本發(fā)明涉及到血液二肽肽酶I活性表達(dá)的體外快速檢測方法

背景技術(shù)：

二肽肽酶I(dipeptidyl peptidase,DPPI)是溶酶體內(nèi)一種半胱氨酸蛋白酶，又稱組織蛋白酶C)，具有肽鏈外切酶的活性，高表達(dá)于人體免疫系統(tǒng)顆粒免疫細(xì)胞，包括肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和粘膜T細(xì)胞，是絲氨酸炎癥蛋白酶原的專屬激活酶。在炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和組織微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持起到重要作用。DPPI血液中的表達(dá)和活性和一些特定的病理生理狀態(tài)相關(guān)，所以DPPI檢測方法的建立，無論是實(shí)驗室還是醫(yī)院臨床都有著重要意義。

現(xiàn)有的測定DPPI的方法為ELISA法或者WESTEN BLOTTING法，耗時長且耗資高，而結(jié)果只能說明樣品中有或無DPPI蛋白質(zhì)的存在但無法表明DPPI酶活性功能的存在和變化。我們前期發(fā)明的熒光儀高通量方法檢測血清中DPPI的活性已經(jīng)能夠表明樣品中DPPI酶活性的存在和變化，但問題一是制備血清過程長，病人血的用量大；二是實(shí)驗儀器昂貴，屬于大型分析儀器，保養(yǎng)維護(hù)昂貴復(fù)雜；三是單個樣品檢測成本較高，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。所以，建立簡單易行耗時耗資少的DPPI活性表達(dá)的檢測的方法對與免疫顆粒細(xì)胞相關(guān)的疾病研究和DPPI的活性檢測，包括類風(fēng)濕疾病的早期診斷都有著重要的意義。

本發(fā)明的反應(yīng)原理是：DPPI與其專屬性底物相互作用后釋放自由的三氟甲基香豆素產(chǎn)物，而自由的三氟甲基香豆素產(chǎn)物產(chǎn)生熒光，在紫外燈下可見。本發(fā)明是基于我們自己前期使用大型熒光儀器設(shè)備的研究結(jié)果，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為紙層析系統(tǒng)的快速檢測手段。本發(fā)明不但改善了上述使用熒光儀器設(shè)備高通量方法的三個問題，并建立了一個體外快速檢測的新方法。本發(fā)明用XYZ1601紙層析的方法檢測血液中DPPI的活性表達(dá)水平，特點(diǎn)是鮮血微量(0.5-1微升)，無需血清制備，分析耗時短，易操作，可用于現(xiàn)場測定。

本發(fā)明使用了human recombinant DPPI(hrDPPI)作為預(yù)測試對象首先建立測定系統(tǒng)，然后用hrDPPI作為系統(tǒng)陽性對照，測定人血液或大鼠中的DPPI活性表達(dá)水平，同時用熒光儀測定作為紙層析的結(jié)果確認(rèn)。

研究表明，類風(fēng)濕疾病的發(fā)生和發(fā)展和免疫顆粒細(xì)胞的激活相關(guān)(Eklund KK.Mast cells in the pathogenesis of rheumatic diseases and as potential targets for anti-rheumatic therapy.Immunological Reviews.2007,217(1):38-52.和Wright H L.The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis[J].Nature Reviews Rheumatology,2014,10(10):593-601.)，DPPI來源于顆粒細(xì)胞，包括肥大細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，粘膜T淋巴細(xì)胞，并和這類細(xì)胞的激活有關(guān)，所以，DPPI的檢測代表了體內(nèi)免疫系統(tǒng)中顆粒細(xì)胞的激活。我們前期的研究(X.Zhou,et al.,Serum based fluorescent assay for evaluating dipeptidyl peptidase I activity in collagen inducedarthritis rat model,Molecular and Cellular Probes(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.mcp.2016.10.009和X.Zhou,et al.Activation of mast cells and their subsets in the synovium in osteoarthritis(OA)and rheumatoid arthritis(RA).Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010；125(2),S178.)也表明了DPPI與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)展有關(guān)。本研究將本發(fā)明的檢測方法應(yīng)用在類風(fēng)濕的大鼠模型中，以進(jìn)一步確認(rèn)本發(fā)明的準(zhǔn)確性。

