本發(fā)明涉及液體活檢病理學(xué)檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)中的應(yīng)用及試劑盒。
背景技術(shù)：
：宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的結(jié)果是宮頸癌。宮頸癌是全球女性的第二大癌癥殺手，我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率更是發(fā)達(dá)國(guó)家的6倍，且呈年輕化趨勢(shì)。我國(guó)每年約有15萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例，約占全球患者總數(shù)的1/3，近8萬(wàn)婦女因此死去。這說(shuō)明，宮頸癌成中國(guó)女性的殺手之一，摧殘數(shù)以萬(wàn)計(jì)女性的健康，影響到中國(guó)千萬(wàn)家庭的幸福生活。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在“超速”發(fā)展，大有趕超宮頸癌的趨勢(shì)，并且其發(fā)病年齡也在逐漸年輕化。提高癌癥治愈率的關(guān)鍵在于“三早”(早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療)。有證據(jù)表明，如果女性適時(shí)地進(jìn)行檢查，在早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌并且將其扼殺在萌芽階段的幾率將會(huì)大大增高。目前檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的篩查方法比較繁瑣。我國(guó)推薦的宮頸癌篩查方法諸如醋酸白染色、巴氏涂片、陰道鏡、液基細(xì)胞學(xué)(TCT)、人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)等，檢測(cè)步驟繁瑣復(fù)雜而且收費(fèi)較高，診治脫節(jié)，診斷符合率低，性?xún)r(jià)比低等不足。這就需要尋求更簡(jiǎn)便易行和經(jīng)濟(jì)有效的方法來(lái)彌補(bǔ)以上不足。另外，目前臨床檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的篩查方法都是針對(duì)單個(gè)的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的敏感度和特異度并不高，對(duì)宮頸癌的診斷結(jié)果不準(zhǔn)確。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶同時(shí)作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生，具有敏感度和特異度高的特點(diǎn)，有助于提高對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可用于對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的篩查、早診、預(yù)后判斷及指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域，具有較高的敏感度和特異度。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。一種宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，其以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，該宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒包括：用于檢測(cè)原血紅素的原血紅素檢測(cè)試劑膜和用于檢測(cè)β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜。本發(fā)明的原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)中的應(yīng)用及試劑盒的有益效果是：相較于以單個(gè)的原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物，本發(fā)明首次提出將原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，應(yīng)用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的情況，令人驚喜的發(fā)現(xiàn)，相較于單獨(dú)地以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)的敏感度(87％)、特異度(95％)以及約登指數(shù)(0.82)均明顯提高，有助于提高對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的原血紅素比色板的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)中的應(yīng)用及試劑盒進(jìn)行具體說(shuō)明。原血紅素是血紅素家族的重要成員，是血紅素在人體內(nèi)的存在形式，是血紅素結(jié)合蛋白的活性基。它由原卟啉IX與二價(jià)鐵離子結(jié)合而成。據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和功能不同又分為原血紅素a、b、c，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中被釋放，屬于醫(yī)學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志(medicine-relatedbiomarker)。致癌因素導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞糖代謝異常，腫瘤細(xì)胞的耗糖量是正常細(xì)胞的十倍，而且磷酸戊糖途徑代謝活躍，稱(chēng)為“瓦博格氏效應(yīng)”。在腫瘤細(xì)胞能量代謝電子傳遞過(guò)程中，其間芬頓氏反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基、過(guò)氧自由基等對(duì)線(xiàn)粒體造成氧化損傷，改變細(xì)胞蛋白的極性量值，使位居線(xiàn)粒體基膜中血紅素結(jié)合蛋白疏水核(又稱(chēng)血紅素口袋)中的原血紅素釋放，導(dǎo)致宮頸部位的分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體液中原血紅素含量增加，其釋放量與細(xì)胞癌變程度呈正相關(guān)。