本發(fā)明屬于香精香料檢測
技術(shù)領域：
，具體涉及一種提取香精香料中維生素B的方法，還涉及一種檢測香精香料中維生素B的方法，還涉及一種提取和/或檢測香精香料中維生素B的試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
：香精香料涵蓋香精和香料兩類。其中，香料又稱香原料，是一種能被嗅感嗅出的氣味或被味感品出香味的物質(zhì)，一般作為調(diào)制香精的原料。香料可分為天然香料、單離香料和合成香料等。天然香料是指動物性或植物性香料；單離香料是指用物理或化學方法由天然香料中分出的單體香料；合成香料是運用不同原料經(jīng)化學或生物合成而制備出的香料。香精是由兩種或兩種以上的香料按一定比例混合調(diào)配出來的混合物，也稱為調(diào)和香料。目前，我國可生產(chǎn)各類香精香料約七百余種，其中天然香精香料有一百四十余種，包括精油、浸膏、精油、油樹脂等，這些香精香料主要用于日用化工、煙用、醫(yī)藥、食品等領域。維生素B是所有人體組織必不可少的營養(yǎng)素，是食物釋放能量的關(guān)鍵。其中，維生素B3，又名煙酸(Niacin，NA)或者尼克酸，其耐熱、能升華，煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺能夠促使輔酶I和輔酶Ⅱ參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝、組織呼吸的氧化過程以及糖類無氧分解的過程。人體若缺乏煙酸，容易患糙皮病，表現(xiàn)為皮炎、舌炎、腹瀉、煩躁、失眠和感覺異常等癥狀。維生素B5，又名泛酸或遍多酸，泛酸是輔酶A的組成部分，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物的生理代謝，尤其是對脂肪的合成和代謝起著十分重要的作用。維生素B7，又名生物素，生物素最重要的生理學作用是作為羧化酶、羧基轉(zhuǎn)移酶和脫羧酶的輔酶參與人體的糖類、脂肪和氨基酸代謝及能量傳遞過程。維生素B7長期攝入不足會影響蛋白質(zhì)及RNA的合成，降低身體免疫力。維生素B9，又名葉酸(Folate，F(xiàn)A)，廣泛存在于柑橘類水果、十字花科蔬菜、豆類、谷物和肝臟中，葉酸是嘌呤和嘧啶合成所必須的物質(zhì)，葉酸的缺乏會導致巨紅細胞型貧血、癌癥及神經(jīng)障礙等多種疾病。以上四種維生素B為人體必需的維生素，檢測這四種維生素B的含量對健康醫(yī)學的研究有重要意義。目前，葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種維生素B的檢測主要是針對于奶粉、玉米、雞蛋等食品，常用的分析方法包括微生物法、高效液相色譜法和生物傳感器法。但是，這幾種分析方法存在一定程度上的不足：微生物法操作繁瑣，重現(xiàn)性差；液相色譜法存在嚴重的雜質(zhì)干擾，色譜柱對四種維生素B的分離能力和檢測器對四種維生素B的分辨能力均較差，而且無法檢測出含量較低的物質(zhì)；生物傳感器法容易受樣品基質(zhì)的干擾，基質(zhì)效應嚴重。目前，尚無同時檢測出食品樣品中葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種維生素B的報道。與食品樣品相比，香精香料尤其是煙用香精香料的成分更多，含量組成更為復雜，更易對成分檢測造成干擾。正是出于這一原因，至今尚無檢測香精香料尤其是煙用香精香料中葉酸、煙酸、生物素和泛酸的報道，更加沒有同時檢測上述這四種維生素B的報道。目前，需要一種同時檢測香精香料中葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種維生素B的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種能同時并有效提取香精香料(尤其是煙用香精香料)中的四種維生素B(維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9)的方法。本發(fā)明還提供了一種能準確同時檢測香精香料中四種維生素B(維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9)含量的方法。本發(fā)明還提供了一種同時提取和/或檢測香精香料中四種維生素的試劑盒。