本發(fā)明屬于微量金屬生物利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)浮游植物對(duì)銅配合物生物可利用性的方法。

背景技術(shù)：

微量金屬對(duì)于海洋生物至關(guān)重要，其生物地球化學(xué)循環(huán)及在海洋中傳遞會(huì)影響食物鏈中的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞及海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。大型海洋化學(xué)研究計(jì)劃如geotraces已開展微量金屬及其同位素在海洋中分布、轉(zhuǎn)化及如何影響海洋生態(tài)系統(tǒng)功能、全球碳循環(huán)和氣候變化研究。海水中金屬主要以強(qiáng)絡(luò)合物配合形式存在，只有少部分以自由離子形式，而它們卻只有自由離子形態(tài)才能被浮游植物所吸收利用。因此，探討浮游植物對(duì)金屬配合物的生物可利用性具有重要的生物學(xué)意義。

銅離子是上述微量金屬中的典型代表，目前常用的銅離子檢測(cè)方法有2，9-二甲基-1，10-菲啰啉分光光度法方法、火焰原子吸收法、apdc-mibk萃取火焰原子吸收法、石墨爐原子吸收法、陽極溶出伏安法、示波極譜法、icp-ms等。這些檢測(cè)技術(shù)精度高，但存在需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，檢測(cè)工作量大，受限因素多等缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種檢測(cè)浮游植物對(duì)銅配合物生物可利用性的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種檢測(cè)浮游植物對(duì)銅配合物生物可利用性的方法，包括如下步驟：

(1)取近海典型浮游植物于f/2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，該f/2培養(yǎng)基中含有用以標(biāo)記近海典型浮游植物的cds，獲得cds標(biāo)記培養(yǎng)液，具體培養(yǎng)條件如下：f/2培養(yǎng)基中含有14～16mg/lcds，置于光照強(qiáng)度為130～150μmolphotons(m²s)^-1，光暗比為12～15h∶8～10h，溫度為18～20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以80～120rpm攪拌海藻懸浮液模擬海水流動(dòng)，同時(shí)減少cds在容器壁上吸附；

(2)以二水合氯化銅溶液作為銅離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，根據(jù)上述cds在不同濃度的銅離子標(biāo)準(zhǔn)使用液中的熒光強(qiáng)度變化的情況，獲得線性工作曲線：y＝2294.9x+876.32，線性范圍：20-1500ng/l，其中x表示銅離子濃度，y表示熒光強(qiáng)度變化；

(3)將cds標(biāo)記培養(yǎng)液分為兩組，每組均分為相同的若干份，其中：其中一份作為對(duì)照，一份加入cu²⁺，其余的分別加入不同的銅配合物；上述兩組中的第一組置于暗處，第二組置于氙燈下連續(xù)光照2h，每固定時(shí)間間隔取出，觀察第二組相對(duì)第一組的不同的銅配合物的熒光強(qiáng)度變化；

(4)將步驟(3)所得不同的銅配合物的熒光強(qiáng)度變化代入步驟(2)的線性工作曲線，獲得相應(yīng)的銅離子濃度，即可得出浮游植物對(duì)不同銅配合物的利用情況。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述近海典型浮游植物包括威氏海鏈藻ccma-102和小球藻ccma-410。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述f/2培養(yǎng)基由濃度為75.0g/l硝酸鈉母液、濃度為5.0g/l的磷酸鈉母液、濃度為30.0g/l的硅酸鈉母液、微量元素母液、維生素母液和海水組成，且硝酸鈉母液、磷酸鈉母液、硅酸鈉母液、微量金屬母液、維生素母液和海水的體積比為2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化鐵3.15g/l、硫酸銅9.8g/l、鉬酸鈉6.3g/l、硫酸鋅22.0g/l、氯化鈷10.0g/l、氯化錳180.0g/l，維生素母液含有維生素b121.0g/l、生物素0.1g/l和鹽酸硫胺0.2g/l。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟(3)中的固定時(shí)間間隔為30min。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述銅配合物包括cu-por、cu-h2lp和edta-cu。

本發(fā)明的有益效果：不僅能夠克服分光光度法、原子吸收法、陽極溶出伏安法、示波極譜法和icp-ms等技術(shù)的缺陷，且具檢測(cè)線性范圍廣、精密度高、檢測(cè)限低等優(yōu)勢(shì)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中碳量子點(diǎn)對(duì)金屬離子熒光猝滅的選擇性圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中碳量子點(diǎn)與銅離子反應(yīng)機(jī)理圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中碳量子點(diǎn)對(duì)銅配合物的熒光信號(hào)穩(wěn)定圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中暗處理組胞內(nèi)銅離子濃度圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中光照組胞內(nèi)銅離子濃度圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。