原血紅素具有過(guò)氧化物酶的作用，可以使過(guò)氧化物脫氧，進(jìn)而使供氫體氧化成含顯色集團(tuán)的物質(zhì)。用比色法測(cè)定宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體中原血紅素含量，即可顯示宮頸上皮細(xì)胞是否存有異質(zhì)性增生。β-葡萄糖醛酸苷酶是宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生過(guò)程中活性增強(qiáng)的一種生物標(biāo)志物。它是由四個(gè)相同亞單位組成的糖蛋白，廣泛存在于人體的各種組織及體液中，生理狀態(tài)下具有參與細(xì)胞增生的作用，而在病理狀態(tài)下，β-葡萄糖醛酸苷酶可以作用于葡萄糖醛酸甙的β一糖苷鍵，水解癌周結(jié)締組織中的蛋白多糖及糖蛋白，破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的防御作用，有利于癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與擴(kuò)散。有關(guān)宮頸癌β-葡萄糖醛酸苷酶活性增高的機(jī)制，一是為適應(yīng)腫瘤生存引起的機(jī)體對(duì)酶代謝的改變，如癌細(xì)胞分泌β-葡萄糖醛酸苷酶增強(qiáng)，癌細(xì)胞膜對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶通透性改變，對(duì)該酶抑制劑的缺乏或增加；二是腫瘤組織浸潤(rùn)并且破壞周?chē)＝M織，引起其它組織酶生成異常，或因腫瘤壓迫梗阻引起該酶的大量釋放，造成β-葡萄糖醛酸苷酶增高。通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用形態(tài)學(xué)細(xì)胞水平的免疫組化技術(shù)、亞細(xì)胞水平的免疫電鏡技術(shù)和機(jī)能學(xué)的ELISA技術(shù)，對(duì)宮頸癌組織及宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體中β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行的同步檢測(cè)顯示，β-葡萄糖醛酸苷酶在宮頸癌患者組織及宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體中增高，是由癌細(xì)胞自身的生物學(xué)特性決定的，緣于腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)其快速過(guò)度增殖和異常分化的自主性生長(zhǎng)的生存方式而產(chǎn)生的自我調(diào)控，由其自身獨(dú)特的生長(zhǎng)方式?jīng)Q定并成為內(nèi)因的。在最適溫度與PH條件下，酚酞葡萄糖醛酸甙經(jīng)β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解，釋放出游離酚酞。加堿性溶液終止反應(yīng)，酚酞呈紅色。觀察酚酞指示的顏色變化，即可了解樣本液中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，顯示宮頸上皮細(xì)胞是否存有惡變及其程度。但是，以單個(gè)的原血紅素a/b/c作為標(biāo)志物檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的特異度比較低，而以單個(gè)的β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的敏感度比較低。鑒于此，一方面，本發(fā)明提供了原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備宮頸上皮細(xì)胞細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。再進(jìn)一步地，上述的宮頸上皮細(xì)胞為宮頸鱗狀上皮細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供的原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶可作為聯(lián)合標(biāo)志物在檢測(cè)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞或?qū)m頸柱狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生中進(jìn)行應(yīng)用，根據(jù)對(duì)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的檢測(cè)結(jié)果反映出檢測(cè)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生情況。此外，進(jìn)一步地，上述的宮頸上皮細(xì)胞細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒使用宮頸部位的分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體作為檢驗(yàn)樣本，檢測(cè)樣本內(nèi)是否含有異質(zhì)性增生的宮頸上皮細(xì)胞例如宮頸鱗狀上皮細(xì)胞或?qū)m頸柱狀上皮細(xì)胞。本發(fā)明首次提出將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生(例如檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生尤其是宮頸鱗狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生或?qū)m頸柱狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生)。相較于單獨(dú)地以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生，這兩種標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果可相互印證，相互補(bǔ)充，從而彌補(bǔ)其各自的不足，因而具有更高的敏感度和特異度，有助于提高對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。