本發(fā)明涉及用于肝癌檢測的標(biāo)志物或其組合，用于檢測它們的試劑和試劑盒，以及它們在肝癌檢測和將肝癌患者與乙肝患者、肝硬化患者和/或健康者相區(qū)分中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌(PLC，簡稱肝癌)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，侵襲生長迅速，治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，被稱為“癌中之王”。全世界半數(shù)左右的肝癌患者集中在中國，每年我國約有11萬人死于肝癌，居惡性腫瘤死亡率的第二位。目前，手術(shù)切除及肝移植是肝癌最有效的治療方法，但絕大多數(shù)肝癌患者就診時已到中晚期，無法手術(shù)，手術(shù)切除率僅為10-30％。對于不能手術(shù)的病例，傳統(tǒng)的放、化療效果不佳，患者生存期一般不超過半年。由此可見肝癌早期診斷至關(guān)重要，是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。

早期肝癌檢出率低的現(xiàn)狀反映出目前肝癌的診斷方法還有很大局限性。當(dāng)前肝癌的診斷主要依靠血清學(xué)檢查和影像學(xué)診斷。血清學(xué)檢查主要檢測血清中的腫瘤標(biāo)志物，目前主要是依靠甲胎蛋白(AFP)的檢測，但AFP在小肝癌中的敏感度僅為40％左右。由此可見，單獨使用一種腫瘤標(biāo)志物無法準(zhǔn)確診斷腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，聯(lián)合檢測多種腫瘤標(biāo)志物才能提高檢出的準(zhǔn)確率，避免或減少漏診和假陽性。應(yīng)用新的檢測技術(shù)、選擇更有診斷價值的標(biāo)志物組合，提高現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物檢測的靈敏度和特異性對肝癌早期診斷極為重要。目前，常用的肝癌標(biāo)志物主要包括：甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶Ⅱ(GGTⅡ)等。

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)：AFP是目前最常用的HCC診斷標(biāo)志物，AFP是人體在胚胎時期血液中含有的一種特殊蛋白，正常成人血清中 含量極微，肝細(xì)胞癌可顯著升高。

α-L-巖藻糖甘酶(alpha-L-fucosidase，AFU)：1984年，Deugnier首先發(fā)現(xiàn)了HCC患者血清AFU活性明顯升高，并報道了對正常人、肝硬化患者和繼發(fā)轉(zhuǎn)移肝癌患者血清AFU的測定結(jié)果，在原發(fā)性肝癌中它診斷敏感性為75％，特異性為90％，認(rèn)為AFU可能成為診斷HCC的一項有用指標(biāo)。

肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)：HGF是一種能夠刺激干細(xì)胞增殖的多肽生長因子。HGF受體(Met)主要分布于各臟器及其腫瘤組織的上皮細(xì)胞，在重癥肝炎、腫瘤等疾病中，血清中的HGF水平可發(fā)生明顯變化，有望成為HCC的診斷標(biāo)志物。

硫酸肝素蛋白多糖3(glypican-3，GPC3)：GPC3位于細(xì)胞膜表面，是細(xì)胞表面多功能的共同受體。Hsu等應(yīng)用差異顯示技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了GPC3基因在HCC組織中有異常表達。GPC3現(xiàn)已成為肝穿刺標(biāo)本良惡性肝疾患鑒定的重要參考標(biāo)志物之一。

谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(γ-glutamyltransferase isoenzyme2,GGT2)：GGT2被認(rèn)為是AFP以外的最佳肝癌標(biāo)志物。目前認(rèn)為GGT2是肝細(xì)胞產(chǎn)生的癌胚蛋白，肝細(xì)胞產(chǎn)生的GGT糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種差異可在肝癌前期和早期出現(xiàn)，因此具有較高的預(yù)測價值和早期診斷價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一組肝癌血清學(xué)檢測的標(biāo)志物組合，包括甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(GGT2)，可將肝癌患者與乙肝患者、肝硬化患者或健康者進行有效區(qū)分。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)單獨檢測HGF或?qū)GF與其它四個標(biāo)志物中的一個或多個聯(lián)合檢測，可大幅提高全期肝癌和早期肝癌血清學(xué)檢測的敏感度和特異性，明顯優(yōu)于肝癌臨床檢測常用的AFP單指標(biāo)。本發(fā)明為肝癌的血清學(xué)檢測提供了一種可靠的方法，并提供了一種檢測用試劑盒。

