專利名稱：基于電導(dǎo)率檢測(cè)的等電聚焦電泳測(cè)試結(jié)果預(yù)評(píng)估的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物分離與分析技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于電導(dǎo)率檢測(cè)的等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)測(cè)試結(jié)果預(yù)評(píng)估的新方法,該方法具有識(shí)別電遷移電流與擴(kuò)散電流、識(shí)別固化PH梯度膠條(IPG strip)與非固化pH梯度膠條(non-1PG strip)、識(shí)別蛋白樣本前處理效果好壞、以及識(shí)別實(shí)驗(yàn)操作方法正確與錯(cuò)誤功能的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
等電聚焦電泳(IEF)是利用電解質(zhì)在介質(zhì)中創(chuàng)造一個(gè)pH梯度，同時(shí)利用蛋白質(zhì)具有兩性解尚和等電點(diǎn)的特點(diǎn)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行聞效分尚富集(P.G.Rightti, In: T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques in Biochemistry and MolecularBioboligyj Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,vII，1983，p.1-86，268-313)。IEF電泳技術(shù)應(yīng)用廣泛，它不僅是蛋白質(zhì)pi表征和純度鑒定的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)；同時(shí)也是復(fù)雜蛋白質(zhì)及其組學(xué)研究中的關(guān)鍵分離方法(Nilesh STannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)，在雙向凝膠電泳中亦是作為關(guān)鍵的第一向分離技術(shù)(P.H.01 Farrell, J.Biol.Chem.250 (1975) 4007 ；Rolland ADj EvrardB，Guitton N, J.Proteome Res.6 (2007) 683)?；诔Ｒ?guī)凝膠電泳的IEF技術(shù)主要有二種，包括:(i)、管式凝膠IEF技術(shù)(L.E.M.Miles，G.E.Simmons, A.Chrambach，Anal.Biochem.49 (1972) 109.) ;(ii)、薄層凝膠 IEF 技術(shù)(P.G.Rightti，Ιη:Τ.S.Work and R.H.Rurdonj LaboraotaryTechniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier BiomedicalPress, Amesterdam New York Oxford, v II，1983，p.1-86，268-313)。但在這兩種凝膠IEF電泳技術(shù)中始終存在pH梯度水平化(plateau of pH gradient, P.Arosioj E.Granaand P.G.Righettij J.Chromatogr., 166 (1978) 55)和 pH 梯度漂移(drifting of pHgradient, H.Rilbej In:Electrofocusing and Isotachophoresis(Editors:B.J.Radolaand D.Graeslin), Walter de Gruyter & C0., Berlin New York，1977，p35_50)，這二種現(xiàn)象造成的IEF不穩(wěn)定性。并且在雙向凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis，2DE)中，由于管式和薄層凝膠IEF的凝膠很難取出，取出后也很難完整的進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)移操作；因此，基于常規(guī)凝膠的第一向IEF分離技術(shù)很難與第二向的SDS-PAGE電泳兼容。為了克服常規(guī)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性問(wèn)題以及與SDS-PAGE電泳兼容性問(wèn)題，Rightti等于上世紀(jì)八十年代發(fā)明了固定化pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)膠條以及基于 IPG 膠條的 IEF 技術(shù)((A.Gorg3 W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30 (1983) 607 ;Α.Gorg,W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30(1983)607)。