本發(fā)明具體涉及一種用于輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的呼吸道傳播為主的慢性疾病，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一種人畜共患傳染病。全世界約有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國(guó)家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80％。其中大部分結(jié)核分枝桿菌感染者為潛伏感染者，他們?cè)谝簧?dāng)中發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的概率為5％-10％。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染時(shí)，病人沒(méi)有臨床癥狀、沒(méi)有放射檢查癥象、沒(méi)有病菌學(xué)依據(jù)、結(jié)核純蛋白衍生物的皮試為陽(yáng)性。這些現(xiàn)象的存在，主要是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)以休眠狀態(tài)存在，這些休眠菌在體內(nèi)可存在數(shù)年而機(jī)體沒(méi)有任何不適反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，結(jié)核分枝桿菌又開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致疾病發(fā)生。因此，結(jié)核病治療急需一種能客觀準(zhǔn)確反映結(jié)核病轉(zhuǎn)歸以及治療效果的新型指標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒以及輔助檢測(cè)結(jié)核病的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

本發(fā)明實(shí)施例提供了用于輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒，包括用于檢測(cè)可能存在于待檢患者血液中的外泌體內(nèi)的Hsp16.3蛋白的物質(zhì)。

進(jìn)一步的，所述Hsp16.3蛋白存在于結(jié)核病患者血液中的外泌體內(nèi)。

進(jìn)一步的，所述用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)包括Hsp16.3蛋白的抗體。

進(jìn)一步的，所述的試劑盒還可包括用以提取待檢患者血液中外泌體的提取試劑。

進(jìn)一步的，所述的試劑盒還可包括用于鑒定通過(guò)所述提取試劑從待檢患者血液中提取出的提取物是否為外泌體的鑒定試劑。

進(jìn)一步的，所述鑒定試劑包括用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)。更進(jìn)一步的，所述用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)包括CD63蛋白的抗體。

進(jìn)一步的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了所述試劑盒的使用方法，其可以包括：

(1)提取待檢患者血液中的外泌體；

(2)檢測(cè)步驟(1)所獲提取物中是否包含CD63蛋白，若是，則判定所述提取物為外泌體；

(3)檢測(cè)所述外泌體中是否包含Hsp16.3蛋白，若是，則判定待檢患者為結(jié)核病患者。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)在制備輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)包括Hsp16.3蛋白的抗體。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)及用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)在制備輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)包括Hsp16.3蛋白的抗體。

進(jìn)一步的，所述用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)包括CD63蛋白的抗體。

在本發(fā)明中，前述Hsp16.3蛋白的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體等。這些物質(zhì)可以通過(guò)多種已知途徑獲取，例如可直接商購(gòu)用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的試劑盒。

在本發(fā)明中，前述CD63蛋白的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體等。這些物質(zhì)也可以通過(guò)多種已知途徑獲取，例如可直接商購(gòu)用于檢測(cè)CD63蛋白的試劑盒。

顯然的，前述的試劑盒還可包括其它輔助試劑，例如業(yè)界已知的各類(lèi)合適細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒培養(yǎng)基、緩沖液等等，且不限于此。

進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括用以提取待檢患者血液中外泌體的試劑。

進(jìn)一步的，所述試劑盒的操作方法可以包括：

提取待檢患者血液中的外泌體；

利用所述用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)檢測(cè)提取物是否為外泌體；

利用所述用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)檢測(cè)所述外泌體中是否存在Hsp16.3蛋白。

在本發(fā)明中，所述輔助檢測(cè)結(jié)核病包括輔助檢測(cè)待測(cè)患者是否為結(jié)核病患者。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了輔助檢測(cè)結(jié)核病的方法，其主要是通過(guò)檢測(cè)外泌體蛋白來(lái)診斷結(jié)核病。

進(jìn)一步的，所述輔助檢測(cè)結(jié)核病的方法包括：通過(guò)檢測(cè)人血漿中的外泌體是否含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，來(lái)作為判斷結(jié)核病患者的輔助診斷依據(jù)。

進(jìn)一步的，所述輔助檢測(cè)結(jié)核病的方法可以通過(guò)前述的試劑盒實(shí)施。

在本發(fā)明中，前述Hsp16.3蛋白是存在于結(jié)核分枝桿菌菌膜上的主要抗原蛋白。本案發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，Hsp16.3蛋白的表達(dá)和結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染及休眠菌的形成密切相關(guān)。

