本發(fā)明屬于熒光顯微鏡成像領(lǐng)域，具體涉及一種新型全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置及標定方法。

背景技術(shù)：

全內(nèi)反射熒光顯微鏡(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,tirfm)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)，該技術(shù)利用全內(nèi)反射時產(chǎn)生的隱失波來激發(fā)熒光分子，以觀察熒光標記樣品在靠近交界面的極薄區(qū)域。由于隱失波場存在能量在軸向上呈指數(shù)衰減的特性，使得可觀察區(qū)域的動態(tài)范圍通常在200nm以下，有效地控制了激發(fā)體積，大大降低了背景光噪聲干擾，因此具有其它光學(xué)成像技術(shù)無法比擬的高信噪比和對比度。故此項技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于細胞膜表面物質(zhì)的動態(tài)觀察。

根據(jù)隱失波場的特性可知，當入射角越大時，產(chǎn)生的隱失波場的入射深度越淺。故每張全內(nèi)反射熒光顯微鏡拍攝得到的二維投影圖像中都含有豐富的三維信息。因此，確定出各個入射角對應(yīng)的入射深度就顯得尤為重要。

目前市場上的商業(yè)全內(nèi)反射熒光顯微鏡無法提供激發(fā)光的入射角與tirf入射深度的對應(yīng)信息。盡管全內(nèi)反射熒光顯微鏡有個理論指數(shù)衰減模型，但這只是理想情況中的光學(xué)模型，并不適用于實際情況。此外，由于實驗條件的差異，不同顯微鏡的軸向衰減模型也不盡相同。所以，建議一種方便快捷的全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的系統(tǒng)標定方法就顯得尤為重要。

目前，不少研究人員付出過精力來研究標定全內(nèi)反射熒光顯微鏡的入射深度，比較常用的兩種方法是熒光小珠子法和熒光大珠子法。熒光小珠子標定法的原理圖如圖1所示，其原理是選取a，b等若干個點放置熒光小珠子，每二者距離25nm。以一定的振鏡電壓v發(fā)射光線，測量得到a，b等處熒光的光強為i(a)和i(b)。將測得光強與熒光小珠子所在位置聯(lián)立擬合曲線，得到i(z)-z曲線，根據(jù)公式(1)可以得到滲透深度d。

其難點在于需要特殊的工具來確保熒光小珠子之間的距離為25nm且需要制作工藝復(fù)雜且直徑很小的熒光小珠子。

熒光大珠子標定法的原理圖如圖2所示，其原理是一定入射角下的激發(fā)光激發(fā)的隱失波場深度一定，當熒光珠子直徑足夠大，利用拍得的投影圖即可推算出真實的入射深度。

這兩種方法雖然能得到較好的標定結(jié)果，但是需要特殊的熒光珠子或?qū)嶒灩ぞ?，且后期還需要進行復(fù)雜的圖像處理數(shù)據(jù)擬合等過程，使用方法不太方便。

環(huán)狀全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用一個環(huán)狀光圈形成tirf圖像，它的優(yōu)勢在于減少了干涉條紋，快速多角度成像減少了3d成像以及單角度成像產(chǎn)生的色差。

epi指的是垂直式熒光顯微鏡。激發(fā)光以近乎垂直交界面的形式入射，使得進入樣本區(qū)域的熒光強度仍舊非常強，可激發(fā)樣本上標記出的全部熒光染料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述，本發(fā)明提供了一種全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置，該裝置結(jié)構(gòu)簡單、成本低，操作方便靈活。

