本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域,具體涉及多肽藥物的分離分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：醋酸格拉替雷(glatirameracetate，縮寫為ga)是一種人工合成多肽類混合物(相對分子量：4700-11000道爾頓)，由l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-酪氨酸和l-賴氨酸四個氨基酸所組成的隨機(jī)聚合物，長為45-100個氨基酸。各氨基酸摩爾比大約為0.392-0.462，0.129-0.153，0.086-0.100，0.300-0.374。該藥物由以色列藥廠梯瓦制藥(teva)所研發(fā)制造，商品名為于1996年獲美國fda核準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥，目前有注射用水針和注射用凍干粉針兩種產(chǎn)品，均用于皮下注射。醋酸格拉替雷是一個連續(xù)性很強(qiáng)的共聚物，其結(jié)構(gòu)如下式所示：(glu，ala，lys，tyr)x·xch3cooh(c5h9no4·c3h7no2·c6h14n2o2·c9h11no3)x·xc2h4o2cas-147245-92-9對于仿制該藥廠商，只能基于該藥的一些固有性質(zhì)來考察仿制醋酸格拉替雷與原研制劑醋酸格拉替雷的組分差異。利拉魯肽(liraglutide)(商品名victoza)novenordisk1996年開始研發(fā)，2009年最早于丹麥上市的人glp-1(7-37)的修飾物。從結(jié)構(gòu)上看liraglutide為glp-1(7-37)鏈上34位lys被arg取代，在26位的lys上接入經(jīng)十六烷酸修飾的谷氨酰胺。glp-1經(jīng)脂肪連修飾后的，增加了與白蛋白之間的親和力，從而降低了被dpp‐ⅳ的水解速率和腎清除率，延長生物半衰期。liraglutide的生物半衰期達(dá)11～15h，每天只需給藥一次皮下注射，大大提高了患者的順應(yīng)性。毛細(xì)管等電聚焦(cief)是近年來基于平板等電聚焦和毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展而來的分析方法，它利用毛細(xì)管中灌注的一系列不同等電點的兩性電解質(zhì)混合物在電場下形成的ph梯度，根據(jù)多肽或其他待分析物等電點的差異對其進(jìn)行分離，其分離精度可達(dá)到0.1個ph單位，并克服了平板等電聚焦操作復(fù)雜、無法實現(xiàn)自動化、無法準(zhǔn)確測定電荷異質(zhì)體含量等缺點，因而被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體藥物的等電點測定和電荷異質(zhì)體含量分析。與離子交換色譜相比，毛細(xì)管等電聚焦具有分析時間短、樣品消耗量小、通用性強(qiáng)等優(yōu)勢，其單個樣品分析時間通常是離子交換色譜的1/4，單次測試樣品消耗量通常是離子交換色譜的1/10左右，且對一些電荷異質(zhì)性較為復(fù)雜的樣品如融合蛋白、多肽混合物樣品具有更好的分離效果。盡管毛細(xì)管等電聚焦已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單抗藥物的質(zhì)量分析，但其應(yīng)用于多肽混合物藥物一致性評價分析還未見報道。本發(fā)明基于本品各組分間等電點的差異，采用毛細(xì)管等電聚焦電泳對其進(jìn)行分析，對比多肽的帶電差異，進(jìn)而分析多肽藥物的一致性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速測定多肽聚合物成分和差異的分析方法。該方法具有通用性強(qiáng)、分析周期短、數(shù)據(jù)處理簡單等優(yōu)點，而且適用于多肽聚合物的生產(chǎn)工藝開發(fā)和質(zhì)量控制。一方面，本發(fā)明提供了一種多肽聚合物的分析方法，其特征在于采用毛細(xì)管等電聚焦方法，包括以下步驟：1)配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，所述上樣液為包括兩性電解質(zhì)、凝膠液、等電點標(biāo)記物與待分析的多肽聚合物的混合液；2)將步驟1)的上樣液上樣于毛細(xì)管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～25min，在10～40kv遷移20～50min；并通過毛細(xì)管等電聚焦儀或毛細(xì)管電泳儀檢測，得到等電聚焦譜圖；3)通過等電點標(biāo)記物計算出多肽混合物各組分的等電點，通過各組分等電點數(shù)值；4)采用步驟1)-3)相同條件對多肽聚合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的各組分等電點數(shù)值與各組分峰型進(jìn)行對照。進(jìn)一步地，所述凝膠液選自甲基纖維素、尿素、羥丙基甲基纖維素、甘油、蔗糖、精氨酸、亞氨基二乙酸中的一種或多種的混合物。