由于較好地解決了傳統(tǒng)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性和兼容性等問(wèn)題，基于IPG膠條的IEF是目前應(yīng)用最廣泛的聚焦電泳技術(shù)，已經(jīng)成為2DE的第一向標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)(Nilesh S Tannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)。相關(guān)的 IEF 技術(shù)體系、IPG膠條以及儀器設(shè)備等主要有美國(guó)GE公司通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(http://gehealthcare.bioon.com.cn/)、美國(guó) Bio-Rad 公司(http://www.bio-rad.com/)、以及美國(guó)Hoefer Inc 公司(http:// www.hoeferinc.com/)提供。但不論是在常規(guī)凝膠IEF技術(shù)還是在IPG-1EF技術(shù)中始終存在成功率低、重復(fù)性差等問(wèn)題，尤其是不同來(lái)源和不同人員準(zhǔn)備的蛋白質(zhì)樣品的IEF和2DE實(shí)驗(yàn)。究其原因，主要是對(duì)IEF過(guò)程中電遷移和擴(kuò)散產(chǎn)生的電流在機(jī)制上認(rèn)識(shí)不深，對(duì)CA的添加及其對(duì)電遷移電流的影響尚未闡明，對(duì)蛋白質(zhì)樣品前處理各種鹽份的存在、及其對(duì)IEF和電流影響認(rèn)識(shí)不足，尚沒(méi)有對(duì)IPG-1EF和non-1PG-1EF過(guò)程中電流產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行比較。尤其是沒(méi)有對(duì)在IEF過(guò)程中的電遷移與擴(kuò)散產(chǎn)生的電流、蛋白質(zhì)樣品中鹽份對(duì)IEF電流影響、IPG-1EF與non-1PG-1EF的電流等進(jìn)行比較和識(shí)別，進(jìn)而形成新的相關(guān)技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于電導(dǎo)率檢測(cè)的等電聚焦電泳測(cè)試結(jié)果預(yù)評(píng)估的方法，根據(jù)IEF過(guò)程中電遷移和擴(kuò)散階段的電流形成機(jī)制，將電遷移電流和擴(kuò)散電流轉(zhuǎn)化成電遷移電導(dǎo)與擴(kuò)散電導(dǎo)，并對(duì)IEF中的電遷移電導(dǎo)與擴(kuò)散電導(dǎo)進(jìn)行實(shí)際對(duì)比分析，得到電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化曲線。本發(fā)明可以通過(guò)監(jiān)測(cè)對(duì)比起始狀態(tài)下的電導(dǎo)大小來(lái)衡量蛋白質(zhì)樣品前處理脫鹽效果的好壞，或/和評(píng)判實(shí)驗(yàn)操作的正確與錯(cuò)誤，預(yù)測(cè)聚焦的效果和成功率；如起始電導(dǎo)過(guò)高或過(guò)低，可提前終止IEF和/或2DE實(shí)驗(yàn)，減少后續(xù)的損失。根據(jù)C.X.Cao, J.Chromatogr.A813 (1998) 153,等電聚焦電泳過(guò)程中電遷移和擴(kuò)散階段的電流形成機(jī)制為:在等點(diǎn)聚焦的起始階段，離子i的電遷移電流
權(quán)利要求
1.一種基于電導(dǎo)率檢測(cè)的等電聚焦電泳測(cè)試結(jié)果預(yù)評(píng)估的方法，其特征在于，通過(guò)采用固化PH梯度膠條或非固化pH梯度膠條對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行等電聚焦處理，根據(jù)處理期間的電遷移階段以及擴(kuò)散階段的電流計(jì)算得到電遷移階段以及擴(kuò)散階段的電導(dǎo)與時(shí)間的關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)電導(dǎo)率變化衡量蛋白質(zhì)樣品前處理脫鹽效果及操作正確與否。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的前處理的蛋白質(zhì)樣品是指:利用透析脫鹽、凝膠過(guò)濾脫鹽或超濾脫鹽及其對(duì)應(yīng)不同脫鹽程度處理的樣品，之后冷凍干燥備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的固化PH梯度膠條或非固化pH梯度膠條是指:采用被動(dòng)水化方式，選擇膠條長(zhǎng)度為7cm，膠條pH為3-10，水化12h ;上樣量為100 μ g/條，上樣體積為125 μ L/條；環(huán)境溫度:25度；測(cè)試控溫:18度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的等電聚焦處理是指:將固化PH梯度膠條或非固化PH梯度膠條浸潰于經(jīng)過(guò)樣本前處理的蛋白質(zhì)樣品后，兩端與可控電壓源的正負(fù)極相連組成回路，通過(guò)調(diào)整電壓源的輸出得到膠條兩端的電壓，通過(guò)串聯(lián)電流計(jì)檢測(cè)該過(guò)程中回路 中的電流。