本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速、無損的茶葉產(chǎn)地鑒定方法。

背景技術(shù)：

茶葉是世界三大飲料作物之一，是人們廣泛使用的保健飲品，近年來，假冒地方特色茶產(chǎn)品的事件時(shí)有發(fā)生，但鑒于同一茶葉品種的外形與加工工藝大致相同，人們難以用感官審評直接識別其產(chǎn)地來源。因此，如何防止閩北水仙等著名品牌茶葉被假冒一直是相關(guān)管理部門及茶葉生產(chǎn)者所關(guān)注的問題，亟須研發(fā)產(chǎn)地溯源與鑒別的方法以保護(hù)產(chǎn)地品牌。

傳統(tǒng)的方法是通過茶葉的色、香、味的不同進(jìn)行判別，這種方法依賴于人們的經(jīng)驗(yàn)，易受主觀因素影響。為了能客觀地對茶葉進(jìn)行分析和鑒別，近年來，采用茶葉香氣指紋圖譜對茶葉進(jìn)行產(chǎn)地溯源已日益為人們所關(guān)注，常用技術(shù)有氣相色譜（gaschromatography，gc）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gaschromatography-massspectrometry，gc-ms），近年來電子鼻法也逐漸運(yùn)用于茶葉產(chǎn)地、等級、年份等判別，但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，gc及gc-ms、電子鼻的分析方法也逐漸暴露出它們在茶葉香氣分析中的局限性，如gc及gc-ms靈敏度低、檢測速度慢、具有破壞性、預(yù)處理過程復(fù)雜等問題，而電子鼻也存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、不能檢測到茶葉具體香氣成分等問題，為克服這些局限性，開發(fā)和驗(yàn)證非破壞性和高度靈敏的方法的是十分必要的。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（protontransferreaction-timeofflight-massspectrometry，ptr-tof-ms）是近年來興起的一種痕量揮發(fā)性有機(jī)物在線檢測技術(shù)，同gc、gc-ms、電子鼻等其他檢測技術(shù)相比，ptr-tof-ms具有檢測時(shí)間短（秒量級）、檢測靈敏度高（ng/l級）、有機(jī)物電離為單一離子，極少碎片離子，易于質(zhì)譜識別、絕對量測定，無需樣品預(yù)處理、超高分辨率，可以區(qū)分分子量極其接近的化合物等優(yōu)勢。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大氣環(huán)境污染監(jiān)測、醫(yī)學(xué)診斷、植物代謝、公共安全（爆炸、化學(xué)武器的使用）、食品成分和質(zhì)量檢驗(yàn)、產(chǎn)品分類和原產(chǎn)地判別等領(lǐng)域?qū)哿坑袡C(jī)物的檢測。如piotrmarekku等采用ptr-ms直接檢測蜂蜜樣品的揮發(fā)性化合物，成功區(qū)分了六種不同花香源的蜂蜜樣品。valentinaacierno等采用ptr-tof-ms對巧克力樣品進(jìn)行檢測，對不同可可豆的植物、不同產(chǎn)地、不同品牌的巧克力的揮發(fā)性有機(jī)化合物的成分進(jìn)行了研究，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法成功實(shí)現(xiàn)巧克力樣品的品種、產(chǎn)地、品牌的溯源。但將ptr-tof-ms應(yīng)用于茶葉分析的文章僅見由sineyener等采用ptr-tof-ms檢測來自4個(gè)不同國家的綠茶和紅茶干茶和茶湯的香氣成分，并利用其香氣指紋圖譜結(jié)合pca分析成功區(qū)分綠茶和紅茶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、無損的茶葉產(chǎn)地鑒定方法，其具有分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、對茶葉樣品無損傷等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地茶葉的快速鑒定。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種快速、無損的茶葉產(chǎn)地鑒定方法，其是以若干不同產(chǎn)地來源的茶葉為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用ptr-tof-ms對其進(jìn)行分析，然后對獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，建立不同產(chǎn)地來源茶葉的特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，再結(jié)合k最近鄰分類算法或偏最小二乘判別分析法進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，建立識別模型，用于待測茶葉的產(chǎn)地鑒定；其具體包括以下步驟：

1）取10份以上不同產(chǎn)地來源的干茶各3g，放入頂空瓶中，70℃恒溫水浴5min，然后將玻璃瓶體與ptr-tof-ms的進(jìn)樣口瓶蓋相連接，采用ptr-tof-ms進(jìn)行頂空進(jìn)樣分析，獲得不同產(chǎn)地茶葉的香氣成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，包括各離子峰的質(zhì)荷比及相應(yīng)的質(zhì)量峰強(qiáng)度；