在本發(fā)明中，前述外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的大小在30～100nm的胞外囊泡，其膜組成成分復(fù)雜且不穩(wěn)定。外泌體中包含胞質(zhì)環(huán)境中富含的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其它分析物，具體成分與其來(lái)源的細(xì)胞密切相關(guān)。外泌體與細(xì)胞膜融合后，可將所攜帶的物質(zhì)和信號(hào)傳遞到受體細(xì)胞并改變其生物學(xué)功能。從巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞來(lái)源的外泌體膜上含有完整的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)，該分子能被T-細(xì)胞的識(shí)別并執(zhí)行一系列免疫功能。本案發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后，分泌的外泌體和Hsp16.3蛋白都具有提呈抗原，活化B、T淋巴細(xì)胞的重要作用，受到結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞會(huì)分泌含結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白的外泌體。

較之現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明能在較短時(shí)間內(nèi)(一天以?xún)?nèi))通過(guò)檢測(cè)少量血液(低于1mL)中是否含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白而準(zhǔn)確判斷待檢患者是否為結(jié)核病人，無(wú)需特別昂貴的儀器設(shè)備等，操作簡(jiǎn)單，具有很好的特異性，適于推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1A是本發(fā)明一典型實(shí)施例中受到重組慢病毒rLV-Hsp16.3-ZsGreen1感染的U937細(xì)胞的光學(xué)照片。

圖1B是本發(fā)明一典型實(shí)施例中重組慢病毒對(duì)U937細(xì)胞的感染率的流式細(xì)胞檢測(cè)圖。

圖2A是本發(fā)明一典型實(shí)施例中感染重組慢病毒的U937細(xì)胞分泌的外泌體(bars:100nm)的透射電鏡檢測(cè)圖。

圖2B是本發(fā)明一典型實(shí)施例中外泌體標(biāo)志蛋白Alix、CD63的western檢測(cè)圖譜。

圖2C是本發(fā)明一典型實(shí)施例中Hsp16.3、Calnexin蛋白的western檢測(cè)圖譜。

圖3A是本發(fā)明一典型實(shí)施例中結(jié)核分枝桿菌(bars:20μm)的生長(zhǎng)形態(tài)圖。

圖3B是本發(fā)明一典型實(shí)施例中結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色鑒定圖譜。

圖4是本發(fā)明一典型實(shí)施例中各樣品中的Hsp16.3、Calnexin蛋白的Western檢測(cè)圖譜。

圖5是本發(fā)明一典型實(shí)施例中健康人、潛伏感染者、結(jié)核病人。血漿中的結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白和CD63蛋白的Western檢測(cè)圖譜。

具體實(shí)施方式

如前文所述，鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，為探尋一種能輔助準(zhǔn)確診斷結(jié)核病的方法，本案發(fā)明人進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究和大量實(shí)踐，在此過(guò)程中，本案發(fā)明人非常意外的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)待檢患者血液中的外泌體是否含有結(jié)核分枝桿菌的小分子熱休克蛋白(Hsp16.3蛋白)，可以將之作為判斷結(jié)核病患者的輔助診斷依據(jù)?；诖艘馔獍l(fā)現(xiàn)，本案發(fā)明人得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案。如下將予以詳細(xì)說(shuō)明。

本案發(fā)明人在研究中首先構(gòu)建了表達(dá)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白(Hsp16.3)的一個(gè)非整合型慢病毒載體，通過(guò)該病毒感染單核巨噬細(xì)胞系，使得該細(xì)胞系大量表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，證明結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白能被U937細(xì)胞包裝進(jìn)外泌體。

進(jìn)一步的，本案發(fā)明人還利用結(jié)核桿菌減毒活菌苗卡介苗BCG感染U937，發(fā)現(xiàn)其也能夠誘使受到感染的U937細(xì)胞分泌含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白的外泌體。

更進(jìn)一步的，本案發(fā)明人通過(guò)檢測(cè)健康人、潛伏感染者、結(jié)核病人血漿中的外泌體的情況，發(fā)現(xiàn)在結(jié)核病人血漿中的外泌體中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，而健康人血漿中的外泌體中沒(méi)有檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白。

由此，本案發(fā)明人確認(rèn)，可以通過(guò)檢測(cè)患者血液中的外泌體是否含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，來(lái)作為判斷結(jié)核病患者的輔助診斷依據(jù)。換言之，如果能夠從結(jié)核病患者血液中的外泌體檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，將其作為結(jié)核病的分子檢測(cè)標(biāo)志物，將能極大優(yōu)化結(jié)核病的診斷，且這樣的診斷方式還將具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例提供了輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒，其如前文所述。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了用于檢測(cè)Hsp16.3蛋白的物質(zhì)及用于檢測(cè)CD63蛋白的物質(zhì)在制備輔助檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒中的應(yīng)用。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了輔助檢測(cè)結(jié)核病的方法，其主要是通過(guò)檢測(cè)外泌體蛋白來(lái)診斷結(jié)核病，特別是通過(guò)檢測(cè)人血漿中的外泌體是否含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白，來(lái)作為判斷結(jié)核病患者的輔助診斷依據(jù)。