另一方面，本發(fā)明還提供了一種宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，該宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒包括：用于檢測(cè)原血紅素的原血紅素檢測(cè)試劑膜和用于檢測(cè)β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜。本發(fā)明所提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒可對(duì)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的標(biāo)志物原血紅素和β葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。其可用于對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生(例如宮頸鱗狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生或?qū)m頸柱狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生)引起的宮頸癌的篩查、早診、預(yù)后判斷及指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域，具有較高的敏感度和特異度。進(jìn)一步地，上述宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒還包括樣本前處理液，該樣本前處理液由pH為6.8-7.8、濃度為0.05mol/L的Tris-Hcl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)緩沖液與EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)混合制得。優(yōu)選地，Tris-Hcl緩沖液的pH為7.4。優(yōu)選地，EDTA在樣本前處理液的濃度為0.01-0.03mol/L，更優(yōu)選地，EDTA在樣本前處理液的濃度為0.02mol/L。進(jìn)一步地，上述的原血紅素檢測(cè)試劑膜由以下方法制得：(1)將聚乙烯吡咯烷酮與磷酸緩沖液混合，得到第一混合液；(2)將原血紅素空白試劑膜浸泡于上述第一混合液中，去除上述原血紅素空白試劑膜的水分后，得到原血紅素試劑膜半成品；其中，去除上述原血紅素空白試劑膜的水分為：淋去原血紅素空白試劑膜上的多余試劑，烘干，得到原血紅素試劑膜半成品，當(dāng)然，也可按其他的方法將浸泡后的原血紅素空白試劑膜的水分除去，其也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。(3)將上述原血紅素試劑膜半成品浸泡于第二混合液中，去除上述原血紅素試劑膜半成品的水分后，得到成品的原血紅素檢測(cè)試劑膜，上述第二混合液由3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺、無(wú)水乙醇和過(guò)氧化羥基異丙苯混合制得。其中，去除上述原血紅素試劑膜半成品的水分為：淋去原血紅素試劑膜半成品上多余的試劑，均勻地烘干即可。優(yōu)選地，上述的磷酸緩沖液的濃度為0.8-2mol/L、pH為3.2-6.8。更優(yōu)選地，上述的磷酸緩沖液的濃度為1.75mol/L、pH為4.5。優(yōu)選地，上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的濃度為7-9g/100ml。即每100ml第一混合液中含有聚乙烯吡咯烷酮7-9g。更優(yōu)選地，上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的濃度為8g/100ml。優(yōu)選地，上述的第二混合液按以下方法制得：將0.5-1g的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺加入到500ml的無(wú)水乙醇中，然后加入1-2ml的過(guò)氧化羥基異丙苯后制得第二混合液。更優(yōu)選地，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的加入量為0.75g，過(guò)氧化羥基異丙苯的加入量為1ml。進(jìn)一步地，上述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜由以下方法制得：(1)將聚乙烯吡咯烷酮、酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽與醋酸緩沖液混合，得到第三混合液；(2)將β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜浸泡于上述第三混合液中，去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜的水分后，得到β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品；其中，去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜的水分為：淋去β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜上的多余試劑，避光條件下，28℃流動(dòng)空氣干燥2小時(shí)。(3)將上述β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品浸泡于甘氨酸緩沖液中，去除β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品的水分，得到β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜。其中，去除β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品的水分為：淋去β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品上多余的試劑，于40℃均勻地烘干。優(yōu)選地，醋酸緩沖液的濃度為0.1-0.3mol/L、pH為6.5-7.58，更優(yōu)選地，醋酸緩沖液的濃度為0.2mol/L、pH為5.0。優(yōu)選地，上述第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽的濃度為0.5-1g/100ml，更優(yōu)選地，第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽的濃度為0.79g/100ml。