在一方面，本發(fā)明涉及用于肝癌檢測的標(biāo)志物，所述標(biāo)志物選自由以下組成的組：甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因 子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(GGT2/GGT II)，優(yōu)選HGF。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于肝癌檢測的標(biāo)志物組合，其中所述標(biāo)志物組合包括兩種或更多種(三種、四種或五種)選自由以下組成的組的標(biāo)志物：甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(GGT2/GGT II)。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及的所述標(biāo)志物組合包括HGF和選自由以下組成的組的一種或多種(二種、三種或四種)標(biāo)志物：甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(GGT2/GGT II)。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及的所述標(biāo)志物組合選自由以下組成的組：HGF+AFP；HGF+AFU；HGF+GPC3；HGF+GGT2；HGF+AFP+AFU；HGF+AFP+GPC3；HGF+AFP+GGT2；HGF+AFU+GPC3；HGF+GPC3+GGT2；HGF+AFP+GPC3+GGT2；HGF+AFP+AFU+GGT2；和HGF+AFP+GPC3+GGT2+AFU。

在另一方面，本發(fā)明涉及能夠檢測根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)志物或根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)志物組合的試劑或試劑組合在制備用于肝癌檢測的診斷劑或試劑盒中的應(yīng)用，優(yōu)選所述肝癌是全期肝癌或早期肝癌。優(yōu)選地，所述診斷劑或試劑盒在應(yīng)用時還考慮受試者的年齡和/或性別。

在另一方面，本發(fā)明涉及能夠檢測根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)志物或根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)志物組合的試劑或試劑組合在制備用于將肝癌患者與乙肝患者、肝硬化患者和/或健康者相區(qū)分的診斷劑或試劑盒中的應(yīng)用，優(yōu)選所述肝癌是全期肝癌或早期肝癌。優(yōu)選地，所述診斷劑或試劑盒在應(yīng)用時還考慮受試者的年齡和/或性別。

在以上方面的一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑或試劑組合包含一種或多種(1,2,3,4或5種)特異性結(jié)合于人肝癌標(biāo)志物的抗體或其片段，所述人肝癌標(biāo)志物選自由以下組成的組：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶II(GGT II或GGT2)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)，優(yōu)選所述試劑或試劑組合包含針對HGF的抗體或其片段和分別針對選自AFP、GGT II、AFU和GPC3的標(biāo)志物的 抗體或其片段中的一種或多種(1,2,3或4種)。

優(yōu)選地，所述抗體是多克隆抗體或人IgG2亞類、人IgG1亞類或人IgM亞類單克隆抗體，優(yōu)選所述片段是單鏈抗體(scFv)，優(yōu)選其中所述抗體或其片段用于ELISA測定、Western Blotting測定、免疫組織化學(xué)測定或免疫熒光測定。

在另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含能夠檢測本發(fā)明的標(biāo)志物或本發(fā)明的標(biāo)志物組合的試劑或試劑組合，所述試劑盒用于肝癌檢測或用于將肝癌患者與乙肝患者、肝硬化患者和/或健康者相區(qū)分，優(yōu)選所述肝癌是全期肝癌或早期肝癌，更優(yōu)選所述試劑盒在使用時還考慮受試者的年齡和/或性別，優(yōu)選所述試劑盒包含一種或多種(1,2,3,4或5種)特異性結(jié)合于所述標(biāo)志物的抗體或其片段，更優(yōu)選所述片段是單鏈抗體(scFv)。