藉由本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，能在較短時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)血液中是否含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白來(lái)判斷患者是否為結(jié)核病人，不僅無(wú)需特別昂貴的儀器設(shè)備，而且操作簡(jiǎn)單，具有優(yōu)良特異性，同時(shí)只需少量檢測(cè)樣品(所需的待檢患者血液低于1mL)即可完成檢測(cè)，適于推廣應(yīng)用。

以下將結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作更進(jìn)一步的說(shuō)明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。又及，若非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料也均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。

本發(fā)明的一典型實(shí)施方案主要基于結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，并可按照以下步驟實(shí)現(xiàn)：

1.結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白能夠被U937細(xì)胞包裝進(jìn)外泌體

(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用基因合成、酶切連接等方法獲得含外源功能基因的重組質(zhì)粒。

(2)重組慢病毒的制備

利用重組質(zhì)粒體外包裝含有外源功能基因的非整合型慢病毒。

(3)重組病毒感染人單核巨噬細(xì)胞

含有外源功能基因的重組慢病毒感染人單核巨噬細(xì)胞。

(4)受慢病毒感染的人單核巨噬細(xì)胞的外泌體的提取和鑒定

采用超速離心法獲得較高純度的外泌體，觀察外泌體的顯微結(jié)構(gòu)，并鑒定外泌體的標(biāo)志物，和結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白。

2.感染結(jié)核分枝桿菌的單核巨噬細(xì)胞U937的外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白

(1)結(jié)核分枝桿菌活菌苗BCG感染人單核巨噬細(xì)胞

利用減毒結(jié)核分枝桿菌活菌苗卡介苗菌株感染人單核巨噬細(xì)胞，對(duì)感染效果進(jìn)行鑒定。

(2)受BCG感染的人單核巨噬細(xì)胞的外泌體的提取和鑒定

采用超速離心法獲得較高純度的外泌體，并鑒定外泌體的標(biāo)志物CD63蛋白和結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白。

3.證明結(jié)核病人血液的外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白

分別對(duì)健康人、潛伏感染者、結(jié)核病人的血漿里面的外泌體進(jìn)行檢測(cè)。

更為具體的，本發(fā)明一典型實(shí)施例可以包括如下步驟：

1.結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白能夠被U937細(xì)胞包裝為外泌體

(1)pLV–Hsp16.3-ZsGreen1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

質(zhì)粒puc57-Hsp16.3和pLVX-ZsGreen1分別經(jīng)BamHI/XbaI酶切、膠回收純化后，在T4DNA連接酶的作用下，22℃連接30min，轉(zhuǎn)化SURE2感受態(tài)菌，挑單克隆菌于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和XbaI酶切鑒定后，由上海生物工程技術(shù)公司測(cè)序比對(duì)，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pLV–Hsp16.3-ZsGreen1。

(2)重組慢病毒rLV–Hsp16.3-ZsGreen1的包裝、純化和滴度測(cè)定

將293T細(xì)胞提前一天鋪于10cm盤(pán)，第二天待細(xì)胞密度為70％時(shí)，將重組質(zhì)粒pLV-Hsp16.3-ZsGreen1和輔助包裝質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G按照4:3:2的比例混勻在一起，總量為18ug，用HBS稀釋為500uL；取濃度為50mM PEI 22uL，用HBS稀釋為500uL；靜置10min后，將質(zhì)?；旌衔镏鸬渭尤氲絇EI稀釋液中混勻。再次靜置10min后，吸走10cm盤(pán)內(nèi)的培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物逐滴滴在細(xì)胞表面，補(bǔ)3mL基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在48h和72h收集培養(yǎng)上清液，合并一起后，蔗糖梯度離心法濃縮和純化病毒，病毒儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

病毒滴度測(cè)定方法：將293T細(xì)胞接種于96孔板中，24h后待細(xì)胞密度為40％，用逐孔稀釋法加入病毒液，細(xì)胞培養(yǎng)24h后，換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4天后，計(jì)算熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算病毒滴度(TU/uL)。慢病毒滴度(TU/uL)＝熒光細(xì)胞比例×細(xì)胞數(shù)目×稀釋倍數(shù)/病毒體積。

(3)重組病毒感染U937細(xì)胞

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，按MOI值50：1加入相應(yīng)病毒液和500uL基礎(chǔ)1640培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育12h后，加入經(jīng)超高速離心(120000g 16h)的含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，從而得到工程化的U937細(xì)胞(U937-Hsp16.3)。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，依次傳入更大容量的細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，每48h離心收集細(xì)胞上清，并觀察熒光表達(dá)情況(檢測(cè)結(jié)果可參閱圖1A)，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)感染效率，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖1B。