優(yōu)選地，第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮濃度為7-9g/100ml，更優(yōu)選地，第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮濃度為8g/100ml。優(yōu)選地，甘氨酸緩沖液的濃度為0.2-0.3mol/L、pH為9-12。更優(yōu)選地，甘氨酸緩沖液的濃度為0.22mol/L、pH為10.5。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明提供的原血紅素檢測(cè)試劑膜和β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜的制作方法并不限于上述的制作方法，在其他的實(shí)施例中，按其他的方法所制作得到的可用于檢測(cè)的原血紅素的原血紅素檢測(cè)試劑膜和可用于檢測(cè)的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜，只要將其用于同時(shí)應(yīng)用于檢測(cè)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶，將二者作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生則均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。還需要說(shuō)明的是，在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述制作方法中所用的原血紅素空白試劑膜可為31ET濾紙；β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜也可為31ET濾紙，在其他的實(shí)施例中，原血紅素空白試劑膜可和β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜也可以是其他的類(lèi)型的濾紙，其并不限于31ET濾紙。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了一種宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。通過(guò)對(duì)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的檢測(cè)結(jié)果，用于判斷樣本的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生(例如宮頸鱗狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生或?qū)m頸柱狀上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生)情況。本實(shí)施例提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，其包括用于檢測(cè)原血紅素的原血紅素檢測(cè)試劑膜和用于檢測(cè)β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜。其中，本發(fā)明提供的原血紅素檢測(cè)試劑膜按如下方法制作：1.1、制作磷酸緩沖液。緩沖液為1.75mol/L、PH值4.5磷酸鹽緩沖液。1.2、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述磷酸緩沖液中，得到第一混合液，攪拌至全溶；其中，聚乙烯吡咯烷酮K30用量為8g/100ml。即每100ml磷酸緩沖液中加入8g聚乙烯吡咯烷酮K30。1.3、將裁切好的31ET濾紙(即原血紅素空白試劑膜)在以上步驟1.2制得的第一混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，烘干，為原血紅素試劑膜半成品。1.4、將定量3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺加入到無(wú)水乙醇500ml中，攪拌至完全溶解；其中，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺加入量為0.75g。1.5、將定量過(guò)氧化羥基異丙苯加入到上述步驟1.4得到的混合溶液中，得到第二混合液，攪拌至完全溶解；過(guò)氧化羥基異丙苯的加入量為1ml。1.6、將步驟1.3制得的原血紅素試劑膜半成品在步驟1.5制得的第二混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，均勻地烘干，即得原血紅素檢測(cè)試劑膜。1.7、避光、干燥條件下保存。本發(fā)明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜按如下方法制作：2.1、取100ml0.2mol/LpH5.0的醋酸緩沖液。2.2、將定量的0.79g酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽(PGA)溶于步驟2.1的醋酸緩沖液中混勻。2.3、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述步驟2.2得到的溶液，得到第三混合液攪拌至全溶；聚乙烯吡咯烷酮K30為8g/100ml。2.4、將裁切好的31ET濾紙(β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜)在步驟2.3制得的第三混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，得β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品。2.5、避光條件下，28℃流動(dòng)空氣干燥2小時(shí)。2.6、取0.22mol/L、PH值為10.5的堿性甘氨酸緩沖液。2.7、將步驟2.4制得的β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品在步驟2.6制得的甘氨酸緩沖液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，40℃均勻地烘干，即得到β葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜。2.8、避光、干燥條件下保存。本發(fā)明提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒參考如下步驟進(jìn)行檢測(cè)：3.1、將來(lái)自某個(gè)體(宮頸癌患者、或非宮頸癌患者、或疑似宮頸癌患者)的宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體樣本與樣本前處理液(購(gòu)買(mǎi)或配制)混合，得到樣本混合液。