牛II型膠原作為抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型具有人類疾病的許多病理特征，例如炎癥，自身免疫，關(guān)節(jié)炎和骨侵蝕，一直以來都是實(shí)驗室廣泛接受的研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的模型。我們前期的研究使用了自行合成的熒光探針XYZ1601以及熒光儀(Ex400nm/Em492nm)測定，發(fā)現(xiàn)DPPI在膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的血液、關(guān)節(jié)滑膜和骨髓中均有高表達(dá)，并和類風(fēng)濕的發(fā)病程度呈相關(guān)性。我們又用了本發(fā)明的XYZ1601紙層析方法檢測CIA大鼠血液中DPPI的活性，結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測結(jié)果和熒光儀的檢測結(jié)果一致。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.發(fā)明內(nèi)容簡述：

首先我們合成了基于香豆素的熒光探針XYZ1601，探針包含香豆素染料和特異性多肽，以在初始狀態(tài)下產(chǎn)生“關(guān)閉”熒光信號。血液樣品中高表達(dá)的DPPI激活熒光探針XYZ1601，釋放出游離三氟甲基香豆素，其導(dǎo)致“開啟”熒光信號。DPPI與熒光探針XYZ1601反應(yīng)后釋放出的自由三氟甲基香豆素濃度和其熒光強(qiáng)度相關(guān)。

同時我們的發(fā)明提供了利用紙層析檢測血液中DPPI活性的方法，成為一項體外快速檢測的手段。血液中的DPPI和XYZ1601相互作用，經(jīng)過孵育和紙層析分離后，反應(yīng)產(chǎn)物在紫外燈下釋放出的熒光，觀察R_f定值(0.62-0.66)區(qū)間的樣品點(diǎn)熒光亮度的強(qiáng)弱和面積大小。

2.發(fā)明技術(shù)方案

2.1.熒光探針XYZ1601

本發(fā)明提供了以7-氨基-4-三氟甲基香豆素與BOC-苯丙氨酸通過生成酰胺的方法獲得BOC-苯丙氨酸-三氟甲基香豆，在三氟乙酸的條件下脫去BOC保護(hù)，再與BOC-甘氨酸反應(yīng)，生成BOC甘氨酸-苯丙氨酸-三氟甲基香豆素，最后脫去BOC得到XYZ1601的方法。合成路線如下。

上述合成路線的具體步驟是：

a.中間產(chǎn)物化合物3的合成：以7-氨基-4-三氟甲基香豆素，BOC-苯丙氨酸為原料，將溶液倒入水中，乙酸乙酯萃取。然后有機(jī)層用NaHCO₃水溶液洗滌，Na₂SO₄干燥，低壓旋蒸，殘余物通過硅膠柱分離提純(DCM/石油醚)純化，得到化合物3。

b.中間產(chǎn)物化合物4的合成：

將化合物3在TFA/DCM(1:1)中的溶液在室溫下攪拌4小時。將反應(yīng)混合物真空濃縮，得到游離胺的鹽酸鹽，然后用飽和碳酸氫鈉溶液，鹽水洗滌三次，并用Na₂SO₄干燥。將有機(jī)粗產(chǎn)物通過硅膠柱(DCM)純化，得到化合物4。

c.向化合物4和Boc-甘氨酸的無水DMF溶液中加入DIPEA，HBTU和EDCI。反應(yīng)溶液氮?dú)獗Ｗo(hù)攪拌過夜。將殘余物溶于乙酸乙酯中，有機(jī)層依次用10％檸檬酸水溶液，水，10％碳酸鉀水溶液和鹽水洗滌，Na₂SO₄干燥有機(jī)相，過濾并減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過硅膠柱(環(huán)己烷/EA)純化，得到中間產(chǎn)物化合物5。

