本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種微生物的檢測(cè)方法，具體來說是一種瓜類細(xì)菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測(cè)試紙及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

瓜類果斑病是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，20世紀(jì)80年代后期該病因在美國(guó)數(shù)個(gè)州的西瓜上出現(xiàn)破壞性爆發(fā)而受到廣泛關(guān)注，自此，瓜類細(xì)菌性果斑病在世界范圍內(nèi)傳播開來。其病原為革蘭氏陰性菌的嗜酸菌屬燕麥種西瓜亞種(Acidovorax citrulli,Ac)，是一種具有高度破壞性的種傳病菌。該病菌的抗干旱能力非常強(qiáng)，可在干燥的種子表面存活35年。到目前為止，并無(wú)完全抵抗該病菌的商業(yè)化的培育品種。

瓜類果斑病菌又稱果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科植物患病，據(jù)報(bào)道，在番茄、茄子等茄科植物的種子中也檢測(cè)到了該病原菌，它可侵染果實(shí)、植株及種子，主要依靠帶菌種子傳播。帶菌種子播種后會(huì)使幼苗患病，出現(xiàn)褐色壞死斑。帶菌果實(shí)在采后貯藏運(yùn)輸過程中會(huì)感染健康果實(shí)，表面會(huì)出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，最終導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響瓜類產(chǎn)量。

目前市場(chǎng)上用于檢測(cè)果斑病菌的試紙是來自美國(guó)Agdia公司的免疫膠體金試紙，國(guó)內(nèi)嚴(yán)重依賴進(jìn)口，且現(xiàn)有技術(shù)中的免疫膠體金試紙的檢測(cè)效果取決于抗體與膠體金的結(jié)合效果及金標(biāo)抗體與檢測(cè)抗體的配對(duì)情況。目前報(bào)道的試紙多為單克隆抗體作為金標(biāo)抗體和多克隆抗體作為檢測(cè)抗體配合使用，因此存在著檢測(cè)靈敏度低、交叉反應(yīng)多、試紙條有效期短等問題，對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度造成了一些不利影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種瓜類細(xì)菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測(cè)試紙及其應(yīng)用，所述的這種瓜類細(xì)菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測(cè)試紙及其應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌的試紙靈敏度低、交叉反應(yīng)多、試紙條有效期短的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種瓜類細(xì)菌性果斑病菌免疫熒光快速檢測(cè)試紙，包括一個(gè)支撐層，所述的支撐層上設(shè)置有樣品墊、吸水墊，所述的樣品墊和所述的吸水墊之間設(shè)置有硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜的一端和所述的樣品墊的一側(cè)緊密連接，所述的硝酸纖維素膜的另外一端和所述的吸水墊的一側(cè)緊密連接，所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢查線，其特征在于：所述的檢測(cè)線由保藏號(hào)為CGMCC No.10413的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體構(gòu)成，所述的單克隆抗體的濃度為2mg/mL。

進(jìn)一步的，所述的支撐層位PVC底板。

進(jìn)一步的，所述的吸水墊為吸水紙。

采用上述的試紙檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌的方法，將待檢測(cè)細(xì)菌放置于異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)獲得菌懸液，所述的異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基由異硫氰酸熒光素和腦心浸液培養(yǎng)基組成，所述的異硫氰酸熒光素在異硫氰酸熒光素改良培養(yǎng)基中的濃度為20μg/mL，將菌懸液采用無(wú)菌生理鹽水調(diào)到10⁶～10⁸CFU/mL，然后將含有待檢測(cè)細(xì)菌的菌懸液滴加至樣品墊上，隨著待檢測(cè)細(xì)菌的流動(dòng)，如果檢測(cè)線的顏色變?yōu)辄S色，則表示待檢測(cè)樣品中含有瓜類細(xì)菌性果斑病菌，若檢測(cè)線不變色，則代表樣品中無(wú)瓜類細(xì)菌性果斑病菌。

本發(fā)明采用添加FITC的改良腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，該方式培養(yǎng)的細(xì)菌可以發(fā)出黃綠色的熒光，從而使細(xì)菌成為熒光探針。由保藏號(hào)為CGMCC No.10413的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體6D作為檢測(cè)抗體，噴涂于NC膜上形成檢測(cè)線，本發(fā)明僅需一株抗果斑病菌的單克隆抗體6D作為檢測(cè)抗體噴涂于NC膜，并制成無(wú)標(biāo)記的單線免疫熒光試紙，整個(gè)制備過程無(wú)需標(biāo)記抗體，避免了標(biāo)記效果對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)表明此熒光檢測(cè)試紙可檢出大多數(shù)的果斑病菌且無(wú)交叉反應(yīng)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。