發(fā)明詳述

為了改善目前臨床肝癌檢出率低及現(xiàn)有血清學(xué)檢測方法敏感度低的問題，本發(fā)明提供了一個肝癌標(biāo)志物組合，AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2，將這五個標(biāo)志物進行HGF單指標(biāo)檢測或HGF與其他標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，大幅提高了全期肝癌和早期肝癌血清學(xué)檢測的敏感度和特異性，為肝癌的檢測提供了一種可靠的方法。

具體地，本發(fā)明提供以下各項：

1.用于肝癌檢測的標(biāo)志物組合，包括甲胎蛋白(AFP)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶2(GGT2)；

2.根據(jù)以上1所述的標(biāo)志物組合，其特征在于AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2五個標(biāo)志物中，進行HGF單指標(biāo)檢測，以及HGF聯(lián)合其它標(biāo)志物進行雙指標(biāo)、三指標(biāo)、四指標(biāo)及五指標(biāo)檢測時，能夠與乙肝患者、肝硬化患者和健康者區(qū)別開來而檢測肝癌；

3.用于檢測肝癌的方法，其特征在于測定同一患者血清中的AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2五種標(biāo)志物的含量，通過對五種標(biāo)志物的量進行統(tǒng)計學(xué)分析確定其患肝癌的可能性；

4.根據(jù)以上3所述的方法，其五種標(biāo)志物含量的測定，是通過酶聯(lián)免 疫吸附法(ELISA)進行的；

5.根據(jù)以上3所述的方法，在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌均有很高的敏感度和特異性，單獨檢測HGF，必要時納入受試者的年齡和性別，可以滿足臨床肝癌診斷的需要，HGF是優(yōu)于AFP的肝癌標(biāo)志物；

6.根據(jù)以上3所述的方法，檢測兩個指標(biāo)在全部人群篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，納入年齡或性別之一后，HGF與AFP、AFU、GPC3、GGT2四個標(biāo)志物之一分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到很高的敏感度和特異性，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合，說明HGF與其它四種標(biāo)志物之一聯(lián)合檢測，必要時綜合受試者的年齡或者性別，可以作為HGF單指標(biāo)檢測的補充，滿足臨床肝癌診斷的需求；

7.根據(jù)以上3所述的方法，檢測三個指標(biāo)在全部人群中篩查肝癌，檢測全期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，HGF+AFP+GGT2聯(lián)用，HGF+AFU+GPC3聯(lián)用時，均可達到91.8％以上的敏感度和90.2％以上的特異性，檢測早期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，以及HGF+AFP+GGT2聯(lián)用時，均可達86.3％以上的敏感度和85.5％以上的特異性，在乙肝患者中篩查肝癌時，HGF+AFP+AFU，HGF+AFP+GPC3，HGF+AFP+GGT2，HGF+AFU+GPC3以及HGF+GPC3+GGT2聯(lián)合應(yīng)用，檢測全期肝癌的敏感度均可達92.3％以上，特異性可達93.5％以上，檢測早期肝癌也有較好效果，特別是HGF+AFP+AFU的組合，敏感度達90.2％，特異性達98.4％；在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另兩種標(biāo)志物聯(lián)用，也可達到較滿意的效果，說明HGF與另外兩種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可以滿足臨床肝癌血清學(xué)診斷及早期診斷的需求；

8.根據(jù)以上3所述的方法，檢測四個指標(biāo)篩查肝癌時，敏感度和特異性均有提高，在全部人群中篩查肝癌時，HGF、AFP、GPC3和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為92.0％，檢測早期肝癌的 敏感度為86.3％，特異性為90.5％，在乙患者中篩查肝癌時，HGF、AFP、AFU和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另外三種指標(biāo)聯(lián)用時，均可達到較高的敏感度和特異性；

9.根據(jù)以上3所述的方法，五種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，敏感度和特異性進一步提高，在全人群中篩查肝癌時，其檢測全期肝癌的敏感度可達91.2％，特異性可達93％，檢測早期肝癌的敏感度為84.3％，特異性可達87.2％，在乙肝患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為76.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為66.7％；

10.一種用于肝癌血清學(xué)檢測的試劑盒，同時包含AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2中的一種或多種單克隆抗體，可用于患者血清的ELISA檢測。