d.將化合物5在5mL的4M鹽酸的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌4小時。將反應(yīng)混合物真空濃縮，得到游離胺的鹽酸鹽，為黃色油狀物。然后將有機(jī)層用飽和NaHCO₃水溶液，鹽水洗滌，并用Na₂SO₄干燥。過濾并減壓旋蒸后，將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法(甲醇/二氯甲烷)純化，得到熒光探針XYZ1601，并經(jīng)質(zhì)譜和核磁表征分析，其結(jié)構(gòu)得以確認(rèn)，其在Ex400nm處有激發(fā)和在Em492nm處有發(fā)射。

2.2.紙層析法

材料：紙層析用濾紙，展開劑石油醚-二氯甲烷，點(diǎn)樣毛細(xì)吸管。

過程：現(xiàn)場取靜脈新鮮血液(人鮮血或大鼠鮮血)微量與0.5mM的XYZ1601溶液混合孵育10-20分鐘。

用毛細(xì)吸管吸取混合樣液于層析點(diǎn)樣，樣點(diǎn)的直徑在0.5cm-1cm。

置于容器中，展開劑為石油醚-二氯甲烷，樣品分離，當(dāng)展開劑至紙層析條前沿(約10分鐘)，取出紙層析條，風(fēng)干；置于紫外燈下觀察，紫外燈波長為365nm，層析紙上出現(xiàn)黃綠色的亮斑，計算其移動速度R_f值以示二肽肽酶I的活性表達(dá)。

R_f值(比移值)的計算公式：斑點(diǎn)中心距原點(diǎn)的距離/溶劑展開前沿距原點(diǎn)距離的比值。

3.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

3.1.特異性強(qiáng)，方法和設(shè)備簡單便攜，檢測時間短，檢測成本低，便于操作；

3.2.現(xiàn)場采血，不用分離血紅蛋白，不用血清制備，可用于個體基礎(chǔ)值的確定和快速現(xiàn)場檢測。

附圖說明

圖1.產(chǎn)品裝置設(shè)計示意圖

圖1A為本發(fā)明XYZ1601紙層析檢測結(jié)果；圖1B為本發(fā)明裝置設(shè)計示意圖，該裝置主要分為三部分，點(diǎn)樣槽，顯示槽和條形碼/樣品名的標(biāo)記，其長度和寬度視樣品數(shù)量而設(shè)置。

圖2.XYZ1601底物檢測DPPI活性和DPPI抑制劑的抑制作用(動力學(xué)曲線)

如圖所示hrDPPI與底物XYZ1601相互作用后，釋放出游離香豆素導(dǎo)致熒光強(qiáng)度迅速增加。在hrDPPI在5分鐘之后被加入DPPI抑制劑Gly-Phe-CHN₂后(深色動力學(xué)曲線)，熒光強(qiáng)度被抑制；而沒有加入抑制劑的hrDPPI繼續(xù)和底物作用(淺色動力學(xué)曲線)，熒光強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)。

圖3.XYZ1601紙層析DPPI活性檢測結(jié)果的灰度分析和熒光儀檢測DPPI活性的確認(rèn)

A.XYZ1601紙層析檢測結(jié)果，即對外加不同濃度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)用XYZ1601紙層析法檢測DPPI活性，結(jié)果表明熒光強(qiáng)度和DPPI濃度成正相關(guān)；B.紙層析法檢測結(jié)果的灰度值分析(分析軟件ImageJ2x)；C.hrDPPI與XYZ1601的酶反應(yīng)動力學(xué)；D.對外加不同濃度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)用熒光儀(Ex400nm/Em492nm)檢測以確認(rèn)本發(fā)明XYZ1601紙層析法的檢測結(jié)果，熒光儀(Ex400nm/Em492nm)的檢測結(jié)果表明和XYZ1601紙層析法的檢測結(jié)果一致。