樣本的采集可參考：(1)戴好無(wú)菌乳膠手套，按常規(guī)對(duì)受檢者作婦科內(nèi)診檢查。(2)獲取宮頸滲液：在做婦科內(nèi)診的同時(shí)，選用適宜的宮頸拭子，在宮頸部位以右上、右下、左下、左上及宮頸口循序輕輕擦拭，獲取宮頸滲液。采液量為0.5～1ml，一般以采樣拭子全部濕潤(rùn)為度。(3)采樣后把拭子插入樣本瓶保存液中輕輕攪動(dòng)，使拭子上獲取的宮頸滲液與樣本保存液混勻，制得樣本液。3.2、取宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒中的原血紅素檢測(cè)試劑膜和β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜分別插入至樣本混合液中，根據(jù)顯色結(jié)果，與相應(yīng)的比色板相比較，判斷出單個(gè)標(biāo)物的情況。通常情況下，原血紅素檢測(cè)試劑膜呈現(xiàn)藍(lán)色為陽(yáng)性，即樣本中含有原血紅素，否則為陰性；β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，即樣本中含有β-葡萄糖醛酸苷酶，否則為陰性。具體地，原血紅素檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考圖1，圖1示出了原血紅素比色板的顏色(藍(lán)色)深淺所對(duì)應(yīng)的判讀結(jié)果(陰性、可疑陽(yáng)性、陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性)，根據(jù)原血紅素檢測(cè)試劑膜的顯色深淺與圖1所示的原血紅素比色板相比較，進(jìn)而判讀出樣本中的原血紅素結(jié)果(陰性、可疑陽(yáng)性、陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性)。β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)可參考圖2，圖2示出了β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的顏色(紅色)深淺所對(duì)應(yīng)的判讀結(jié)果(陰性、可疑陽(yáng)性、陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性)。根據(jù)β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜的顯色深淺與圖2所示的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板相比較，進(jìn)而判讀出樣本中的β-葡萄糖醛酸苷酶結(jié)果(陰性、可疑陽(yáng)性、陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性)。對(duì)個(gè)體的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的情況按表1的判讀規(guī)則進(jìn)行判讀。其中，樣本前處理液參考下方法制作：稱(chēng)取Tris試劑6.05g，少許水溶解，水定容至500ml；3.6ml濃鹽酸用蒸餾水定容到420ml；二者混合，再加入水80ml，共1000ml的Tris-Hcl緩沖液；取7.44gEDTA加入前述的1000mlTris-Hcl緩沖液中，混合保存。表1.采用本實(shí)施例提供的細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判讀規(guī)則表1中的檢測(cè)結(jié)果的臨床意義如下：宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為陽(yáng)性是指：宮頸上皮細(xì)胞存在異質(zhì)性增生；宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為陰性是指：宮頸上皮細(xì)胞不存在異質(zhì)性增生；宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為可疑陽(yáng)性是指：宮頸上皮細(xì)胞可能存在異質(zhì)性增生。采用本實(shí)施例提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果可供臨床醫(yī)生在對(duì)受檢者進(jìn)一步檢查時(shí)參考。本實(shí)施例提供的試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可用于宮頸上皮細(xì)胞的異質(zhì)性增生進(jìn)行判斷，具有較高的敏感度和特異度，并可進(jìn)一步對(duì)對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的進(jìn)行篩查、早診、預(yù)后判斷及用于指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。通過(guò)對(duì)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的檢測(cè)結(jié)果，用于判斷樣本的細(xì)胞異質(zhì)性增生情況。本實(shí)施例提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒，其包括用于檢測(cè)原血紅素的原血紅素檢測(cè)試劑膜、用于檢測(cè)β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜以及用于對(duì)樣本進(jìn)行處理的樣本前處理液。其中，原血紅素檢測(cè)試劑膜、β-葡萄糖醛酸苷酶檢測(cè)試劑膜以及樣本前處理液的制作方法可參考實(shí)施例1。本實(shí)施例提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒的效果同實(shí)施例1。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的敏感度、特異度以及約登指數(shù)的驗(yàn)證。靈敏度(sensitivity)：又稱(chēng)敏感度，是指篩檢方法能將實(shí)際有病的人正確地判定為患者的比例；特異度(specificity)：是指篩檢方法能將實(shí)際無(wú)病的人正確地判定為非患者的比例。3.1敏感度驗(yàn)證3.1.1標(biāo)本來(lái)源：某醫(yī)療單位臨床檢驗(yàn)室收納的宮頸癌病人宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體標(biāo)本100份。