更具體地，本發(fā)明提供AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2聯(lián)合應(yīng)用的方法，其包括的步驟為：

1)收集不同人群的血清，包括肝癌患者，乙肝患者，肝硬化患者和健康者；

2)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測每例血清中的AFP、AFU、HGF、GPC3及GGT2五個標(biāo)志物的含量，為減小實驗誤差，一個指標(biāo)設(shè)3個附孔取平均值；

3)分別對五個標(biāo)志物的含量進行單指標(biāo)、兩指標(biāo)、三指標(biāo)、四指標(biāo)及五指標(biāo)聯(lián)合ROC曲線分析，并對結(jié)果進一步的統(tǒng)計學(xué)分析；

4)根據(jù)病例資料，將肝癌患者依照巴塞羅那標(biāo)準(zhǔn)進行分期，分析單標(biāo)志物和兩個、三個或更多標(biāo)志物組合在早期(A)、中期(B)和晚期(C+D)中的敏感度和特異性。

5)對血清中五種標(biāo)志物檢測值進行建模，分析其預(yù)測肝癌的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明所述的肝癌標(biāo)志物組合，即AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2，五種指標(biāo)在肝癌患者血清中的含量，顯著高于健康者(p<0.0001)；AFP、 HGF與GGT2在肝癌患者血清中的含量均高于乙肝患者和肝硬化患者，而AFU在肝癌患者血清中的含量低于乙肝患者高于肝硬化患者，GPC3在肝癌患者血清中的含量高于乙肝患者低于肝硬化患者。

本發(fā)明所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，使用HGF單指標(biāo)在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，其檢測全期肝癌的敏感度為90.3％，特異性為90.5％，在巴塞羅那分期的早期(A期)肝癌患者中，檢測的敏感度為90.2％，特異性為84.1％，納入受試者的年齡和性別后，HGF在全期肝癌中的敏感度為91.3％，特異性為90.9％，在早期肝癌中的敏感度為86.3％，特異性為90.5％；在乙肝患者中篩查肝癌，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌的敏感度為94.4％，特異性為91.8％，檢測早期肝癌的敏感度為90.2％，特異性為91.9％，納入受試者年齡性別后，檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為95.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為90.2％；在肝硬化患者中篩查肝癌，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌的敏感度和特異性均可達72％和73％以上，顯著優(yōu)于臨床常用的AFP，說明單獨檢測血清中HGF的含量，必要時并綜合受試者年齡和性別可以滿足臨床肝癌診斷的需要。

本發(fā)明所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，檢測兩個指標(biāo)在全部人群篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為93.1％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為87.2％，特異性為94.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為90.6％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為93.1％；只納入受試者年齡后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為92.3％，特異性為90.9％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為91.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.3％，特異性為90.9％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為92.3％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86％以上的敏感度和和84％以上的特異性。

而在乙肝患者中篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.9％，特異性為95.2％，HGF與AFU 聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％。；只納入受試者年齡進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為95.1％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86.3％以上的敏感度和和83.9％以上的特異性。在肝硬化患者中篩查肝癌時，納入年齡或性別之一后，HGF與其他四個標(biāo)志物分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到較高的敏感度和特異性。說明HGF與其他四個指標(biāo)單獨聯(lián)合檢測，并綜合受試者年齡或性別后，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合。

本發(fā)明所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，檢測三個指標(biāo)在全部人群中篩查肝癌，檢測全期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，HGF+AFP+GGT2聯(lián)用時，均可達到91.8％以上的敏感度和90.2％以上的特異性，檢測早期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，以及HGF+AFP+GGT2聯(lián)用時，均可達86.3％以上的敏感度和85.5％以上的特異性。在乙肝患者中篩查肝癌時，HGF+AFP+AFU，HGF+AFP+GPC3，HGF+AFU+GPC3以及HGF+GPC3+GGT2聯(lián)合應(yīng)用，檢測全期肝癌的敏感度均可達92.3％以上，特異性可達93.5％以上，檢測早期肝癌也有較好效果，特別是HGF+AFP+AFU的組合，敏感度達90.2％，特異性達98.4％。在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另兩種標(biāo)志物聯(lián)用，也可達到較滿意的效果。說明HGF與另外兩種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可以滿足臨床肝癌血清學(xué)診斷及早期診斷的需求。