本發(fā)明的一種雜交瘤細(xì)胞株，分類命名：抗瓜類細(xì)菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli i)雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2015年3月19日，保藏號(hào)為CGMCC NO.10413。

本發(fā)明采用的保藏號(hào)為CGMCC No.10413的雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體的全部?jī)?nèi)容在2015年10月21日公開的申請(qǐng)?zhí)枮椤?01510420442.6”、發(fā)明名稱為“果斑病菌免疫膠體金檢測(cè)試紙條及其單抗和雜交瘤細(xì)胞株”中的文件中均有記載，在此不再贅述。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明由于采用了細(xì)菌作為熒光探針，僅需一株單抗作為檢測(cè)抗體，無(wú)需抗體的配對(duì)及抗體的標(biāo)記，因而可避免標(biāo)記效果對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該免疫熒光試紙對(duì)果斑病菌的檢測(cè)特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度均較高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的改良培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

圖2A顯示了不同F(xiàn)ITC濃度細(xì)菌熒光強(qiáng)度結(jié)果。

圖2B顯示了不同F(xiàn)ITC濃度的檢測(cè)靈敏度。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的特異性反應(yīng)結(jié)果。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的靈敏度結(jié)果。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例中果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙的實(shí)際樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖介紹本發(fā)明的具體實(shí)施方式：

首先介紹本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試劑與儀器：

主要試劑

BSA上海世澤生物科技有限公司；FITC美國(guó)SIGMA公司；硝酸纖維素膜(NC 膜)美國(guó)Millipore公司；腦心浸液培養(yǎng)基北京陸橋有限公司。

主要儀器

酶標(biāo)儀SpectraMax M2購(gòu)自Molecular Devices；Nanodrop 2000C購(gòu)自Thermo Scientific；點(diǎn)樣儀AD6010購(gòu)自BIO-DOT；恒溫培養(yǎng)搖床SPH-100B購(gòu)自上海世平；單人凈化工作臺(tái)SW-SJ-2D購(gòu)自蘇州凈化。

實(shí)施例1 果斑病菌單克隆抗體

本實(shí)驗(yàn)用的果斑病菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6D于2015年4月保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國(guó)，北京市)，保藏號(hào)為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國(guó)，北京市)No.10413。

實(shí)施例2 免疫熒光檢測(cè)試紙

1、異硫氰酸熒光素(FITC)改良培養(yǎng)基

新鮮配置FITC母液，取不同體積FITC溶液添加到腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)中制成改良的BHI培養(yǎng)基，接種果斑病菌后37℃避光培養(yǎng)12h。圖1為改良的BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，可見該方法培養(yǎng)的細(xì)菌能夠發(fā)出強(qiáng)烈的黃綠色的熒光。

2、流式細(xì)胞儀測(cè)定不同F(xiàn)ITC濃度的細(xì)菌熒光強(qiáng)度

采用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度FITC的培養(yǎng)基中細(xì)菌的熒光強(qiáng)度，以確定最適的FITC濃度。由圖2A可以看出，不同濃度的標(biāo)記率(M2+M3+M4)均在97％以上，但每個(gè)區(qū)域分布不同。熒光強(qiáng)度可能會(huì)影響最終的檢測(cè)靈敏度，因而對(duì)M3區(qū)域的數(shù)量進(jìn)行比較如圖2B，當(dāng)濃度為20μg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度最高，因而選在該濃度為最適FITC濃度。

3、果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙條的組裝

圖3是本發(fā)明果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖及陰性與陽(yáng)性的模擬示意圖。

如圖3所示，果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙包括：樣品墊1、檢測(cè)線2，吸水墊3，在吸水墊3與樣品墊1的中間采用硝酸纖維素膜4，硝酸纖維素膜4也稱NC膜。硝酸纖維素膜4上噴涂有檢測(cè)線2，所述的檢測(cè)線2由保藏號(hào)為No. 10413的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體構(gòu)成。果斑病菌的免疫熒光檢測(cè)試紙還具有PVC底板5，用于承載上述的樣品墊1等結(jié)構(gòu)。