圖4.XYZ1601紙層析檢測檢測人血DPPI活性

圖4A.DPPI高表達(dá)的人血液，在其基礎(chǔ)值、發(fā)病和給藥后血液中DPPI的紙層析活性檢測。由圖可以看出正常情況(基礎(chǔ)值)下血液DPPI的活性表達(dá)較低，發(fā)病之時DPPI的活性表達(dá)升高，服藥之后DPPI的表達(dá)降低，而且基本達(dá)到其基礎(chǔ)值水平。圖4B.紙層析法檢測結(jié)果的灰度值分析。

圖5.血液背景干擾的分析和XYZ1601紙層析檢測方法有效性的確認(rèn)

正常人(A和B)血液以及在等量血液中外加hrDPPI(不同濃度)之后的紙層析法DPPI活性檢測。(-)表示正常血液，(+)表示等量正常血液中外加hrDPPI。從圖5A可以看出，外加DPPI血液的熒光強(qiáng)度比未加的要強(qiáng)。表明本檢測方法無背景干擾，熒光儀分析結(jié)果給予確認(rèn)。

正常人血液中外加不同濃度的hrDPPI之后的紙層析法DPPI活性檢測。圖5B依次表示正常血液，外加0、1、10mU/mL的hrDPPI之后進(jìn)行紙層析法DPPI活性檢測的結(jié)果。從圖可以看出，隨著hrDPPI在血液中的濃度增大，熒光亮度也依次變強(qiáng)，表明本檢測方法的有效性。圖5C表示紙層析法檢測結(jié)果的灰度值分析。

圖6.XYZ1601紙層析檢測檢測類風(fēng)濕RA大鼠(CIA)免疫后新鮮血液中DPPI的活性

如圖6A所示，與健康大鼠相比，RA大鼠新鮮血液中DPPI的活性表達(dá)水平有顯著性提高和持續(xù)性表達(dá)。免疫后連續(xù)觀察健康大鼠和RA大鼠，并采血進(jìn)行紙層析法分析和熒光儀法(Ex400nm/Em492nm)平行確認(rèn)。免疫后分別在d2，d6，d12，d13取血進(jìn)行DPPI紙層析檢測。由圖可以看出RA大鼠的急性炎癥過程中的DPPI熒光強(qiáng)度的變化，在免疫后第6天的血液中，熒光強(qiáng)度和斑點(diǎn)達(dá)到最大值(說明：黑白灰顏色體系中間反光部分為超高值)。紙層析法的結(jié)果與熒光儀測定的結(jié)果一致(見圖7)。圖6B表示紙層析法檢測結(jié)果的灰度值分析。圖7.熒光儀(Ex400nm/Em492nm)檢測CIA大鼠免疫前后新鮮血液中DPPI活性變化

免疫之后CIA大鼠新鮮血液中DPPI的活性表達(dá)水平較正常組有顯著性提高和持續(xù)性表達(dá)，d6天達(dá)到最高，此結(jié)果確認(rèn)了紙層析的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明工作程序進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：人的血液紙層析檢測、血液背景干擾以及檢測有效性確認(rèn)

1).二肽肽酶I高表達(dá)血樣：

實(shí)驗對象為DPPI高表達(dá)的人，采血于正常情況、發(fā)病服藥之前和服藥之后。吸取手指鮮血一滴，加入XYZ1601，37℃孵育10-20分鐘，在紙層析用濾紙條的一端點(diǎn)加樣品溶液，樣品間距2.0cm。將點(diǎn)樣后的濾紙在展開劑中展開，展開劑接近紙層析條前沿時取出，風(fēng)干后置于紫外燈下觀察，紫外燈波長同上。層析紙上展開的亮斑，即為DPPI和XYZ1601反應(yīng)后釋放出的熒光樣品點(diǎn)。原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)距離2.8cm，原點(diǎn)至溶劑前沿距離5cm，計算R_f值0.65(圖4)。同時用熒光儀(PerkinElmer)作平行檢測以確認(rèn)結(jié)果。