本發(fā)明所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，檢測四個指標(biāo)篩查肝癌時，敏感度和特異性均有提高。在全部人群中篩查肝癌時，HGF、AFP、GPC3和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為92.0％，檢測早期肝癌的敏感度為86.3％，特異性為90.5％；在乙患者中篩查肝癌時，HGF、 AFP、AFU和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％；在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另外三種指標(biāo)聯(lián)用時，均可達到較高的敏感度和特異性。

本發(fā)明所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，五種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，在全人群中篩查肝癌時，其檢測全期肝癌的敏感度可達91.2％，特異性可達93％，檢測早期肝癌的敏感度為88.2％，特異性可達87.2％，在乙肝患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為76.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為66.7％，顯著優(yōu)于目前臨床肝癌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)AFP。

為了驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明將五種標(biāo)志物在肝癌病人血清，正常人血清和乙肝病人血清中的檢測值建立了模型，將全部研究對象的危險系數(shù)(RS)從小到大排列，分割為高危組(RS≥0.5)和低危組(RS<0.5)，大部分肝癌患者被正確分到高危組，散點圖趨勢明顯，說明模型結(jié)果符合事實情況。該模型可以用于分析AFP、AFU、HGF、GPC3、GGT2五種標(biāo)志物檢測值與肝癌的相關(guān)性。

本發(fā)明通過大量樣本驗證和統(tǒng)計學(xué)分析，證明HGF可以作為肝癌標(biāo)志物單獨用于肝癌的篩查和早期診斷，其檢測靈敏度和特異性均大幅優(yōu)于臨床的金標(biāo)準(zhǔn)AFP，HGF與其它一個或多個指標(biāo)的聯(lián)合使用，可作為HGF檢測的補充，進一步提高肝癌血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性。

本發(fā)明還提供了一種用于肝癌血清學(xué)檢測的ELISA試劑盒，包含HGF、AFP、AFU、GPC3、GGT2中的一對或多對單克隆抗體，可通過雙抗體夾心法在一次實驗中同時測定受試者血清中的一個或多個指標(biāo)的含量，有望開發(fā)成為肝癌血清學(xué)臨床診斷的有力工具。

定義

術(shù)語“抗體”涵蓋抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括但不限于完整的抗體和抗體片段。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地是人源化的抗體、嵌合抗體或其它遺傳改造的抗體，只要根據(jù)本發(fā)明的特征性質(zhì)仍舊保留。

抗體的“類別”是指其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。有五個主要類別的抗體：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且這些中的一些可以進一步被劃分為亞類(同種型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。

“抗體片段”是指不同于完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，所述部分結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原。抗體片段的實例包括但不限于Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab’-SH，F(xiàn)(ab')₂；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。

“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈(V_L)的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(V_H)的可變結(jié)構(gòu)域)用于本文中時，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域?？勺冚p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個結(jié)構(gòu)域包括4個構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個“高變區(qū)”(或互補決定區(qū),CDRs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且CDR可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)保持并與來自另一條鏈的CDR一起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個目的。

用于本文時，術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合部分包括來自“互補決定區(qū)”或“CDRs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域并且限定抗體的性質(zhì)。按照Kabat,E.A.,等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義確定CDR和FR區(qū)域,和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基。

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可以由重組方式產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個方面是編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的核酸，并且另一個方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的所述核酸的細(xì)胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛已知的并且包含在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的蛋白表達，以及隨后的抗體分離和通常純化為藥用純度。對于將前述抗體在宿主細(xì)胞中的表達，將編碼各個修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞,NS0細(xì)胞,SP2/0細(xì)胞,HEK293細(xì)胞,COS細(xì)胞,PER.C6細(xì)胞,酵母,或大腸桿菌細(xì)胞中進行表達，并且將所述抗體從細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)中回收。用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如在Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,等,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,分子生物技術(shù)(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-161；Werner,R.G.,J.Drug Res(藥物研究雜志).48(1998)870-880的綜述文章中描述。

