(tài)無(wú)異常。

2.24小時(shí)后處死小鼠，分離肝單個(gè)核細(xì)胞，分離的細(xì)胞用1640培養(yǎng)基洗一遍。

3.用1640+10％fbs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，種24孔板，種板密度為1*10⁶/孔。

4.加入布雷菌素(bfa,1μg/ml)阻斷蛋白分泌，并同時(shí)加入anti-cd107a(克隆號(hào)1d4b，biolegend)用來(lái)檢測(cè)cd107a。

5.2小時(shí)后收細(xì)胞，2mlpbs洗細(xì)胞兩次，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心6min，棄上清，100μlpbs重懸細(xì)胞。

6.加入cd1dtetramer或其對(duì)照10μl，4度孵育30min，再加入anti-cd3繼續(xù)孵育30min。孵育結(jié)束，加入2mlpbs洗細(xì)胞，1500rpm離心6min，棄上清。

7.然后：

①加了anti-cd107a的孔，繼續(xù)加2mlpbs洗細(xì)胞，方法同前。1％的多聚甲醛pbs液500μl重懸細(xì)胞，待用；

②用100μlfixationbuffer(ebioscience)重懸細(xì)胞，4℃固定30min，再加2mlpermealizationbuffer(ebioscience)洗細(xì)胞，1500rpm離心8min，棄上清，100μlpermealizationbuffer重懸細(xì)胞，加入anti-ifn-γ，4℃孵育30min。

8.孵育結(jié)束，加2mlpbs洗細(xì)胞兩次，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心8min，棄上清，1％的多聚甲醛pbs液500ul重懸細(xì)胞，待用。

實(shí)施例3α-galcer預(yù)處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)cd8+t細(xì)胞和nk細(xì)胞ifn-γ和cd107a表達(dá)

1.小鼠處理、肝單個(gè)核細(xì)胞分離及細(xì)胞的培養(yǎng)、刺激等方法同實(shí)施例2中關(guān)于ifn-γ的描述一致。

2.洗細(xì)胞后，100ulpbs重懸細(xì)胞，加入anti-cd3e(克隆號(hào)145-2c11，ebioscience)，anti-cd8a(克隆號(hào)53-6.7，ebioscience)，anti-nk1.1(克隆號(hào)pk136，ebioscience)和anti-cd49b(克隆號(hào)為dx5，bdpharmingen)，4℃孵育30min。

3.再加入2mlpbs洗細(xì)胞，1500rpm離心8min，其后標(biāo)記或檢測(cè)ifn-γ或cd107a的步驟如2中所述。

其中：cd3+cd8+細(xì)胞定義為cd8t細(xì)胞，cd3-nk1.1/dx5+細(xì)胞為nk細(xì)胞。

結(jié)果如圖2所示，驗(yàn)證抗tim-3抗體聯(lián)合α-galcer對(duì)inkt細(xì)胞功能的影響，本發(fā)明用100μg抗tim-3中和抗體或?qū)φ読gg預(yù)處理小鼠并檢測(cè)inkt細(xì)胞功能。流式結(jié)果表明，α-galcer+atim-3組ifn-γ(圖2a,b)和cd107a(圖2c,d)的表達(dá)要顯著高于單獨(dú)α-galcer+igg組及其他各組。

實(shí)施例4α-galcer聯(lián)合抗tim-3中和抗體方案

1選取6-8周齡hbv-tg小鼠，腹腔注射100μg抗tim-3中和抗體或其對(duì)照igg。

2.24小時(shí)后尾靜脈注入2ugα-galcer或0.5％dmso的nacl對(duì)照溶液，注射總體積為200ul。

3.48小時(shí)處死小鼠，分離肝單個(gè)核細(xì)胞。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)inkt細(xì)胞、cd8t細(xì)胞及nk細(xì)胞ifn-γ和cd107a的表達(dá)，方法同前所述。

結(jié)果如圖3所示，抗tim-3抗體聯(lián)合α-galcer對(duì)nk和cd8+t細(xì)胞具有活化作用，流式結(jié)果表明，α-galcer增加nk細(xì)胞比例，以及胞內(nèi)ifn-γ和cd107a水平(圖3a)，與此同時(shí)，cd8+t細(xì)胞比例及ifn-γ和cd107a水平也顯著增強(qiáng)(圖3b)。

實(shí)施例5檢測(cè)α-galcer及聯(lián)合抗tim-3中和抗體方案對(duì)hbv復(fù)制的影響

觀察hbv復(fù)制的指標(biāo)主要檢測(cè)三個(gè)：表面抗原(hbsag)、乙肝病毒的脫氧核糖核酸(hbvdna)及hbv前基因組rna(pgrna)。方法如下：

1建模小鼠摘眼球取血，于1.5mlep管中離心，轉(zhuǎn)速設(shè)置為4000rpm，20min后小心吸取上清：

①雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)檢測(cè)血清中hbsag的含量。

②熒光定量pcr(qiagen)檢測(cè)血清中hbvdna的含量。

2另外，剪取豆粒大小肝組織，研碎。

3適量肝組織trizol法提取rna，再逆轉(zhuǎn)錄為dna(tiangen，天根逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)。熒光定量pcr和普通pcr檢測(cè)肝組織pgrna的含量。

引物：

上游引物：ctcaatctcgggaatctcaatgt(seqidno:1)，

下游引物：aggatagaacctagcaggcataat(seqidno:2)，

產(chǎn)物大小231bp。

結(jié)果如圖4所示，抗tim-3抗體聯(lián)合應(yīng)用α-galcer顯著降低hbv-tg小鼠血清hbsag、hbv-dna及肝組織pgrna水平。α-galcer顯著降低hbv-tg小鼠血清hbsag水平，阻斷tim-3明顯增強(qiáng)α-galcer誘導(dǎo)的hbsag清除(圖4a)。同樣，與單獨(dú)α-galcer刺激組相比較，抗tim-3抗體聯(lián)合α-galcer對(duì)血清hbv-dna降低作用更加顯著(4b)?？箃im-3抗體聯(lián)合α-galcer可顯著降低hbs-tgc57/b6小鼠肝組織pgrna表達(dá)(圖4c,4d)。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)

<120>一種逆轉(zhuǎn)乙型肝炎病毒慢性感染的抗tim-3抗體和α-galcer的組合及應(yīng)用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工

<400>1

ctcaatctcgggaatctcaatgt23

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工

<400>2

aggatagaacctagcaggcataat24