若樣品中含有目標(biāo)菌，則試紙上有一條黃綠色的檢測(cè)線，則判定為陽(yáng)性。

若樣品中無(wú)目標(biāo)菌，則試紙無(wú)線判定為陰性。

4、檢測(cè)線濃度優(yōu)化

將不同濃度(2.5mg/mL，2mg/mL，1.5mg/mL)的單克隆抗體6D4噴涂于硝酸纖維素膜(NC膜)上形成檢測(cè)線。改良的BHI培養(yǎng)基70uL逐滴滴加至樣品墊，判定最適的檢測(cè)線濃度：選擇試紙未出線的最高6D4抗體濃度為最適檢測(cè)線濃度。

當(dāng)檢測(cè)線濃度為2.5mg/mL時(shí)，試紙測(cè)定改良的BHI培養(yǎng)基時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，濃度低于2mg/mL時(shí)，試紙未出現(xiàn)檢測(cè)線，因此本實(shí)驗(yàn)中最適的檢測(cè)限濃度為2mg/mL。

5、試紙?zhí)禺愋詼y(cè)定

將8種果斑病菌及6種非Ac的植物病原菌均于改良的BHI培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，菌懸液用無(wú)菌生理鹽水調(diào)到10⁸CFU/mL，每種樣品滴加70μL到試紙的樣品墊，改良的BHI培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

由圖4(1-8)可知，70μL濃度為10⁸CFU/mL的8種果斑病菌(99-5，xj112，PSLB1，00-1，plsb91，TW31，ATCC29625，SD01)菌液滴加到樣品墊后，T線均顯色；由圖4(9-14)可知，其他6株非Ac的植物病原菌(NCPPB961，ATCC33996，ATCC19307，NCPPB2597，NCPPB540，NCPPB2975)相同濃度相同體積加樣后，T線均未顯色。結(jié)果表明，該試紙條可以專一檢測(cè)8種果斑病菌(99-5，xj112，PSLB1，00-1，plsb91，TW31，ATCC29625，SD01)，特異性較好。

6、試紙靈敏度測(cè)定

果斑病菌野生型菌株SD01單菌落于改良的BHI培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h后，平板菌落計(jì)數(shù)算得菌液濃度為3.1×10⁹CFU/mL。用無(wú)菌的生理鹽水按梯度稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵CFU/mL，以改良的BHI培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品在試紙的樣品墊逐滴滴加70uL，10min后在紫外燈下觀察結(jié)果。

由圖5可知，滴加濃度為10⁸、10⁷、10⁶CFU/mL菌液后，試紙條檢測(cè)線顯色，滴加10⁵CFU/mL菌液檢測(cè)線未顯色，說明試紙條檢測(cè)靈敏度可達(dá)10⁶CFU/mL，三次重復(fù)結(jié)果均為10⁶CFU/mL，靈敏度穩(wěn)定性較好。

7、實(shí)際樣品的檢測(cè)

選取葫蘆科植物中的西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜、冬瓜、絲瓜、哈密瓜、西葫蘆的莖葉搗碎，收集汁液5mL添加到45mL BHI中，并接種果斑病菌SD01單菌落，37℃培養(yǎng)12h后，無(wú)菌生理鹽水稀釋至濃度為10⁶CFU/mL，每個(gè)樣品在試紙的樣品墊上滴加70μL，10min后在紫外燈下觀察結(jié)果。

如圖6所示，樣品1-8號(hào)均可以檢出，而空白對(duì)照無(wú)檢測(cè)線，說明試紙?jiān)跈z測(cè)樣品時(shí)，最小可檢出濃度不受瓜類莖葉中雜質(zhì)的影響，表明該試紙可用于田間現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

8、PCR法測(cè)定試紙的準(zhǔn)確度

為驗(yàn)證該檢測(cè)試紙的準(zhǔn)確性，采用國(guó)標(biāo)PCR法對(duì)上述8種瓜類帶菌樣品進(jìn)行驗(yàn)證，如圖7所示，1-8號(hào)樣品均可以在360bp擴(kuò)增出特異性條帶，與試紙檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果一致，表明了制備的該檢測(cè)試紙具有較好的準(zhǔn)確性。