本發(fā)明第一方面涉及一種提取香精香料中維生素B的方法，包括如下步驟：(1)將香精香料樣品與鹽酸溶液混合，得到混合物；(2)將混合物固液分離，得到提取液；其中，所述維生素B包括維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9中的一種或多種；優(yōu)選地，所述維生素B為維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，在步驟(1)和(2)之間還包括步驟(1-A)：將步驟(1)得到的混合物與溶液a混合，得到混合物；其中，所述溶液a中包含乙腈和水。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，其還包括步驟(2-A)：將步驟(2)得到的提取液與溶液a混合，固液分離，得到提取液；其中，所述溶液a中包含乙腈和水。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，其中，溶液a中乙腈的含量為20％-80％(W/W)，優(yōu)選為40％-60％(W/W)，更優(yōu)選為50％。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，其中，步驟(1)得到的混合物或步驟(2)得到的提取液與溶液a混合的體積比為1:(6-12)，優(yōu)選為1:(8-10)，例如1:9或1:10。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，其中，所述溶液a中還包含乙酸銨；優(yōu)選地，溶液a中乙酸銨的摩爾濃度為7-13mmol/L，更優(yōu)選為9-11mmol/L，進一步優(yōu)選為10mmol/L。本發(fā)明第一方面的一個實施方式中，其還包括如下(a)至(f)中的一項或多項：(a)步驟(1)中，鹽酸溶液的摩爾濃度為0.1-0.3mol/L，優(yōu)選為0.15-0.3mol/L，更優(yōu)選為0.2mol/L；(b)步驟(1)中，香精香料樣品與鹽酸溶液的比例為1:(70-130)(g/mL)，優(yōu)選為1:(90-110)(g/mL)，更優(yōu)選為1:100(g/mL)；(c)步驟(1)中，所述混合在超聲條件下進行；優(yōu)選地，超聲時間為20-60分鐘，更優(yōu)選為25-50分鐘，進一步優(yōu)選為30分鐘；(d)步驟(2)和/或步驟(2-A)中，所述固液分離包括靜置沉淀，收集上清液的步驟；優(yōu)選地，靜置沉淀的時間為6-13分鐘，更優(yōu)選為10分鐘；優(yōu)選地，步驟(2)中，所述固液分離還包括將上清液過濾，收集濾液的步驟；更優(yōu)選地，過濾所用濾膜的孔徑為0.1-1μm，進一步優(yōu)選為0.4-0.5μm，更進一步優(yōu)選為0.45μm；(e)所述香精香料樣品為煙用香精香料樣品；(f)所述提取方法為同時提取香精香料中維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9的方法。本發(fā)明第二方面涉及一種檢測香精香料中維生素B的方法，包括如下步驟：A)采用本發(fā)明第一方面任一所述提取方法對香精香料樣品進行前處理，將步驟(2)得到的提取液或步驟(2-A)得到的提取液作為待測樣品；B)采用液相色譜-質(zhì)譜法對待測樣品進行檢測；優(yōu)選地，所述檢測方法還包括步驟C)：根據(jù)步驟B)的檢測結(jié)果計算香精香料樣品中維生素B的含量；優(yōu)選地，所述檢測方法使用的內(nèi)標物包括葉酸-13C5、煙酸-D4和泛酸鈣-[13C3，15N]；更優(yōu)選地，泛酸、生物素的檢測都采用泛酸鈣-[13C3，15N]作為內(nèi)標物；優(yōu)選地，所述檢測方法為同時檢測香精香料中維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9的方法；優(yōu)選地，所述香精香料樣品為煙用香精香料樣品。本發(fā)明第二方面的一個實施方式中，其中，所述液相色譜的操作條件包括如下(A)至(E)中的一項或多項：(A)色譜柱為WatersAtiantisT3色譜柱；優(yōu)選地，色譜柱的規(guī)格為100mm×3mmi.d.,2.6μm粒徑；(B)色譜柱的溫度為25-35℃，優(yōu)選為29-33℃，更優(yōu)選為30℃；(C)進樣量為6-14μL，優(yōu)選為7-13μL，更優(yōu)選為10μL；(D)流動相為甲醇溶液或者流動相由流動相A和流動相B組成；優(yōu)選地，流動相A為包含有乙酸銨和水的溶液b，流動相B為乙腈；更優(yōu)選地，溶液b中乙酸銨的摩爾濃度為7-13mmol/L，進一步優(yōu)選為10mmol/L；更優(yōu)選地，溶液b還包含0.1％(W/W)的甲酸；優(yōu)選地，梯度洗脫程序為：時刻(分鐘)流動相中流動相A的體積百分數(shù)099％1.099％3.01％4.01％4.199％7結(jié)束即梯度洗脫程序為：0分鐘，99％(V/V)流動相A；1.0分鐘，99％(V/V)流動相A；3.0分鐘，1％(V/V)流動相A；4.0分鐘，1％(V/V)流動相A；4.1分鐘，99％(V/V)流動相A，保持到7分鐘結(jié)束；(E)流動相的流速為0.2-0.6mL/min，優(yōu)選為0.3-0.5mL/min，更優(yōu)選為0.4mL/min。