專利名稱：基于陣列毛細(xì)管等電聚焦的多維色譜-電泳分離與檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于復(fù)雜蛋白樣品的高效快速多維色譜-電泳分離與檢測(cè)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
多維色譜/電泳分離是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型的蛋白組學(xué)研究方法。它將兩種分離機(jī)理正交的色譜模式組合起來(lái)，經(jīng)過(guò)前一維分離，所有組分進(jìn)入下一維，在前一維未完全分離的樣品進(jìn)一步得到分離。其分辨能力大大高于單維色譜或電泳。
反相液相色譜(RPLC)和毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)是兩種高分辨率的生物樣品分離模式，其分離機(jī)理正交。RPLC是一種最常用的分離模式，在梯度條件下能承受較高的進(jìn)樣量而不會(huì)引起明顯的峰展寬，適合作為第一維分離。CIEF能分辨pI值相差0.005pH單位的蛋白，且分離過(guò)程中的聚焦效應(yīng)能使樣品濃縮幾個(gè)數(shù)量級(jí)，十分適合作為第二維，以便補(bǔ)償?shù)谝痪S分離時(shí)不可避免的樣品稀釋。LIF(激光誘導(dǎo)熒光)是高靈敏的檢測(cè)方式，在某些情況下甚至能進(jìn)行單分子檢測(cè)，樣品中的低濃度組分也能得到有效的檢測(cè)。
一般來(lái)說(shuō)多維色譜分離的第二維是單通道分離，分析通量較低，分離時(shí)間較長(zhǎng)。而對(duì)于在線系統(tǒng)，為避免組分損失，前一維的每個(gè)流出峰必須被下一維至少采樣三次，所以下一維的分離速度要足夠快才能跟上前一維的流出速度。這樣下一維的分辨率由于速度的限制不可能很高，整個(gè)多維系統(tǒng)的分辨率也會(huì)相應(yīng)受到影響。
下一維采用陣列的形式是一個(gè)很好的解決方法，可以同時(shí)分離前一維的餾分，快速且重現(xiàn)性好。陣列的檢測(cè)一般用單點(diǎn)檢測(cè)，全柱成像檢測(cè)(WCID)更適合于CIEF，樣品聚焦后在原位得到檢測(cè)，分離速度、分辨率和重現(xiàn)性都優(yōu)于單點(diǎn)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種多維色譜-電泳分離與檢測(cè)系統(tǒng)，將兩種或多種高分辨的分離模式結(jié)合起來(lái)，配合高靈敏的檢測(cè)器和高通量的毛細(xì)管陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)高度復(fù)雜的生物樣品進(jìn)行高效、快速和靈敏的分離鑒定。
本發(fā)明提出的多維色譜-電泳分離與檢測(cè)系統(tǒng)，由RPLC、CIEF和WCID-LIF陣列檢測(cè)器組成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，RPLC為第一維分離，CIEF采用陣列形式，作為第二維分離；WCID-LIF陣列探測(cè)器由激光器、激光化線器、平移臺(tái)、CCD相機(jī)、濾光片等部件組成。毛細(xì)管陣列中央4～8cm長(zhǎng)度的毛細(xì)管除去聚酰亞胺涂層作為檢測(cè)窗，檢測(cè)窗的兩端(用快干膠)固定在絕緣材料基片上，基片固定在平移臺(tái)上?；峡逃?個(gè)凹槽(快干膠就涂在凹槽的四周)。每根毛細(xì)管在凹槽處均折斷，折斷處覆蓋導(dǎo)電薄膜(如多孔聚合物薄膜)，能使小分子或離子通過(guò)而導(dǎo)電，當(dāng)向毛細(xì)管中導(dǎo)入樣品時(shí)，樣品又不會(huì)從薄膜處漏出。這兩個(gè)凹槽就作為加電解液和高壓的電連接處。激光束通過(guò)激光化線器成為一條能量均衡的直線以一定的傾角垂直照射在檢測(cè)窗。電泳聚焦結(jié)束后，激光線掃過(guò)陣列的檢測(cè)窗。