實(shí)施例1：

1、碳量子點(diǎn)(cds)對(duì)金屬離子熒光猝滅的選擇性

配制一系列10μmol·l^-1離子溶液：cu²⁺、fe³⁺、hg²⁺、ag⁺、ni²⁺、zn²⁺、co²⁺、cd²⁺、pb²⁺、k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺。然后往各離子溶液體系中分別加入cds考察體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度，如圖1所示，其中碳量子點(diǎn)與銅離子反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。

2、碳量子點(diǎn)對(duì)銅配合物的熒光信號(hào)穩(wěn)定性分析：

分別配制1mmol·l^-1卟啉、鄰苯二甲酸、乙二胺四乙酸，然后與cu²⁺按1∶1比例置于40％環(huán)境光度下絡(luò)合2d，cu-por、cu-h2lp、edta-cu和cu²⁺各取5ml于10ml比色管中，依次加入cds后每隔5min測(cè)一次熒光信號(hào)，連續(xù)測(cè)定2h，結(jié)果如圖3所示。

3、本實(shí)施例的具體檢測(cè)方法如下：

(1)取近海典型浮游植物(威氏海鏈藻ccma-102和小球藻ccma-410)于含有cds的f/2培養(yǎng)基(由濃度為75.0g/l硝酸鈉母液、濃度為5.0g/l的磷酸鈉母液、濃度為30.0g/l的硅酸鈉母液、微量元素母液、維生素母液和海水組成，且硝酸鈉母液、磷酸鈉母液、硅酸鈉母液、微量金屬母液、維生素母液和海水的體積比為2∶2∶2∶2∶1∶2000，其中微量元素母液中含有氯化鐵3.15g/l、硫酸銅9.8g/l、鉬酸鈉6.3g/l、硫酸鋅22.0g/l、氯化鈷10.0g/l、氯化錳180.0g/l，維生素母液含有維生素b121.0g/l、生物素0.1g/l和鹽酸硫胺0.2g/l)中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得cds標(biāo)記培養(yǎng)液；具體培養(yǎng)條件如下：f/2培養(yǎng)基中含有15mg/lcds，置于光照強(qiáng)度為140μmolphotons(m²s)^-1，光暗比為14h：10h，溫度為19℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以100rpm攪拌海藻懸浮液模擬海水流動(dòng)，同時(shí)減少cds在容器壁上吸附；

(2)以二水合氯化銅溶液作為銅離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，根據(jù)上述cds在不同濃度的銅離子標(biāo)準(zhǔn)使用液中的熒光強(qiáng)度變化的情況，獲得線性工作曲線：y＝2294.9x+876.32，線性范圍：20-1500ng/l，其中x表示銅離子濃度，y表示熒光強(qiáng)度變化；

(3)將cds標(biāo)記培養(yǎng)液分為兩組，每組均分為相同的5份，其中：其中一份作為對(duì)照，一份加入cu²⁺，其余的分別加入銅配合物cu-por、cu-h2lp和edta-cu，上述銅配合物和cu²⁺的配制方法如下：分別稱取0.0703g原卟啉(pro)、0.1661鄰苯二甲酸(h2lp)、0.3722g乙二胺四乙酸二鈉(edta-na2)、0.0341g二水合氯化銅溶于50ml水中，混合均勻儲(chǔ)存于試劑瓶中。然后與cu²⁺按1∶1比例置于40％環(huán)境光度下絡(luò)合2d；上述兩組中的第一組置于暗處，第二組置于氙燈下連續(xù)光照2h，每30min取出，觀察第二組相對(duì)第一組的不同的銅配合物的熒光強(qiáng)度變化，如圖4和5所示；

(4)將步驟(3)所得不同的銅配合物的熒光強(qiáng)度變化代入步驟(2)的線性工作曲線，獲得相應(yīng)的銅離子濃度，即可得出浮游植物對(duì)不同銅配合物的利用情況。

為了驗(yàn)證本發(fā)明方法中的碳量子點(diǎn)對(duì)銅離子濃度檢測(cè)的適用性，本實(shí)施例另外按傳統(tǒng)的電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)與該方法對(duì)實(shí)際水樣分析測(cè)定，結(jié)果如表1所示：

表1分析實(shí)際水樣中的銅離子濃度

綜上，本實(shí)施例的方法cds熒光信號(hào)穩(wěn)定、尺寸小，較其他的熒光量子點(diǎn)具有水溶性好和生物毒性低等優(yōu)勢(shì)，可有效克服分光光度法、原子吸收法、陽極溶出伏安法、示波極譜法和icp-ms等技術(shù)缺陷。以二水合氯化銅溶液作為銅離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，不同濃度范圍內(nèi)可得線性工作曲線：y＝2294.9x+876.32，線性范圍：20-1500ng/l。此法與電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異且檢測(cè)限低至19.5ng/l。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。