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A-瓊脂糖,羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進行分離和測序。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞如HEK 293細(xì)胞,CHO細(xì)胞,或骨髓瘤細(xì)胞中，從而在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。

提供下列實施例，序列表和附圖來輔助理解本發(fā)明，其真實范圍在后附的權(quán)利要求中提出。需要理解可以在不背離本發(fā)明實質(zhì)的情況下對本發(fā)明進行改動。

附圖說明

圖1.AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2在四組受試者血清中含量統(tǒng)計圖；

圖2.在全人群篩查肝癌時AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2單獨檢測全期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖3.在全人群篩查肝癌時HGF單指標(biāo)納入受試者年齡和性別檢測全 期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖4.在全人群篩查肝癌時，雙指標(biāo)納入受試者性別檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖5.在全人群篩查肝癌時，雙指標(biāo)納入受試者年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖6.在全人群篩查肝癌時，三指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖7.在全人群篩查肝癌時，四指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖8.在全人群篩查肝癌時，五指標(biāo)聯(lián)合檢測全期及早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖9.在肝炎患者中篩查肝癌時，HGF單指標(biāo)及HGF納入受試者年齡性別檢測全期肝癌和早期肝癌的ROC曲線圖；

圖10.在肝炎患者中篩查肝癌時，雙指標(biāo)納入受試者性別檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖11.在肝炎患者中篩查肝癌時，雙指標(biāo)納入受試者年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖12.在肝炎患者中篩查肝癌時，三指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖13.在肝炎患者中篩查肝癌時，四指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖14.在肝炎患者中篩查肝癌時，五指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖15.在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF單指標(biāo)及HGF納入受試者年齡性別檢測全期肝癌和早期肝癌的ROC曲線圖；

圖16.在肝硬化患者中篩查肝癌時，雙指標(biāo)納入受試者性別或年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖17.在肝硬化患者中篩查肝癌時，三指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖18.在肝硬化患者中篩查肝癌時，四指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌 患者血清的ROC曲線圖；

圖19.在肝硬化患者中篩查肝癌時，五指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；和

圖20.AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2在肝癌病人血清，乙肝病人血清，肝硬化病人血清及正常人血清中檢測值模型驗證。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，它們只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，均屬本發(fā)明保護范圍。

實施例1：不同人群的血清收集及處理

在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，分別收集肝癌患者、乙肝患者及正常者外周血各60-300例。在實驗中收集了肝癌患者血清288例，乙肝患者血清87例，肝硬化患者80例，正常者血清241例。

外周血收集1小時內(nèi)，3000g離心5-10分鐘，取血清移入新的離心管，-80℃冰箱保存。

實施例2：本發(fā)明標(biāo)志物或其組合的診斷應(yīng)用

使用商購的試劑盒(詳細(xì)信息如下所示)，按照制造商的使用說明，通過ELISA檢測待測血清中AFP、AFU、GPC3、GGT2和HGF的濃度。

1)診斷試驗評價指標(biāo)及選擇

采用靈敏度(真陽性率，Sensitivity)、特異度(真陰性率，Specificity)、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)評價待測指標(biāo)的診斷效果：

靈敏度＝TP/(TP+FN)×100％

特異度＝TN/(TN+FP)×100％

陽性預(yù)測值＝TP/(TP+FP)×100％

陰性預(yù)測值＝TN/(TN+FN)×100％

正確指數(shù)(Youden index)＝(靈敏度+特異度)-100％

其中，TN(true negative)＝真陰性；FP(false positive)＝假陽性；TP(true positive)＝真陽性；FN(false negative)＝假陰性。