本發(fā)明第二方面的一個實施方式中，其中，所述質(zhì)譜的操作條件包括如下1)至27)中的一項或多項：1)離子源為電噴霧電離源(ESI)；2)掃描方式為正離子掃描；3)檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；4)電噴霧電壓為5000-6000V，優(yōu)選為5300-5700V，更優(yōu)選為5500V；5)離子源溫度為500-600℃，優(yōu)選為540-560℃，更優(yōu)選為550℃；6)輔助氣Gas1和/或輔助氣Gas2的壓力為40-70psi，優(yōu)選為48-62psi，更優(yōu)選為50psi或60psi；7)維生素B9的定量離子對為442.0/295.0；8)維生素B9的定性離子對為442.0/176.0；9)維生素B9的碰撞能為14-48V，優(yōu)選為15V或44V；10)維生素B3的定量離子對為124.0/80.0；11)維生素B3的定性離子對為124.0/53.0；12)維生素B3的碰撞能為16-22V，優(yōu)選為18V或20V；13)維生素B7的定量離子對為245.1/227.0；14)維生素B7的定性離子對為245.1/97.0；15)維生素B7的碰撞能為15-33V，優(yōu)選為16V或32V；16)維生素B5的定量離子對為220.1/90.0；17)維生素B5的定性離子對為220.1/202.0；18)維生素B5的碰撞能為14-16V，優(yōu)選為15V；19)葉酸-13C5的定量離子對為447.0/295.0；20)葉酸-13C5的定性離子對為447.0/176.0；21)葉酸-13C5的碰撞能為14-46V，優(yōu)選為16V或44V；22)煙酸-D4的定量離子對為128.0/84.0；23)煙酸-D4的定性離子對為128.0/56.0；24)煙酸-D4的碰撞能為15-20V，優(yōu)選為18V；25)泛酸鈣-[13C3，15N]的定量離子對為224.1/94.0；26)泛酸鈣-[13C3，15N]的定性離子對為224.1/206.0；27)泛酸鈣-[13C3，15N]的碰撞能為14-16V，優(yōu)選為15V。本發(fā)明第三方面涉及一種提取和/或檢測香精香料中維生素B的試劑盒，其包含：鹽酸溶液、含有乙酸銨的乙腈水溶液和孔徑為0.4-0.5μm的濾膜；其中，所述維生素B包括維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9中的一種或多種。本發(fā)明第三方面的一個實施方式中，所述維生素B為維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9。本發(fā)明第三方面的一個實施方式中，所述試劑盒中還包含：WatersAtiantisT3色譜柱、含有甲酸的乙酸銨水溶液和乙腈。本發(fā)明第三方面的一個實施方式中，所述試劑盒中還包含：葉酸-13C5、煙酸-D4和泛酸鈣-[13C3，15N]。本發(fā)明第三方面的一個實施方式中，其還包括如下(Ⅰ)至(Ⅸ)中的一項或者多項：(Ⅰ)鹽酸溶液的摩爾濃度為0.1-0.3mol/L，優(yōu)選為0.15-0.3mol/L，更優(yōu)選為0.2mol/L；(Ⅱ)含有乙酸銨的乙腈水溶液中乙腈的含量為20％-80％(W/W)，優(yōu)選為40％-60％(W/W)，更優(yōu)選為50％(W/W)；(Ⅲ)含有乙酸銨的乙腈水溶液中乙酸銨的摩爾濃度為7-13mmol/L，優(yōu)選為9-11mmol/L，更優(yōu)選為10mmol/L。(Ⅳ)濾膜的孔徑為0.45μm；(Ⅴ)色譜柱的規(guī)格為100mm×3mmi.d.,2.6μm粒徑；(Ⅵ)含有甲酸的乙酸銨水溶液中乙酸銨的摩爾濃度為7-13mmol/L，優(yōu)選為10mmol/L；(Ⅶ)含有甲酸的乙酸銨水溶液中甲酸的含量為0.1％(W/W)；(Ⅷ)所述試劑盒為同時提取和/或檢測香精香料中維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9的試劑盒；(Ⅸ)所述香精香料為煙用香精香料。