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的調(diào)整電壓源的輸出是指: 當(dāng)采用固化PH梯度膠條時(shí)，按以下步驟調(diào)整電壓: 1:電壓:4000V，升壓方式:快速升壓，時(shí)間:15000Volt Hr ； 2:電壓:500V，恒壓，電壓調(diào)節(jié)方式:快速； 當(dāng)采用非固化PH梯度膠條時(shí)，按以下步驟調(diào)整電壓: 1:電壓:500V，升壓方式:線性升壓，時(shí)間:5h ； i1:電壓:2000V，電壓調(diào)節(jié)方式:快速，時(shí)間:5min ； ii1:電壓:200V，恒壓，電壓調(diào)節(jié)方式:快速。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的電遷移階段以及擴(kuò)散階段的電導(dǎo)與時(shí)間的關(guān)系是指: 當(dāng)采用固化pH梯度膠條時(shí):
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的通過(guò)電導(dǎo)率變化衡量蛋白質(zhì)樣品前處理脫鹽效果及操作正確與否是指: 當(dāng)采用固化PH梯度膠條時(shí):標(biāo)準(zhǔn)條件下，蛋白質(zhì)樣品IPG-1EF對(duì)應(yīng)的起始電導(dǎo)變化從0.008 μ S/cm到0.02 μ S/cm之間；當(dāng)?shù)鞍讟悠稩PG-1EF起始電導(dǎo)超過(guò)0.02 μ S/cm,說(shuō)明此樣品中含有較高濃度的鹽類，此時(shí)IEF的聚焦效果一般較差，成功率低；當(dāng)?shù)鞍讟悠稩PG-1EF起始電導(dǎo)低于0.008 μ S/cm,則說(shuō)明此測(cè)試膠條水化不完全，或/和電極接觸不良，或/和上樣成分漏加或誤加等偶然原因，此時(shí)IEF成功率很低，應(yīng)及時(shí)糾正或終止測(cè)試； 當(dāng)采用非固化pH梯度膠條時(shí):標(biāo)準(zhǔn)條件下，蛋白質(zhì)樣品non-1PG-1EF對(duì)應(yīng)的起始電導(dǎo)變化從0.04 μ S/cm到0.2 μ S/cm之間;當(dāng)?shù)鞍讟悠穘on-1PG-1EF起始電導(dǎo)超過(guò)0.2 μ S/cm,說(shuō)明此樣品中含有較高濃度的鹽類，此時(shí)IEF的聚焦效果一般較差，成功率低；當(dāng)?shù)鞍讟悠穘on-1PG-1EF起始電導(dǎo)低于0.04 μ S/cm,則說(shuō)明此測(cè)試膠條水化不完全，或/和電極接觸不良，或/和上樣成分漏加 或誤加等偶然原因，此時(shí)IEF成功率很低，應(yīng)及時(shí)糾正或終止測(cè)試。
全文摘要
一種生物分離與分析技術(shù)領(lǐng)域的基于等電聚焦電泳電導(dǎo)率檢測(cè)的蛋白樣本前處理效果和實(shí)驗(yàn)操作是否正確評(píng)估方法，通過(guò)采用固化pH梯度膠條或非固化pH梯度膠條對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行等電聚焦處理，根據(jù)處理期間的電遷移階段以及擴(kuò)散階段的電流計(jì)算得到電遷移階段以及擴(kuò)散階段的電導(dǎo)與時(shí)間的關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)電導(dǎo)率衡量蛋白質(zhì)樣品前處理脫鹽效果和實(shí)驗(yàn)操作是否正確。本發(fā)明可有效識(shí)別在IEF過(guò)程中電遷移與擴(kuò)散電導(dǎo)、蛋白質(zhì)樣本脫鹽處理效果好壞、實(shí)驗(yàn)操作是否正確、以及基于固化pH梯度膠條或非固化pH梯度膠條的IEF實(shí)驗(yàn)，提升復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的IEF和雙向凝膠電泳分析的成功率和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)G01N27/447GK103196981SQ20131010580
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者曹成喜, 郭陳剛, 李國(guó)慶, 劉小平 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)