進(jìn)一步地，所述兩性電解質(zhì)載體選自pharmalyte2.5-5、pharmalyte3-10、pharmalyte4-6.5、pharmalyte4.2-4.9、pharmalyte4.5-5.4、pharmalyte5-6、pharmalyte5-8、pharmalyte6.7-7.7、pharmalyte8-10.5、servalyt2-4、servalyt2-9、servalyt2-11、servalyt3-4、servalyt3-5、servalyt3-6、servalyt3-7、servalyt3-10、servalyt4-5、servalyt4-6、servalyt4-7、servalyt4-9、servalyt5-6、servalyt5-7、servalyt5-8、servalyt5-9、servalyt6-7、servalyt6-8、servalyt6-9、servalyt7-9、servalyt9-11中的一種或多種的混合物(優(yōu)選為pharmalyte8-10.5與另一種兩性電解質(zhì)載體的混合物，更優(yōu)選二者的比例為1:0.5-2)；兩性載體在上樣液中的體積范圍為1％-10％。進(jìn)一步地，步驟2)中是以20-40kv下聚焦9-20min，優(yōu)選是以25-30kv下聚焦9-15min。進(jìn)一步地，步驟2)中是在30-40kv下遷移40-50min，優(yōu)選是在30kv下遷移40-45min。進(jìn)一步地，所述上樣液中包含三種以上等電點標(biāo)記物。進(jìn)一步地，所述多肽聚合物選自醋酸格拉替雷、利拉魯肽、杜拉魯肽、普蘭林肽等。本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多肽聚合物藥物質(zhì)量檢測方法，其包括以下步驟：1)配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，所述上樣液為包括兩性電解質(zhì)、凝膠液、等電點標(biāo)記物與待分析的多肽聚合物樣品的混合液；2)將步驟1)的上樣液上樣于毛細(xì)管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～25min，在10～40kv遷移20～50min；并通過毛細(xì)管等電聚焦儀或毛細(xì)管電泳儀檢測，得到等電聚焦譜圖；3)通過等電點標(biāo)記物計算出多肽混合物各組分的等電點，通過各組分等電點數(shù)值與各組分的峰型考察峰型也需要考察。；4)采用步驟1)-3)相同條件對多肽聚合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的各組分等電點數(shù)值與各組分峰型進(jìn)行對照。具體地，采用毛細(xì)管等電聚焦電泳對醋酸格拉替雷各組分和杜拉魯肽各組分的帶電情況進(jìn)行分離分析，并判斷試制樣品與市售商品制劑(標(biāo)準(zhǔn)品)的差異。采用毛細(xì)管等電聚焦分離多肽藥物(如醋酸格拉替雷、利拉魯肽)包括如下步驟：1)將兩性電解質(zhì)、cief凝膠液、等電點標(biāo)記物與待分析的多肽混合物樣品進(jìn)行混合，形成混合液；其中，凝膠液組成包括：甲基纖維素、尿素、羥丙基甲基纖維素、甘油、蔗糖、精氨酸、亞氨基二乙酸中的一種或多種，可使用自制凝膠液或商品化產(chǎn)品；2)將步驟1)的混合液上樣于毛細(xì)管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～15min，在10～40kv遷移20～50min；并通過毛細(xì)管等電聚焦儀或毛細(xì)管電泳儀檢測，得到等電聚焦譜圖；3)通過等電點標(biāo)記物計算出多肽混合物各組分的等電點，通過各組分等電點數(shù)值與各組分的峰型考察試制樣品與市售商品制劑(標(biāo)準(zhǔn)品)的差異。所述步驟1)中，兩性電解質(zhì)載體包括pharmalyte3-10、pharmalyte4-6.5、pharmalyte8-10.5中的一種或多種；兩性載體在混合液中的體積范圍為1％～10％；等電點標(biāo)記物，包括：sigma公司提供的小分子等電點標(biāo)記物、beckman公司提供的小分子等電點標(biāo)記物或蛋白等電點標(biāo)記物；其中sigma公司提供的小分子等電點標(biāo)記物(小分子標(biāo)記物系列)包括：pi10.4、pi9.0、pi8.4等；beckman公司提供的小分子等電點標(biāo)記物(小分子標(biāo)記物系列)包括：pi10.0、pi9.5、pi7.0、pi5.5pi4.1；混合液中通常包含三種或以上等電點標(biāo)記物，用于計算所測樣品各組分等電點。待分析的多肽混合物樣品包括：試制品或?qū)φ掌?；其中，待分析的多肽混合物樣品在混合液中的濃度范圍?.1～5mg/ml。所述步驟2)中，毛細(xì)管柱包括：agilent公司的氟涂層(fc)毛細(xì)管組件或ht毛細(xì)管組件，或beckman公司的ecap中性毛細(xì)管，或其他帶有適當(dāng)涂層的毛細(xì)管。