本發(fā)明第四方面涉及本發(fā)明第一方面任一所述的試劑盒在提取和/或檢測香精香料中維生素B中的用途；所述維生素B包括維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9中的一種或多種；優(yōu)選地，所述維生素B為維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9；優(yōu)選地，所述香精香料為煙用香精香料。本發(fā)明中，如無特別說明，術(shù)語“香精香料”涵蓋香精和香料兩類。其中，香料又稱香原料，是一種能被嗅感嗅出的氣味或被味感品出香味的物質(zhì)，一般作為調(diào)制香精的原料。香料可分為天然香料、單離香料和合成香料等。香精是由兩種或兩種以上的香料按一定比例混合調(diào)配出來的混合物，也稱為調(diào)和香料。術(shù)語“維生素B”舊稱維他命B，是B族維生素的總稱，它們常常來自于相同的食物來源，如酵母等，屬于水溶性維生素,是所有人體組織必不可少的營養(yǎng)素，是食物釋放能量的關(guān)鍵。維生素B有十二種以上，包括維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B8、維生素B9、維生素B12、維生素B13、維生素B15、維生素B17。術(shù)語“維生素B3”又名煙酸(Niacin，NA)或者尼克酸，其耐熱、能升華，煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺能夠促使輔酶I和輔酶Ⅱ參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝、組織呼吸的氧化過程以及糖類無氧分解的過程。術(shù)語“維生素B5”又名泛酸或遍多酸，泛酸是輔酶A的組成部分，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物的生理代謝，尤其是對脂肪的合成和代謝起著十分重要的作用。術(shù)語“維生素B7”又名生物素，生物素最重要的生理學作用是作為羧化酶、羧基轉(zhuǎn)移酶和脫羧酶的輔酶參與人體的糖類、脂肪和氨基酸代謝及能量傳遞過程。術(shù)語“維生素B9”又名葉酸(Folate，F(xiàn)A)，廣泛存在于柑橘類水果、十字花科蔬菜、豆類、谷物和肝臟中，葉酸是嘌呤和嘧啶合成所必須的物質(zhì)，葉酸的缺乏會導致巨紅細胞型貧血、癌癥及神經(jīng)障礙等多種疾病。術(shù)語“煙用香精香料”是指由多種煙用香料按一定配比并加入適當溶劑和可選的適用輔料調(diào)配出來的，具有一定香型、可專供各種煙草制品加香矯味使用的添加劑。術(shù)語“超聲”是指頻率高于20000赫茲的聲波。術(shù)語“過濾”是指推動力或者其他外力作用下懸浮液中的液體透過介質(zhì)，固體顆粒及其他物質(zhì)被過濾介質(zhì)截留，從而使固體及其他物質(zhì)與液體分離的操作。術(shù)語“內(nèi)標物”是指采用內(nèi)標法定量分析時，加入到已知量試樣中的已知量標準物質(zhì)。術(shù)語“色譜柱”是指裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。術(shù)語“流動相”是指在色譜分離中用以攜帶試樣及洗脫組分的氣體或液體。術(shù)語“梯度洗脫”又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。術(shù)語“離子源”是指質(zhì)譜分析粒子加速器中，使樣品分子發(fā)生離解產(chǎn)生快速運動的離子的部件。術(shù)語“試劑盒”是指用于盛放所需要的化學試劑及實驗室用品的盒子。本發(fā)明取得的有益效果：1、本發(fā)明的提取方法，能同時并有效提取出香精香料樣品中的維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9。2、本發(fā)明的檢測方法，能同時并準確檢測出香精香料樣品中維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9的含量。3、本發(fā)明的試劑盒可用于同時提取和/或檢測香精香料樣品中的維生素B3、維生素B5、維生素B7和維生素B9。附圖說明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中圖1為本發(fā)明實施例1中30ng/mL標準溶液的色譜圖。