選用受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)對所有可能的切點作計算顯示靈敏度和特異度之間相互關(guān)系。通過改變切點，獲得多對真陽性率(即靈敏度)與假陽性率(1-特異度)值，以假陽性率為橫坐標(biāo)，以靈敏度為縱坐標(biāo)，繪制ROC曲線，從而動態(tài)、客觀地反映診斷系統(tǒng)的效能。ROC曲線下面積(AUC)表示診斷系統(tǒng)中陽性和 陰性診斷結(jié)果分布的重疊程度，反映診斷系統(tǒng)區(qū)分陽性和陰性診斷結(jié)果的能力大小，也就是診斷試驗的價值大小。通過找到ROC曲線上正確指數(shù)最大點確定診斷指標(biāo)臨界值，并通過Bootstrap方法隨機抽樣1000次，確定臨界值95％可信區(qū)間。

2)統(tǒng)計模型的構(gòu)建

通過logistic回歸模型實現(xiàn)單指標(biāo)、多指標(biāo)聯(lián)合診斷試驗HCC，并分別應(yīng)用于健康正常人、HBV感染者、肝硬化患者，在三組和病人群中進行ROC分析。根據(jù)疾病狀態(tài)建立logistic回歸模型，通過形成的預(yù)測概率或聯(lián)合預(yù)測因子為分析指標(biāo)，并結(jié)合非參數(shù)模型和雙正態(tài)模型建立ROC曲線。

Logistic回歸模型：

且有

常數(shù)項β₀表示暴露劑量為0時個體發(fā)病(HCC)與不發(fā)病(HBV感染者、肝硬化患者、健康人，或三者之和）概率之比的自然對數(shù)?；貧w系數(shù)β₀，β₁，…β_n表示自變量xi改變一個單位時的改變量。對于研究變量(5個蛋白)在某個連續(xù)的截斷點P_k有：βY≥g(P_k)，Y_ik＝1；βY|g(P_k)，Y_ik＝0。而同于多指標(biāo)結(jié)合的診斷試驗，其圖形為一個平面從而獲得靈敏度和特異度構(gòu)建ROC曲線。

分析和統(tǒng)計結(jié)果參見附圖。

結(jié)果和討論：

早期肝癌檢出率低的現(xiàn)狀反映出目前肝癌的診斷方法還有很大局限性。當(dāng)前肝癌的診斷主要依靠血清學(xué)檢查和影像學(xué)診斷。血清學(xué)檢查主要檢測血清中的腫瘤標(biāo)志物，目前主要是依靠AFP的檢測，但AFP在小肝癌中的敏感度僅為40％左右。

利用特異性結(jié)合于人肝癌標(biāo)志物的抗體或其單鏈抗體片段，在AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2五個標(biāo)志物中，進行HGF單指標(biāo)檢測，以及HGF聯(lián)合其它標(biāo)志物進行雙指標(biāo)、三指標(biāo)、四指標(biāo)及五指標(biāo)檢測時，能夠 與乙肝患者、肝硬化患者和健康者區(qū)別開來而檢測肝癌。

在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌均有很高的敏感度和特異性。通過利用特異性結(jié)合于HGF的抗體或其單鏈抗體片段，利用所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，使用HGF單指標(biāo)在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，其檢測全期肝癌的敏感度為90.3％，特異性為90.5％，在巴塞羅那分期的早期(A期)肝癌患者中，檢測的敏感度為90.2％，特異性為84.1％，納入受試者的年齡和性別后，HGF在全期肝癌中的敏感度為91.3％，特異性為90.9％，在早期肝癌中的敏感度為86.3％，特異性為90.5％；在乙肝患者中篩查肝癌，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌的敏感度為94.4％，特異性為91.8％，檢測早期肝癌的敏感度為90.2％，特異性為91.9％，納入受試者年齡性別后，檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為95.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為90.2％；在肝硬化患者中篩查肝癌，HGF單指標(biāo)檢測全期肝癌和早期肝癌的敏感度和特異性均可達72％和73％以上，顯著優(yōu)于臨床常用的AFP，說明單獨檢測血清中HGF的含量，必要時并綜合受試者年齡和性別可以滿足臨床肝癌診斷的需要。

檢測兩個指標(biāo)在全部人群篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與AFP、AFU、GPC3、GGT2四個標(biāo)志物之一分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到很高的敏感度和特異性，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合。