所使用的毛細(xì)管總長范圍在30～40cm之間(柱有效長度為柱總長減去8.5cm)，柱內(nèi)徑可選用25～75μm。本發(fā)明毛細(xì)管電泳的電極電壓為10～50kv，優(yōu)選可為20～40kv。本發(fā)明所述方法的毛細(xì)管電泳采用高壓進(jìn)樣，壓力范圍為1～5bar，時間范圍為50～150s。優(yōu)選進(jìn)樣壓力范圍為2～3bar，時間范圍為70～100s；本發(fā)明所使用的柱溫范圍為10～30℃，優(yōu)選為15～25℃；本發(fā)明所使用檢測波長優(yōu)選為280nm。有益效果采用本發(fā)明的方法能夠快速，準(zhǔn)確判斷兩種多肽聚合物的成分是否相同。用樣量少，速度快，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確性高。附圖說明下面結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：附圖1為實施例1分析條件分析原研品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖2為實施例1分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖3為實施例2分析條件分析原研品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖4為實施例2分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖5為實施例3分析條件分析原研品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖6為實施例3分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖7為實施例4分析條件分析原研品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖8為實施例4分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖9為實施例5分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖10為實施例5分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖11為實施例5分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。附圖12為實施例5分析條件分析試制品的毛細(xì)管等電聚焦結(jié)果譜圖。具體實施方式實施例1：根據(jù)表1組成配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，置于agilent7100毛細(xì)管等電聚焦儀的自動進(jìn)樣器中，采用氟涂層毛細(xì)管組件(agilent/194-8111)對樣品進(jìn)行分析，兩端到檢測器窗口的距離分別是8.5cm和24.5cm。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)配有外部水浴，溫度設(shè)置為15℃。采用2bar高壓進(jìn)樣100s，15℃下，25kv聚焦9min，陽極電解液為200mm磷酸，陰極電解液為300mm氫氧化鈉。遷移條件為：30kv遷移45min。在280nm下進(jìn)行檢測，采用openlabcontrolpanel軟件對所測樣品等電點進(jìn)行計算。試制樣品與對照品各組分的等電點見表2，試制樣品與對照品的電泳圖譜見附圖1，附圖2。表1毛細(xì)管等電聚焦上樣液配比試劑名稱用量0.5％甲基纖維素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(3-10)6μl500mml-精氨酸10μl200mm亞氨基二乙酸5μl等電點混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl表2是對比11批原研品與4批試制樣品主組分等電點數(shù)據(jù)批號pi范圍原研品批次110.197-9.642原研品批次210.176-9.699原研品批次310.164-9.697原研品批次410.194-9.650原研品批次510.181-9.658原研品批次610.195-9.655原研品批次710.183-9.661原研品批次810.196-9.656原研品批次910.181-9.633原研品批次1010.203-9.654原研品批次1110.190-9.639試制品批次110.203-9.635試制品批次210.197-9.6845試制品批次310.176-9.688試制品批次410.160-9.626實施例2：根據(jù)表3組成配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，置于agilent7100毛細(xì)管等電聚焦儀的自動進(jìn)樣器中，采用氟涂層毛細(xì)管組件(agilent/194-8111)對樣品進(jìn)行分析，兩端到檢測器窗口的距離分別是8.5cm和24.5cm。