圖2為本發(fā)明實施例4中鹽酸溶液濃度與葉酸、煙酸、生物素和泛酸回收率之間關(guān)系的柱形圖。具體實施方式實施例11、材料煙用香精香料：為華寶香精股份有限公司的煙用香精。葉酸標準品：購買自百靈威科技公司，純度96％。煙酸標準品：購買自百靈威科技公司，純度97％。生物素標準品:購買自百靈威科技公司，純度99％。泛酸標準品：購買自百靈威科技公司，純度95％。葉酸-13C5標準品：購買自百靈威科技公司，純度99％。煙酸-D4標準品：購買自百靈威科技公司，純度99％。泛酸鈣-[13C3，15N]標準品：購買自百靈威科技公司，純度98％。2、檢測方法(1)制備提取液：取0.1g香精香料(精確至0.0001g)作為樣品，置于50mL錐形瓶中，加入10mL0.2mol/L的鹽酸水溶液，超聲混合30分鐘，靜置10分鐘，分離出上清液并定容至10mL。將上清液過0.45μm的濾膜，取1mL濾液，用重量比為1:1的乙腈和水混合形成的溶液(含10mmol/L乙酸銨)定容至10.0mL，混合均勻，靜置10分鐘，分離出上清液即提取液。(2)配制標準溶液：分別取10.0mg的葉酸標準品、煙酸標準品、生物素標準品和泛酸標準品，分別置于四個100mL棕色容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀釋至刻度，配成濃度均為0.1mg/mL的四種標準儲備液。將四種標準儲備液各取1.0mL，放入一個100mL容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀釋至刻度，配制成葉酸、煙酸、生物素和泛酸的濃度均為1.0μg/mL的混合標準溶液。分別取10.0mg的葉酸-13C5標準品、煙酸-D4標準品和泛酸鈣-[13C3，15N]標準品，分別置于三個10mL棕色容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀釋至刻度，配成濃度均為1.0mg/mL的三種內(nèi)標儲備液。移取1.0mL的葉酸-13C5儲備液、1.0mL的煙酸-D4儲備液和1.0mL的泛酸鈣-[13C3，15N]儲備液，放入一個100mL容量瓶中，用50％(W/W)甲醇水溶液稀釋至刻度，配成葉酸-13C5，煙酸-D4和泛酸鈣-[13C3，15N]濃度均為10.0μg/mL的混合內(nèi)標溶液。分別移取0.05mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL和10.0mL的混合標準溶液，分別置于不同的100mL容量瓶中，再向每個容量瓶中加入0.5mL混合內(nèi)標溶液，用50％(W/W)甲醇水溶液定容至刻度，分別配制成葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種物質(zhì)濃度均為0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的系列濃度標準溶液，其中，內(nèi)標物葉酸-13C5，煙酸-D4和泛酸鈣-[13C3，15N]的濃度均為50.0ng/mL。泛酸、生物素的測定都采用泛酸鈣-[13C3，15N]作為內(nèi)標。若樣品濃度超出了系列濃度標準溶液的濃度范圍，可適當擴展溶液濃度的范圍。(3)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析：利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB公司，Qtrap5500)分別對系列濃度標準溶液和提取液檢測分析。其中，30ng/mL標準溶液的色譜圖如圖1所示。其中，液相色譜的操作條件如下：采用WatersAtiantisT3色譜柱，色譜柱的規(guī)格為100mm×3mmi.d.,2.6μm粒徑；色譜柱溫度為30℃；進樣量為10μL；流動相：流動相A為10mmol/L乙酸銨水溶液(其中，甲酸的重量百分數(shù)為0.1％)，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序如表1：表1時刻(分鐘)流動相中流動相A的體積百分數(shù)099％1.099％3.01％4.01％4.199％7結(jié)束流速為0.4mL/min。質(zhì)譜操作條件如下：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：5500V；離子源溫度：550℃；輔助氣Gas1壓力：60psi；輔助氣Gas2壓力：50psi；各分析物的定量離子對、定性離子對及相應的碰撞能(CE)見表2。