宮頸癌均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。3.1.2檢測(cè)方法：采用實(shí)施例2提供的宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測(cè)試劑盒對(duì)上述的100份樣本進(jìn)行原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的聯(lián)合檢測(cè)，并按實(shí)施例1提供的判讀規(guī)則進(jìn)行判讀。(需要說(shuō)明的是，也可以采用其他的試劑盒或方法檢測(cè)100份樣本原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶，只要以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于對(duì)宮頸上皮細(xì)胞的異質(zhì)性增生進(jìn)行檢測(cè)即可)，宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2.以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測(cè)宮頸癌樣本的敏感度標(biāo)志物強(qiáng)陽(yáng)性陽(yáng)性陰性可疑陽(yáng)性敏感度(％)原血紅素38529191β-葡萄糖醛酸苷酶84940360原血紅素+β-葡萄糖醛酸苷酶1060131787注：表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果的宮頸癌樣本數(shù)。表2顯示了以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測(cè)宮頸癌樣本的敏感度，從表2可知，單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度明顯高于單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度(p<0.01)；以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度高于單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度(p<0.01)；以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度與以原血紅素作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的敏感度差異并不顯著(p>0.05)。3.2特異度驗(yàn)證3.2.1標(biāo)本來(lái)源：與步驟3.1.1中的相同醫(yī)療單位臨床檢驗(yàn)室收納的非宮頸癌患者宮頸部位分泌液、組織滲液和粘液組成的混合液體標(biāo)本100份。非宮頸癌患者為其它原因需要進(jìn)行宮頸細(xì)胞病理學(xué)檢查，均除外宮頸癌者。3.2.2檢測(cè)方法：同步驟3.1.2，異質(zhì)性增生的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。表3.以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測(cè)非宮頸癌樣本的特異度標(biāo)志物強(qiáng)陽(yáng)性陽(yáng)性陰性可疑陽(yáng)性特異度(％)原血紅素42964367β-葡萄糖醛酸苷酶0390797原血紅素+β-葡萄糖醛酸苷酶05672895注：表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果的非宮頸癌樣本數(shù)。表3顯示了以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測(cè)非宮頸癌樣本的特異度，從表3可看出，以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測(cè)樣本的特異度明顯高于單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的特異度(p<0.01)，并且以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測(cè)樣本的特異度與單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測(cè)樣本的特異度差異并不明顯(p>0.05)。3.3約登指數(shù)3.3.1單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測(cè)的約登指數(shù)為0.58；3.3.2單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測(cè)的約登指數(shù)為0.57；3.3.3以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測(cè)的約登指數(shù)為0.82。約登指數(shù)是指：敏感度與特異度之和減去1，其表示篩檢方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力，指數(shù)越大說(shuō)明篩查實(shí)驗(yàn)的效果越好，真實(shí)性越大。由上述結(jié)果可知，以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于篩查宮頸上皮細(xì)胞的異質(zhì)性增生的效果更好，其真實(shí)性越大，相應(yīng)地診斷結(jié)果也準(zhǔn)確，大大地提高了對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上，本發(fā)明首次以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生情況，令人驚訝的結(jié)果是其敏感度達(dá)到87％、特異度達(dá)到95％、約登指數(shù)達(dá)到0.82，均明顯高于單獨(dú)地以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測(cè)，且漏診率和誤診率都非常低，符合篩查試劑的要求，適合于做大數(shù)據(jù)人群的由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌篩查，有助于提高對(duì)由宮頸上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的宮頸癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3