(4)U937-Hsp16.3外泌體的提取

將上一步收集到的上清合并在一起，分別在4℃下按照300g、15min,2000g、1h，10000g、1h離心，每一次離心均收集上清，棄白色沉淀。將最后的上清轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在超速離心機(jī)下，4℃、100000g離心70min。小心棄凈上清，用PBS重懸沉淀后，再次4℃、100000g離心70min，小心棄凈上清，用PBS重懸沉淀，此時(shí)得到純度較高的外泌體。測(cè)定濃度后，將外泌體分裝并儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

(5)檢測(cè)U937-Hsp16.3細(xì)胞外泌體中的結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白

取20uL新鮮外泌體滴于銅網(wǎng)，經(jīng)固定、烘干后，透射電鏡上觀察其形態(tài)，進(jìn)行初步的外泌體質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖2A。將U937-Hsp16.3細(xì)胞外泌體和U937細(xì)胞外泌體加入增強(qiáng)型RIPA裂解液，冰浴30min后，在100HZ下超聲5s,間隔10s，共超聲5次至樣品澄清為止，此時(shí)得到外泌體的總蛋白。收集U937-Hsp16.3細(xì)胞，加入等體積的細(xì)胞裂解液，冰浴裂解1h，離心后取上清，得到細(xì)胞總蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。將外泌體總蛋白和細(xì)胞總蛋白分別加入6×蛋白Loading，煮沸10min后，按每孔80ug進(jìn)行Western，檢測(cè)外泌體的標(biāo)志蛋白CD63和AliX，驗(yàn)證外泌體是否成功提取，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖2B；檢測(cè)各樣品中的結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白、以及用來(lái)驗(yàn)證外泌體純度的鈣連蛋白Calnexin，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖2C。

2.感染結(jié)核分枝桿菌的單核巨噬細(xì)胞U937的外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白

(1)結(jié)核分枝桿菌感染U937細(xì)胞

結(jié)核分枝桿菌減毒菌株BCG用含有10％增菌劑(OADC)、0.2％丙三醇和0.5％的吐溫80的7h9培養(yǎng)液，置于37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少3代。收集BCG培養(yǎng)基至離心管中，12000g離心10min，棄去上清，用兩倍體積的PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)尤脒m量2mm玻璃珠在渦旋振蕩器震蕩數(shù)分鐘，室溫靜置20min，挑去液體表面漂浮物，單個(gè)結(jié)核分枝桿菌即分散在上清中，其生長(zhǎng)形態(tài)可參閱圖3A。將BCG菌、U937細(xì)胞按10：1的數(shù)量比混合在一起吸入T75細(xì)胞瓶中，加入4mL 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育至少6h。加完全1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至BCG菌被U937全部吞噬，此時(shí)結(jié)核桿菌在U937細(xì)胞內(nèi)潛伏感染(U937-BCG)。取少量樣品，用抗酸染色法分別對(duì)BCG菌和U937-BCG細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果可參閱圖3B。將U937-BCG細(xì)胞吸入離心管中，5000g 5min進(jìn)行離心，棄上清，加入經(jīng)超高速離心(120000g 16h)的含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每48h離心收集細(xì)胞上清。

(2)U937-BCG外泌體的收集和Hsp16.3蛋白的檢測(cè)

按步驟4的方法提取上清中的外泌體。將U937-BCG外泌體和U937外泌體按照前述步驟1的步驟(5)的外泌體裂解方法進(jìn)行破膜，得到外泌體總蛋白。BCG菌經(jīng)12000g離心10min，棄盡上清，PBS清洗兩遍后，經(jīng)超聲裂解20min進(jìn)行破碎，離心后的上清為細(xì)菌總蛋白。按前述步驟1的步驟(5)的細(xì)胞裂解方法對(duì)U937-BCG細(xì)胞、U937細(xì)胞分別進(jìn)行處理，分別得到細(xì)胞總蛋白。Western檢測(cè)以上樣品中的Hsp16.3蛋白和Calnexin蛋白的存在情況，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖4。

3.結(jié)核病人血液的外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白

按步驟4提取外泌體的方法分別提取健康人、潛伏感染者、結(jié)核病人血漿中的外泌體。將血漿外泌體按照前述步驟1的步驟(5)的方法進(jìn)行破膜，得到外泌體總蛋白。將各樣本的血漿外泌體總蛋白和血漿總蛋白按前述步驟1的步驟(5)的方法進(jìn)行處理。Western檢測(cè)以上樣品中的Hsp16.3蛋白和CD63蛋白，檢測(cè)結(jié)果可參閱圖5。

需要說(shuō)明的是，在本文中，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或設(shè)備所固有的要素。

應(yīng)當(dāng)理解，以上所述僅是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。