2).二肽肽酶I血樣干擾測定：

實(shí)驗對象為正常人(低表達(dá))，分別吸取每個人的手指鮮血一滴。血液分別置于兩個孔中，其中一個加入1μL的緩沖液，另一個加入1μL的500mU/ml的hrDPPI，然后分別加入XYZ1601，37℃，孵育10-20分鐘，在紙層析條的一端點(diǎn)加樣品溶液，樣品間距2.0cm。將點(diǎn)樣后的濾紙在展開劑中展開，接近紙層析條前沿時取出，風(fēng)干后置于紫外燈下觀察，波長同上，層析紙上黃綠色的亮斑，為即為DPPI和XYZ1601反應(yīng)后釋放出的熒光樣品點(diǎn)，其強(qiáng)度不受血液背景干擾。原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)距離3.3cm，原點(diǎn)至溶劑前沿距離5cm，計算R_f值0.66(圖5A)。同時用熒光儀(Perkin Elmer)作平行檢測以確認(rèn)結(jié)果。

3).檢測有效性確認(rèn)：

實(shí)驗對象為正常人，分別吸取一個人的手指鮮血一滴，置于三個孔中，分別加入1μL不同濃度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)，然后加入3μL的0.5mM的XYZ1601，37℃，孵育10-20分鐘，在紙層析條的一端點(diǎn)加樣品溶液，樣品間距2.0cm。將點(diǎn)樣后的濾紙在展開劑中展開，接近紙層析條前沿時取出，風(fēng)干，置于紫外燈下觀察，波長同上，觀察層析紙上黃綠色的亮斑，即為DPPI和XYZ1601反應(yīng)釋放出的熒光樣品點(diǎn)，其熒光強(qiáng)度和hrDPPI濃度成正相關(guān)性。原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)距離3.1cm，原點(diǎn)至溶劑前沿距離5cm，計算R_f值0.62(圖5B)。同時用熒光儀(Perkin Elmer)作平行檢測以確認(rèn)結(jié)果。

實(shí)施例2：大鼠膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)模型，紙層析檢測大鼠新鮮血液中DPPI的活性。

大鼠眼眶取1μl新鮮血液，分別加入1.65μL的XYZ1601，37℃孵育10-20分鐘，在紙層析用濾紙條的一端點(diǎn)加樣品溶液，樣品間距2.0cm。將點(diǎn)樣后的濾紙在展開劑中展開，展開劑前段接近紙層析條前沿時取出，風(fēng)干后置于紫外燈下觀察，紫外燈波長為365nm。層析紙上展開的亮斑，即為DPPI和XYZ1601反應(yīng)釋放出的熒光樣品點(diǎn)。原點(diǎn)至層析斑點(diǎn)距離2.8cm，原點(diǎn)至溶劑前沿距離5cm，計算R_f值0.50(圖6)。同時用熒光儀(PerkinElmer)作平行檢測以確認(rèn)結(jié)果(圖7)。

本發(fā)明中所采用的紙層析是用濾紙為固定相支持物的紙層析分析，有機(jī)溶劑作為流動相，有機(jī)相流經(jīng)層析紙時，熒光反應(yīng)產(chǎn)物的分配系數(shù)區(qū)別于XYZ1601，因而擴(kuò)散速度不同，近而達(dá)到分離的目的。本發(fā)明對人和CIA大鼠的新鮮血液進(jìn)行DPPI的紙層析的分析檢測，檢測結(jié)果表明：a.血液中外加hrDPPI的活性無血液背景干擾，并和加入的hrDPPI濃度呈正相關(guān)，并且紙層析檢測結(jié)果和熒光儀檢測結(jié)果一致；b.人鮮血中DPPI活性的表達(dá)和給藥前后相關(guān)；c.CIA大鼠血液中DPPI水平和大鼠的炎癥發(fā)展一致，而且紙層析的檢測結(jié)果與熒光儀檢測的結(jié)果也一致。本發(fā)明的有益效果是簡單快速微量，省時省錢省材，重要的是填補(bǔ)了現(xiàn)行檢測DPPI方法的不足。