一種全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置，包括：

載玻片；

方形蓋玻片，所述方形蓋玻片蓋于所述載玻片的上表面上且右側(cè)邊對齊布置；

玻璃片，所述玻璃片置于所述載玻片上且左側(cè)邊接觸并對齊布置，所述玻璃片的下表面支撐于所述方向蓋玻片上；

所述玻璃片的下表面均勻地涂布有熒光染料。

所述的玻璃片與載玻片的尺寸相同。

作為優(yōu)選，所述的玻璃片的尺寸為25mm×75mm，為了克服熒光成像的點擴散效應(yīng)，玻璃片上的熒光染料的厚度為8～12nm。

作為優(yōu)選，所述的載玻片為electronmicroscopysciences公司生產(chǎn)的規(guī)格為25mm×75mm的載玻片。

作為優(yōu)選，所述的方形蓋玻片為fisherbrand公司生產(chǎn)的規(guī)格為18mm×18mm厚度為0.17mm的方形蓋玻片。

本發(fā)明還提供了一種利用上述的標定裝置對全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度進行標定的方法，具體步驟為：

(1)將標定裝置置于可自由切換入射角的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的載物臺上；

(2)將顯微鏡可視場區(qū)域邊界在均勻涂有熒光染料的玻璃片的相應(yīng)位置設(shè)為b點，將b點距離載玻片的距離定為z0；

(3)選擇顯微鏡可視場區(qū)域范圍內(nèi)的任一一點作為標定的熒光目標點a，則熒光目標點a的實際深度za可表示為：

za＝z0+xtanα

其中，x為熒光目標點a與可視場區(qū)域邊界之間的距離，α為均勻涂有熒光染料的玻璃片與載玻片之間的夾角；

(4)固定可視場區(qū)域，改變顯微鏡激發(fā)光的入射角θi，得到該入射角下的tirfm圖像，進而得到熒光目標點a在tirfm圖像的強度ia(tirfm)(θi)；

(5)改變顯微鏡激發(fā)光垂直射入，得到epi圖像，進而得到熒光目標點a在epi圖像的強度ia(epi)，則熒光目標點a在tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值表示為：

其中，ia(0,θi)表示在激發(fā)光的入射角為θi時隱失波場在兩種折射率的交界面處的光強，dp(θi)表示激發(fā)光的入射角為θi時的隱失波場的滲透深度，e約為2.718，對于入射角θi是個常量。

(6)選取一列不同的熒光目標點，通過步驟(4)與步驟(5)的方法獲得每個熒光目標點在強度tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值，再對所有熒光目標點在強度tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值進行線性擬合，得到擬合直線的斜率的負倒數(shù)為入射角θi對應(yīng)的滲透深度dp(θi)。

本發(fā)明為全內(nèi)反射熒光顯微鏡標定入射角與滲透深度的對應(yīng)關(guān)系提供了一種新思路，能有效確定全內(nèi)反射熒光顯微鏡不同入射角下的入射深度。本發(fā)明具有操作簡便、裝置簡單和標定效率高等特性。對實驗條件無特殊要求，適用于各種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的標定。

附圖說明

圖1是背景技術(shù)中熒光小珠子標定方法原理圖；

圖2是背景技術(shù)中熒光大珠子標定方法原理圖；

圖3是本發(fā)明全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置側(cè)視圖；

圖4是本發(fā)明全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定方法原理圖。

具體實施方式

為了更為具體地描述本發(fā)明，下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。

建立如圖1所示的全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置，構(gòu)建標定裝置的主要設(shè)備為：尺寸為25mm×75mm且單面均勻涂有10nm厚的熒光染料的玻璃片、electronmicroscopysciences公司生產(chǎn)的規(guī)格為25mm×75mm的載玻片以及fisherbrand公司生產(chǎn)的規(guī)格為18mm×18mm厚度為0.17mm的方形蓋玻片。在載玻片右側(cè)疊放方形蓋玻片，使兩塊玻片的右邊緣對齊。然后在上方疊放玻璃片，并保證玻璃片的左邊緣與載玻片左邊緣對齊，且玻璃片的左端架在方形蓋玻片上。從而保證涂有染料的玻片與底部載玻之間傾斜角α＝0.18°。

利用上述標定裝置進行全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度進行標定的原理圖如圖4所示，①表示樣品所處的液體環(huán)境，在本標定實驗中，該區(qū)域的液體為水，折射率為1。②表示放置于顯微鏡載物臺上的載玻片，其折射率為1.52。③表示的是顯微鏡目鏡的可視場區(qū)域，目鏡與載玻片之間為折射率和載玻片相匹配的油浸(即油浸折射率也為1.52)。