本發(fā)明中，在RPLC前還可加上其它機(jī)理正交的色譜模式(如離子交換)即成為三維系統(tǒng)。CIEF也可方便地與質(zhì)譜在線連接。
檢測(cè)系統(tǒng)WCID-LIF是快速、高靈敏的陣列檢測(cè)器。使用本系統(tǒng)時(shí)，樣品首先進(jìn)入RPLC進(jìn)行初步分離，根據(jù)梯度時(shí)間和分離情況決定截取餾分的數(shù)目，RPLC的餾分加上兩性電解質(zhì)以在線或離線的方式進(jìn)入毛細(xì)管陣列進(jìn)行第二維分離，樣品在陣列中進(jìn)行10分鐘左右聚焦，由于毛細(xì)管陣列的內(nèi)壁涂層消除了電滲流，樣品組分聚焦在其pI點(diǎn)處，基本不發(fā)生位移。
電泳聚焦結(jié)束以后，平移臺(tái)以一定速度移動(dòng)，使激光線掃過(guò)陣列的檢測(cè)窗，檢測(cè)窗中的蛋白區(qū)帶在激光的激發(fā)下發(fā)出熒光，CCD收集陣列中的熒光信號(hào)，得到全柱成像的二維分離圖，各熒光信號(hào)點(diǎn)的強(qiáng)弱與各組分量成正比。
本發(fā)明的多維分離檢測(cè)系統(tǒng)，其分離模式的組合及檢測(cè)方法均不同于其他多維色譜-電泳。在設(shè)計(jì)上采用以下幾個(gè)獨(dú)創(chuàng)之處1、CIEF陣列的采用在第二維使用毛細(xì)管陣列，不僅提高了分離通量，而且使得第二維的分離時(shí)間不再受前一維的限制，能夠更大限度地發(fā)揮CIEF的高分辨率。
2、掃描式全柱成像檢測(cè)CIEF的全柱成像檢測(cè)技術(shù)其分辨率和重現(xiàn)性均優(yōu)于單點(diǎn)檢測(cè)。以往的WCID主要用于單根毛細(xì)管，本設(shè)計(jì)中對(duì)毛細(xì)管陣列也同樣實(shí)現(xiàn)了全柱成像檢測(cè)，激光線首先照射每根毛細(xì)管的一個(gè)點(diǎn)，而后掃過(guò)毛細(xì)管的檢測(cè)區(qū)域。激光的強(qiáng)度優(yōu)于其他光源，因而靈敏度也高，采用掃描的方法即可激發(fā)整個(gè)陣列中的熒光樣品。
3、激光化線器的使用化線器能使激光束化為能量均衡的激光線，而傳統(tǒng)的圓柱形透鏡將激光束變成能量高斯分布的直線。
4、多孔聚合物薄膜的電連接CIEF的進(jìn)樣方式不同于其他電泳模式，一般不采用電遷移或重力進(jìn)樣，而是使全柱充滿樣品。在本設(shè)計(jì)中CIEF陣列的檢測(cè)采用全柱成像，檢測(cè)長(zhǎng)度一般是幾個(gè)厘米，且外壁涂層已除去，這種情況下進(jìn)樣比較困難。本系統(tǒng)采用較長(zhǎng)的毛細(xì)管以便于進(jìn)樣，而在毛細(xì)管的中間制作兩個(gè)電連接便于聚焦和檢測(cè)，這樣樣品組分基本不會(huì)損失。
綜上所述，本發(fā)明獲得了以下優(yōu)良效果1.CIEF的聚焦效果對(duì)樣品中的低濃度成分也能有效檢出。
2.毛細(xì)管陣列CIEF，分析時(shí)間大大縮短，重現(xiàn)性提高。
3.掃描式全柱成像檢測(cè)，進(jìn)一步提高了CIEF的分辨率和重現(xiàn)性4.分離區(qū)域(加高壓區(qū)域)兩端的電連接既方便了樣品的導(dǎo)入，又不損失樣品組分。
5.能量均衡的激光線更適合于毛細(xì)管陣列檢測(cè)，尤其是在需要定量的時(shí)候。


圖1是本發(fā)明的RPLC/CIEF陣列/WCID-LIF多維分離檢測(cè)系統(tǒng)示意圖。
圖2是絕緣材料基片的凹槽處的剖面圖。
圖中標(biāo)號(hào)1是RPLC泵，2是CIEF在線或離線的進(jìn)樣處，3是激光化線器，4是CCD相機(jī)，5是電動(dòng)平移臺(tái)，6是激光束，7是兩性電解質(zhì)，8是凹槽，9是檢測(cè)窗，10是毛細(xì)管陣列，11是濾光片，12是激光線，13是快干膠，14是電解液，15是塑料基片，16是導(dǎo)電薄膜，17是盛放電解液的圍欄，18是毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)電連接的折斷處。
具體實(shí)施例方式
1、RPLC一般采用250μm的毛細(xì)管，流速2μl/min。根據(jù)樣品情況和梯度時(shí)間決定截取餾分的數(shù)目和間隔。