表2(4)計算樣品中四種維生素含量：根據(jù)(3)中系列濃度標準溶液的檢測結(jié)果，對各標準溶液中葉酸、煙酸、生物素和泛酸的峰面積和其對應內(nèi)標物峰面積的比值(y)和其濃度比值(x)進行線性回歸分析，分別得到葉酸、煙酸、生物素和泛酸的線性回歸方程。將0.5ng/mL標準溶液連續(xù)稀釋，以3倍和10倍信噪比(S/N)來作為分析方法的檢出限和定量限。結(jié)果如表3所示。表3化合物線性方程相關(guān)系數(shù)檢出限(ng/mL)定量限(ng/mL)葉酸y＝0.0299x+0.09280.99970.10.4煙酸y＝0.078x-1.490.99960.030.1生物素y＝0.0279x-0.3770.99940.030.1泛酸y＝0.00999x-0.10.99950.030.1本發(fā)明檢測方法的線性相關(guān)性較好，檢出限為0.03-0.1ng/mL。將由提取液檢測的四種維生素的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值代入表3的線性方程中，分別得到提取液中四種維生素的含量。再通過下式計算得到香精香料樣品中四種維生素的含量。m＝10×(A×S)/n其中，m-香精香料樣品中維生素B的含量(μg/g)；A-提取液中維生素B的含量(μg/mL)；S-提取液體積(mL)；n-香精香料樣品的重量(g)。本實施例的香精香料樣品中，葉酸含量為0.64μg/g，煙酸含量為61.35μg/g，生物素含量為5.28μg/g，泛酸含量為21.07μg/g。實施例2參照實施例1的方法重復測定5次，計算包括實施例1在內(nèi)的6次測定的平均值和相對標準偏差，結(jié)果見表4。表4由表4可知，本發(fā)明方法檢測香精香料樣品中葉酸、煙酸、生物素和泛酸的相對標準偏差均小于6％，其中，檢測煙酸、生物素和泛酸的相對標準偏差小于5％，表明本發(fā)明檢測方法的重復性較好。實施例3向多份同重量的實施例1香精香料樣品中分別加入葉酸、煙酸、生物素和泛酸標準品。每種標準品考察三個加入濃度，每個加入濃度平行測試三次，計算葉酸、煙酸、生物素和泛酸的回收率，結(jié)果見表5-8。表5葉酸回收率*測定方法參照實施例1。表6煙酸回收率*測定方法參照實施例1。表7生物素回收率*測定方法參照實施例1。表8泛酸回收率*測定方法參照實施例1。由表5-8可知，本發(fā)明檢測方法對葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種物質(zhì)的回收率在92.7％-98.7％之間，符合化學檢測的要求。實施例4分別用0.1mol/L的鹽酸水溶液、0.3mol/L的鹽酸水溶液和0.4mol/L的鹽酸水溶液代替制備提取液步驟中的0.2mol/L鹽酸水溶液，其余參照實施例3進行，結(jié)果如圖2所示。圖2表明，鹽酸水溶液濃度為0.1mol/L時，葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種物質(zhì)的回收率比較低；當鹽酸水溶液濃度達到0.4mol/L時，雜質(zhì)干擾較為嚴重；而鹽酸水溶液濃度為0.2-0.3mol/L時，回收率較好，并且，鹽酸水溶液濃度為0.2mol/L時，回收率最佳。對比例1提取溶劑的影響分別用水、0.2mol/L氫氧化鈉溶液、甲醇代替實施例1中0.2mol/L的鹽酸水溶液，其余參照實施例1進行。結(jié)果表明：與實施例1相比，采用水、0.2mol/L氫氧化鈉溶液、甲醇分別作提取溶劑時，檢測信號的強度均較弱，響應值均較低。對比例2不加含乙酸銨的乙腈水溶液的影響采用水代替重量比為1:1的乙腈和水混合形成的溶液(含10mmol/L乙酸銨)進行定容，其余參照實施例1進行。結(jié)果表明：與實施例1相比，對比例2檢測得到的譜圖中雜峰較多，雜質(zhì)干擾較為嚴重。對比例3色譜柱的影響用AgilentKinetexC18色譜柱代替實施例1中的WatersAtiantisT3色譜柱，其余參照實施例1進行。結(jié)果表明：AgilentKinetexC18色譜柱上生物素和泛酸拖尾嚴重。使用AtiantisT3色譜柱保留效果好，儀器響應值較高，能夠很好的滿足實驗要求。對比例4流動相和洗脫程序的影響用如下的流動相和洗脫程序代替實施例1的流動相和梯度洗脫程序，其余參照實施例1進行。流動相A為水，流動相B為乙腈，采用等度洗脫：流動相A和B的體積比始終為1:1，洗脫時間與實施例1相同。結(jié)果表明：與實施例1相比，對比例4檢測得到的譜圖中葉酸、煙酸、生物素和泛酸四種維生素B的峰型拖尾均比較嚴重。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。當前第1頁1 2 3