特別地，檢測兩個指標(biāo)在全部人群篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為93.1％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為87.2％，特異性為94.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為90.6％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為93.1％；只納入受試者年齡后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為92.3％，特異性為90.9％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為91.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為 90.3％，特異性為90.9％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為92.3％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86％以上的敏感度和和84％以上的特異性。

而在乙肝患者中篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.9％，特異性為95.2％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％。；只納入受試者年齡進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為95.1％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86.3％以上的敏感度和和83.9％以上的特異性。在肝硬化患者中篩查肝癌時，納入年齡或性別之一后，HGF與其他四個標(biāo)志物分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到較高的敏感度和特異性。說明HGF與其他四個指標(biāo)單獨聯(lián)合檢測，并綜合受試者年齡或性別后，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合。

檢測三個指標(biāo)在全部人群中篩查肝癌，檢測全期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，HGF+AFP+GGT2聯(lián)用，HGF+AFU+GPC3聯(lián)用時，均可達到91.8％以上的敏感度和90.2％以上的特異性，檢測早期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，以及HGF+AFP+GGT2聯(lián)用時，均可達86.3％以上的敏感度和85.5％以上的特異性，在乙肝患者中篩查肝癌時，HGF+AFP+AFU，HGF+AFP+GPC3，HGF+AFP+GGT2，HGF+AFU+GPC3以及HGF+GPC3+GGT2聯(lián)合應(yīng)用，檢測全期肝癌的敏感度均可達92.3％以上，特異性可達93.5％以上，檢測早期肝癌也有較好效果，特別是HGF+AFP+AFU的組合，敏感度達90.2％，特異性達98.4％；在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另兩種標(biāo)志物聯(lián)用， 也可達到較滿意的效果，說明HGF與另外兩種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可以滿足臨床肝癌血清學(xué)診斷及早期診斷的需求。

檢測四個指標(biāo)篩查肝癌時，敏感度和特異性均有提高，在全部人群中篩查肝癌時，HGF、AFP、GPC3和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為92.0％，檢測早期肝癌的敏感度為86.3％，特異性為90.5％，在乙患者中篩查肝癌時，HGF、AFP、AFU和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另外三種指標(biāo)聯(lián)用時，均可達到較高的敏感度和特異性。

五種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，敏感度和特異性進一步提高，在全人群中篩查肝癌時，其檢測全期肝癌的敏感度可達91.2％，特異性可達93％，檢測早期肝癌的敏感度為84.3％，特異性可達87.2％，在乙肝患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為76.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為66.7％。顯著優(yōu)于目前臨床肝癌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)AFP。

為了驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明將五種標(biāo)志物在肝癌病人血清，正常人血清和乙肝病人血清中的檢測值建立了模型，將全部研究對象的危險系數(shù)(RS)從小到大排列，分割為高危組(RS≥0.5)和低危組(RS<0.5)，大部分肝癌患者被正確分到高危組，散點圖趨勢明顯，說明模型結(jié)果符合事實情況。該模型可以用于分析AFP、AFU、HGF、GPC3、GGT2五種標(biāo)志物檢測值與肝癌的相關(guān)性。

本發(fā)明通過大量樣本驗證和統(tǒng)計學(xué)分析，通過利用單克隆抗體或其單鏈抗體片段，證明HGF可以作為肝癌標(biāo)志物單獨用于肝癌的篩查和早期診斷，其檢測靈敏度和特異性均大幅優(yōu)于臨床的金標(biāo)準(zhǔn)AFP，HGF與其它一個或多個指標(biāo)的聯(lián)合使用，可作為HGF檢測的補充，進一步提高肝癌血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性。

雖然為了清楚的理解，已經(jīng)借助于附圖和實施例在一些細(xì)節(jié)上描述了上述發(fā)明，但是說明書和實施例不應(yīng)當(dāng)被視為限制本發(fā)明的范圍。本文中引用的所有專利和科學(xué)文獻的公開內(nèi)容通過引用完整地清楚并入。