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)配有外部水浴，溫度設(shè)置為15℃。采用2.5bar高壓進(jìn)樣80s，15℃下，30kv聚焦15min，陽極電解液為200mm磷酸，陰極電解液為300mm氫氧化鈉。遷移條件為：30kv遷移40min。在280nm下進(jìn)行檢測，采用openlabcontrolpanel軟件對所測樣品等電點進(jìn)行計算。試制樣品與對照品的電泳圖譜見附圖3，附圖4。表3毛細(xì)管等電聚焦上樣液配比試劑名稱用量0.5％甲基纖維素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(8-10.5)6μl500mml-精氨酸10μl200mm亞氨基二乙酸5μl等電點混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl實施例3：根據(jù)表4組成配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，置于agilent7100毛細(xì)管等電聚焦儀的自動進(jìn)樣器中，采用氟涂層毛細(xì)管組件(agilent/194-8111)對樣品進(jìn)行分析，兩端到檢測器窗口的距離分別是8.5cm和24.5cm。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)配有外部水浴，溫度設(shè)置為15℃。采用2.5bar高壓進(jìn)樣80s，15℃下，30kv聚焦15min，陽極電解液為200mm磷酸，陰極電解液為300mm氫氧化鈉。遷移條件為：30kv遷移40min。在280nm下進(jìn)行檢測，采用openlabcontrolpanel軟件對所測樣品等電點進(jìn)行計算。試制樣品與對照品的電泳圖譜見附圖5，附圖6。表4毛細(xì)管等電聚焦上樣液配比試劑名稱用量0.5％甲基纖維素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(8-10.5)：(3-10)是1:16μl500mml-精氨酸10μl200mm亞氨基二乙酸5μl等電點混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl實施例4：根據(jù)表5組成配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，置于agilent7100毛細(xì)管等電聚焦儀的自動進(jìn)樣器中，采用氟涂層毛細(xì)管組件(agilent/194-8111)對樣品進(jìn)行分析，兩端到檢測器窗口的距離分別是8.5cm和24.5cm。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)配有外部水浴，溫度設(shè)置為20℃。采用2bar高壓進(jìn)樣100s，20℃下，10kv聚焦8min，陽極電解液為200mm磷酸，陰極電解液為300mm氫氧化鈉。遷移條件為：30kv遷移35min。在280nm下進(jìn)行檢測，采用openlabcontrolpanel軟件對所測樣品等電點進(jìn)行計算。對照品與自制品的電泳圖譜見附圖7、附圖8。表5毛細(xì)管等電聚焦上樣液配比試劑名稱用量1％甲基纖維素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(4-6.5)3μl500mml-精氨酸4.5μl200mm亞氨基二乙酸5μl等電點混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl實施例5：根據(jù)表6組成配制毛細(xì)管等電聚焦上樣液，置于agilent7100毛細(xì)管等電聚焦儀的自動進(jìn)樣器中，采用氟涂層毛細(xì)管組件(agilent/194-8111)對樣品進(jìn)行分析，兩端到檢測器窗口的距離分別是8.5cm和24.5cm。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)配有外部水浴，溫度設(shè)置為20℃。采用2bar高壓進(jìn)樣100s，20℃下，30kv聚焦11min，陽極電解液為200mm磷酸，陰極電解液為300mm氫氧化鈉。遷移條件為：30kv遷移45min。在280nm下進(jìn)行檢測，采用openlabcontrolpanel軟件對所測樣品等電點進(jìn)行計算。利拉魯肽對照品與自制品及各自光照處理樣品的電泳圖譜見附圖9、附圖10、附圖11、附圖12。表6毛細(xì)管等電聚焦上樣液配比試劑名稱用量1％甲基纖維素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(4-6.5)3μl500mml-精氨酸4.5μl200mm亞氨基二乙酸5μl等電點混合物3μl利拉魯肽(2-3mg/ml)20μl由以上實施例可知，本發(fā)明用于分析醋酸格拉替雷、利拉魯肽樣本中各個組分的帶電情況的方法是有效可行的，可以用于上述藥物的對比分析與質(zhì)量一致性研究。當(dāng)前第1頁12