2、數(shù)十根(一般為40-100根)長(zhǎng)為20.0cm、內(nèi)徑75μm的石英毛細(xì)管在中央部位除去4～8cm(例如6cm)外壁涂層作為檢測(cè)窗，在檢測(cè)窗的兩端各刻上劃痕，但不折斷。用快干膠將毛細(xì)管固定于絕緣材料基片的兩個(gè)凹槽處，快干膠涂于凹槽四周。再于凹槽上固定一個(gè)塑料圍欄和鉑絲，以便于盛放電解液和加高壓。
3、毛細(xì)管固定好以后，在每個(gè)劃痕處輕輕折斷，折斷處覆蓋一層多孔聚合物薄膜(如醋酸纖維素膜)。
4、RPLC的餾分與兩性電解質(zhì)混合后，由毛細(xì)管的端口導(dǎo)入，進(jìn)樣后，加上500V/cm的電泳電壓，陰極電解液是20mM的NaOH，陽(yáng)極電解液是80mM的H3PO4。電泳聚焦時(shí)間是10分鐘5、打開(kāi)激光器，調(diào)整激光化線器的位置和角度，使所產(chǎn)生的激光線的長(zhǎng)度和位置符合實(shí)驗(yàn)要求。
6、聚焦結(jié)束后，打開(kāi)電動(dòng)平移臺(tái)，使激光線從6cm檢測(cè)窗的一端掃向另一端，CCD在掃描時(shí)間內(nèi)收集熒光信號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種多維色譜-電泳分離和檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于由反相液相色譜、毛細(xì)管等電聚焦和全柱成像激光誘導(dǎo)熒光陣列檢測(cè)器組成，其中，反相液相色譜為第一維分離，毛細(xì)管等電聚焦采用陣列形式，作為第二維分離；全柱成像-激光誘導(dǎo)熒光陣列檢測(cè)器由激光器、激光線化器、平移臺(tái)、CCD相機(jī)、濾光片組成；毛細(xì)管陣列中央有4-8cm長(zhǎng)度的毛細(xì)管除去聚酰亞胺涂層作為檢測(cè)窗，檢測(cè)窗兩端固定在絕緣材料基片上，該基片固定于平移臺(tái)上；基片上刻有兩個(gè)凹槽，每根毛細(xì)管在凹槽處折斷，在該折斷處覆蓋有導(dǎo)電薄膜；兩個(gè)凹槽作為加電解液和高壓的電連接處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多維色譜-電泳分離和檢測(cè)系統(tǒng)，其特征是反相液相色譜前再加其他機(jī)理正交的色譜模式，成為三維系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多維色譜-電泳分離和檢測(cè)系統(tǒng)，其特征是激光束通過(guò)激光化線器成為一條直線，以一定傾角垂直照射于毛細(xì)管陣列。
全文摘要
本發(fā)明是一種基于陣列毛細(xì)管等電聚焦的多維色譜、電泳分離與檢測(cè)系統(tǒng)。本系統(tǒng)采用反相液相色譜與毛細(xì)管等電聚焦聯(lián)用，第一維是毛細(xì)管反相色譜，對(duì)復(fù)雜的蛋白混合物進(jìn)行高效的分離，分離得到的餾分流入第二維—毛細(xì)管等電聚焦陣列進(jìn)一步得到高效、高通量和快速的分離。與單通道的多維色譜系統(tǒng)相比，陣列的設(shè)計(jì)更適合于大規(guī)模的復(fù)雜樣品分析，而且能使整個(gè)二維系統(tǒng)的峰容量得到進(jìn)一步的提高。本發(fā)明具有高效、快速、靈敏度高和加工簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在樣品濃縮、低豐度蛋白檢測(cè)方面有很好表現(xiàn)，且CIEF可以和質(zhì)譜在線連接進(jìn)行樣品鑒定，十分適合作為蛋白組學(xué)中高度復(fù)雜樣品的分離檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1560627SQ20041001657
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者張祥民, 毛煜 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)