2）以各離子峰的質(zhì)荷比的整數(shù)值為自變量，質(zhì)量峰強(qiáng)度為因變量進(jìn)行主成分分析，建立特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，以獲得不同產(chǎn)地茶葉的分區(qū)；

3）采用k最近鄰分類算法或偏最小二乘判別分析法對特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，建立識別模型；

4）將待測茶葉樣品按步驟1）進(jìn)行處理后，根據(jù)特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫提取待測樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再采用k最近鄰分類算法或偏最小二乘判別分析法進(jìn)行模式識別，從而確定待測樣品的產(chǎn)地。

其中，ptr-tof-ms的分析條件為：漂移管電壓640v，漂移管溫度60℃，漂移管壓力225pa，電場強(qiáng)度e/n140td，漂移管中氣體流量40pa×m³/s，掃描范圍為m/z13-500。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次利用ptr-tof-ms技術(shù)結(jié)合k最近鄰分類算法或偏最小二乘判別分析法的分類模式，建立了一種茶葉產(chǎn)地的鑒別方法，其具有分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、對茶葉樣品無損傷等優(yōu)點(diǎn)，適用于閩北水仙、西湖龍井、武夷大紅袍、福鼎白茶等具地方特色茶產(chǎn)品的不同產(chǎn)地鑒別，其正確率可達(dá)95%以上，且樣品無需預(yù)處理，為茶葉產(chǎn)地溯源提供了新方法。

附圖說明

圖1為不同產(chǎn)地閩北水仙香氣成分的典型質(zhì)譜圖，其中a為空氣，b為武夷水仙，c為建陽水仙，d為建甌水仙。

圖2為校正集閩北水仙經(jīng)pca分析的質(zhì)譜矩陣得分圖。

具體實(shí)施方式

閩北水仙是福建省的著名地方特色茶產(chǎn)品，根據(jù)產(chǎn)地分為武夷水仙、建陽水仙和建甌水仙。為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面以“閩北水仙”對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜（ptr-tof-ms1000）(奧地利ionicon有限公司)，el104型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

樣品采集

依照gb/t30357.4-2015“烏龍茶第四部分：水仙”采集2015年春茶113個(gè)樣品，分別為武夷水仙33個(gè)，編號為：y1t1、y1t2、y1t3、y101~y130；建陽水仙40個(gè)，編號為：201~240；建甌水仙40個(gè)，編號為：401~440，作為校正集；另依照上述標(biāo)準(zhǔn)在市場購買閩北水仙樣品75個(gè)（武夷水仙、建陽水仙、建甌水仙各25個(gè)）作為預(yù)測集（樣品信息詳見表1）。

樣品用復(fù)合鋁箔袋密封，保存于25℃的樣品儲藏室中待用。

表1供試樣品信息

2實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取3g的干茶樣品（未經(jīng)過任何前處理），于60ml的頂空瓶中，在70℃恒溫水浴鍋中水浴5min，使頂空瓶上部香氣揮發(fā)物保持平衡后，將玻璃瓶體與ptr-tof-ms的進(jìn)樣口瓶蓋相連接，讓其香氣揮發(fā)物漂移至ptr-tof-ms儀器進(jìn)行檢測。

儀器條件設(shè)置如下：ptr-tof-ms的漂移管電壓640v，漂移管溫度60℃，漂移管壓力225pa，電場強(qiáng)度e/n140td（1td=10^-17v·cm^-2），漂移管中氣體流量40pa×m³/s，掃描范圍為m/z13-500。每個(gè)樣品以每秒一張全譜圖的采集速率測量30秒，測量順序隨機(jī)。每個(gè)樣品連續(xù)掃描5次，取中間3次掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到樣品平均值。另取一空瓶，在相同的條件下連續(xù)掃描5次，取后3次掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得空白平均值。樣品平均值減去空白平均值即得到ptr-tof-ms的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析

茶葉樣品直接頂空進(jìn)樣分析得到的數(shù)據(jù)集減去空白小瓶的數(shù)據(jù)集后，共檢測得到495個(gè)質(zhì)量峰，范圍在m/z13-495內(nèi)。在消除干擾離子（o2⁺，no⁺和水族離子）及其同位素之后，對剩余的438個(gè)質(zhì)量峰進(jìn)行進(jìn)一步分析和初步識別。

采用spss21.0軟件(ibmspssstatistics)進(jìn)行方差分析，計(jì)算不同產(chǎn)地閩北水仙茶香氣差異。運(yùn)用chemmindpattern2017進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)、軟獨(dú)立建模分類法（softindependentmodelingclassanalogy，simca）、k最鄰近結(jié)點(diǎn)算法(k-nearestneighbors，knn)、偏最小二乘判別分析(partialleastsquares-discriminantanalysis，pls-da)進(jìn)行建模及模式識別。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1不同產(chǎn)地閩北水仙的香氣成分分析