利用上述標定裝置進行全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度進行標定的方法為：

步驟1，在全內(nèi)反射熒光顯微鏡的目鏡上涂上目鏡油，該目鏡油與載玻片的折射率相匹配；

步驟2，將標定裝置置于可自由切換入射角的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的載物臺上；

步驟3，將顯微鏡可視場區(qū)域邊界在均勻涂有熒光染料的玻璃片的相應(yīng)位置設(shè)為b點，將b點距離載玻片的距離定為z0；

步驟4，選擇顯微鏡可視場區(qū)域范圍內(nèi)的任一一點作為標定的熒光目標點a，則熒光目標點a的實際深度za可表示為：

za＝z0+xtanα

其中，x為熒光目標點a與可視場區(qū)域邊界之間的距離，α為均勻涂有熒光染料的玻璃片與載玻片之間的夾角；

步驟5，固定可視場區(qū)域，改變顯微鏡激發(fā)光的入射角θi，得到該入射角下的tirfm圖像，進而得到熒光目標點a在tirfm圖像的強度ia(tirfm)(θi)；

步驟6，改變顯微鏡激發(fā)光垂直射入，得到epi圖像，進而得到熒光目標點a在epi圖像的強度ia(epi)，則熒光目標點a在tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值表示為：

其中，ia(0,θi)表示在激發(fā)光的入射角為θi時隱失波場在兩種折射率的交界面處的光強，dp(θi)表示激發(fā)光的入射角為θi時的隱失波場的滲透深度，e為2.178，對于入射角θi是個常量。

步驟7，選取一列不同的熒光目標點，通過步驟(4)與步驟(5)的方法獲得每個熒光目標點在強度tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值，再對所有熒光目標點在強度tirfm圖像和epi圖像中的強度比的對數(shù)值進行線性擬合，得到擬合直線的斜率的負倒數(shù)為入射角θi對應(yīng)的滲透深度dp(θi)。

實施例1

將上述建立的全內(nèi)反射熒光顯微鏡入射深度的標定裝置置于thornlabs公司的掃描振鏡系統(tǒng)中，而后激光從mellesgriot公司生產(chǎn)的激光器發(fā)出，經(jīng)過單模光纖導(dǎo)入thornlabs公司的準直透鏡完成準直；經(jīng)過準直后的光束入射到thornlabs公司的掃描振鏡系統(tǒng)中進行光路偏折，之后入射到thornlabs公司的掃描透鏡中進行聚焦。由掃描透鏡射出的光束經(jīng)過第一場鏡擴束之后平行射出經(jīng)thornlabs公司的聚焦鏡和二色鏡聚焦和反射后，光束聚焦于olympus公司生產(chǎn)的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的物鏡上并投射于其樣品臺上。待測樣品所發(fā)射的信號光被全內(nèi)反射熒光顯微鏡的纖維物鏡收集，先通過二色鏡再依次經(jīng)過濾波片濾去雜散光，經(jīng)過第二場鏡聚焦，最終被olympus公司的ccd探測器采集，ccd探測器記錄此時探測到的光強信號。改變控制掃描振鏡的電壓即可得到這個視場中不同入射角下的全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像。最后使入射光束垂直射入，拍攝得同一個視場下的epi圖像。至此，標定所需的圖像數(shù)據(jù)準備完全。

對于拍攝得到的全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像中的任何一個目標點，根據(jù)傾斜面的傾角可算得其相對于載玻片的軸向深度。

對于每張全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像，取一系列軸向深度不同的目標點，將該點在全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像中對應(yīng)的強度與在epi圖像中對應(yīng)的強度相比取對數(shù)，即可得到一系列的線性關(guān)系式，對線性關(guān)系式進行擬合，得到直線的斜率的負倒數(shù)為入射角對應(yīng)的滲透深度。

以上所述的具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的最優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充和等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。