采集的3個(gè)不同產(chǎn)地(武夷山、建陽、建甌)閩北水仙香氣成分的典型質(zhì)譜圖如圖1所示（其中a為空氣，b為武夷水仙，c為建陽水仙，d為建甌水仙）。由圖1可見，不同產(chǎn)地閩北水仙的ptr-tof-ms譜圖既有相同之處，也有明顯的差異。在所有譜圖中，m/z13～150之間產(chǎn)生的質(zhì)譜峰較多，在m/z＞200處，質(zhì)譜峰較少，說明閩北水仙中所含質(zhì)荷比在m/z13～150之間的香氣成分居多。

在ptr-tof-ms分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過對檢測獲得的精確離子質(zhì)量、信號強(qiáng)度、實(shí)際成分等方面進(jìn)行比較，進(jìn)一步對閩北水仙主要香氣成分進(jìn)行初步鑒定，其中，化合物定性相對明確且在茶葉中常見的、相對含量排名在前40名的香氣成分的質(zhì)荷比檢測值與理論值、主要含量等情況見表2。

表2不同產(chǎn)地閩北水仙的主要香氣成分情況表

由表2可見，雖然上述40種香氣成分在武夷山、建陽、建甌3個(gè)產(chǎn)地的閩北水仙茶樣中均被檢測到，但差別較大（特別是含量較高的組分），40個(gè)香氣化合物中共有37個(gè)化合物具有極顯著差異(p<0.01)，說明不同產(chǎn)地的閩北水仙在香氣成分含量上具有極顯著的差異。

4.2基于ptr-tof-ms的閩北水仙茶產(chǎn)地識別

4.2.1不同產(chǎn)地閩北水仙茶的pca（主成分）分析

以m/z整數(shù)值為自變量，質(zhì)量峰強(qiáng)度為因變量，利用chemmindpattern2017軟件對采集的武夷山、建陽、建甌3個(gè)不同產(chǎn)地的113個(gè)閩北水仙樣品的香氣成分進(jìn)行pca分析。

圖2為校正集閩北水仙的質(zhì)譜矩陣得分圖，其中，pc1、pc2和pc3分別代表了變量總方差的70.4%、8.1%和6.1%，累積方差貢獻(xiàn)率約84.661％，空間上的投影得分值就是空間坐標(biāo)，能夠直觀地反映樣本間的相似或差異性。由圖2可見，3個(gè)產(chǎn)地的茶葉基本可以分開，其中建陽水仙與建甌水仙相近，有些許重疊。

4.2.2不同產(chǎn)地閩北水仙茶的分類模式識別

分別選用軟獨(dú)立建模分類法（simca）、k最近鄰分類算法（knn）、偏最小二乘法判別分析（pls-da）對采集的3個(gè)不同產(chǎn)地的閩北水仙進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，建立其識別模型，其結(jié)果見表3。

表3校正集閩北水仙香氣成分的simca、knn及pls-da判別統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表3可知，在simca法中，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)是3時(shí)，有3個(gè)武夷水仙被錯判為建甌水仙，5個(gè)武夷水仙未識別、1個(gè)建陽水仙未被識別、3個(gè)建甌水仙未被識別，校正集判別正確率達(dá)89.38%；在knn模式中，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為3，k為1的時(shí)候，校正集判別正確率達(dá)到100%；pls-da模式中，同樣提取前3個(gè)主成分建立模型，校正集判別正確率達(dá)到了100%。

進(jìn)一步地，分別選用simca、knn、pls-da對購買的3個(gè)不同產(chǎn)地的閩北水仙進(jìn)行模式分析，其結(jié)果見表4。

表4預(yù)測集閩北水仙香氣成分的simca、knn及pls-da判別結(jié)果

由表4可見，在simca法中，預(yù)測集的判別正確率達(dá)83.18%；在knn模式中，預(yù)測集的判別正確率為96.46%；在pls-da模式中，預(yù)測集的判別正確率達(dá)到95.57%。

綜上可見，三個(gè)模型的校正集判別正確率均達(dá)到了85%以上，預(yù)測集的判別正確率均達(dá)到80%以上，其中knn識別模式及pls-da的判別準(zhǔn)確率較高，說明其具有較好的實(shí)際預(yù)測效果和應(yīng)用價(jià)值。

上述結(jié)果表明，采用ptr-tof-ms結(jié)合k最近鄰分類算法或偏最小二乘判別分析法可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地茶葉樣品。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。