本發(fā)明屬于免疫分析技術和農(nóng)藥殘留檢測領域，具體涉及一種用于檢測甲萘威的熒光偏振免疫分析方法。

背景技術：

甲萘威又稱西維因、安甲萘，屬氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有高效、持續(xù)期長、選擇高等特點，是國內使用量較大的廣譜性農(nóng)藥，廣泛應用于水果、蔬菜、棉花和茶葉等作物生產(chǎn)中。甲萘威是中等毒性農(nóng)藥，具有觸殺及胃毒作用，在水體、土壤、水果、糧食等介質中殘留時間長，極易引起農(nóng)產(chǎn)品中殘留超標和安全消費問題，對人的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)中樞和內分泌系統(tǒng)造成損害，威脅農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。2008年歐盟化學品審查委員會第四次會議中的附件Ⅱ明確提出了禁止甲萘威的使用，認為甲萘威除了吞食和內吸性毒性以外，能引發(fā)人體所有臟器腫瘤(其中以消化道癌最為常見)，屬于第三類致癌物質。GB2763-2014食品安全國家標準食品中農(nóng)藥殘留最大限量中明確規(guī)定了甲萘威在蔬菜中的最大殘留限量(Maximum Residue Limit,MRL)為1ppm，谷物中為0.5-1ppm，茶葉中為1ppm。標準中沒有規(guī)定甲萘威在水果中的最大殘留限量，參考各國對其規(guī)定，甲萘威在水果中的MRL為1-5ppm。

目前，甲萘威殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法、膽堿酯酶抑制法和免疫分析法。其中高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法雖然準確度高、重現(xiàn)性好，但是需要依賴于昂貴的儀器設備，分析成本高且對檢測環(huán)境和操作人員均有較高要求，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求；膽堿酯酶抑制法具有通用性強、簡便快速等優(yōu)點，一定程度上滿足了現(xiàn)場檢測需求，但其靈敏度低，難以滿足痕量檢測需求。

免疫分析技術，因具有靈敏度高、特異性強、成本低、簡便快速等優(yōu)點被越來越廣泛地應用于農(nóng)藥殘留檢測領域。但是常用的酶聯(lián)免疫吸附法和側流免疫層析技術需要進行多步分離和洗滌操作，操作較復雜、耗時較長。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有的甲萘威免疫檢測技術中，操作復雜、耗時長等缺點，建立一種用于檢測甲萘威的熒光偏振免疫分析方法，整個檢測過程只需要一步競爭反應，操作簡單、快速。

本發(fā)明所提供的用于檢測甲萘威的熒光偏振免疫分析方法：將待測樣品與所述熒光標記物溶液以及甲萘威單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值，根據(jù)熒光偏振值-甲萘威標準樣品中甲萘威濃度標準曲線，計算所述待測樣品中甲萘威的濃度。

按上述方案，所述的熒光偏振值-甲萘威標準樣品中甲萘威的濃度標準曲線是采用以下方法獲得的：將一系列已知濃度的甲萘威標準品的溶液分別與熒光標記物溶液以及甲萘威單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；以測定的熒光偏振值為縱坐標，所述一系列已知濃度的甲萘威標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

按上述方案，所述熒光標記物為甲萘威半抗原6-(1-萘氧基甲酰胺基)-己酸(CNH)與熒光素的酰胺偶聯(lián)物。

按上述方案，所述熒光素選自下述任意一種：異硫氰酸熒光素乙二胺(EDF)，異硫氰酸熒光素丁二胺(BDF)，異硫氰酸熒光素己二胺(HDF)；所述熒光標記物具有表1所示的結構；

表1

按上述方案，所述熒光標記物優(yōu)選為CNH-EDF。

按上述方案，所述甲萘威單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NO:C201654的雜交瘤細胞株Jnw1D2分泌產(chǎn)生，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號：CCTCC NO:C201654，保藏日期：2016年3月29日。

按上述方案，所述一系列已知濃度的甲萘威標準品的溶液為100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL和0.001μg/mL 9個濃度梯度。

按上述方案，所述的配制熒光標記物溶液的溶劑為硼酸鹽緩沖溶液；所述熒光標記物的工作濃度為熒光標記物的熒光值是背景值硼酸鹽緩沖溶液10倍時對應的濃度，為5nM。

按上述方案，所述與熒光標記物有70％結合時對應的抗體稀釋倍數(shù)作為甲萘威單克隆抗體的工作濃度，為1ug/mL。

按上述方案，所述待測樣品的溶液體積為50μL，所述熒光標記物溶液和所述甲萘威單克隆抗體溶液的體積分別為500μL。

按上述方案，所述競爭反應的溫度為20-25℃，優(yōu)選為25℃，時間為5-10min，優(yōu)選為10min。

按上述方案，所述熒光偏振值的測定條件為：激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm。

按上述方案，所述待測樣品可為水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品。具體可為草莓；

檢測前，將草莓前處理得到待測樣品基質溶液，所述的前處理為：將草莓樣品搗碎，加乙腈勻漿，將過濾液收集到含有氯化鈉的離心管中，離心收集上清提取液，充分蒸干溶劑，加甲醇溶解樣品殘渣得到樣品基質溶液；

檢測樣品為草莓時，選擇空白草莓樣品前處理得到的樣品基質溶液配置一系列已知濃度的甲萘威標準品的溶液，進行FPIA實驗得到草莓基質標準曲線。

上述方法在農(nóng)產(chǎn)品中甲萘威含量檢測中的應用。

本發(fā)明的檢測原理：甲萘威單克隆抗體與熒光素標記的甲萘威半抗原特異性結合，使得熒光素的熒光偏振信號值增加。而待測樣品存在甲萘威時(或甲萘威標準品存在時)，甲萘威與熒光素標記的甲萘威半抗原競爭結合甲萘威單克隆抗體，使得與甲萘威單克隆抗體結合的熒光素標記的甲萘威半抗原減少，且熒光偏振信號值隨著待測甲萘威濃度的增加而降低，由此本發(fā)明可基于高靈敏高特異性的甲萘威單克隆抗體實現(xiàn)對甲萘威的快速高靈敏定量檢測。

本發(fā)明的有益效果是：

現(xiàn)有的甲萘威檢測技術操作繁瑣耗時，不能滿足高通量快速檢測的要求，而且其他免疫分析方法大多為非均相反應，需要多步孵育和洗滌步驟，耗時長，操作復雜。針對這些不足，本發(fā)明提供了一種均相的、快速的甲萘威熒光偏振免疫檢測方法(Fluorescence Polarization Immunoassay,FPIA)方法只需要加樣，無需分離和洗滌操作，十分鐘內就可獲得檢測結果。本發(fā)明建立的甲萘威熒光偏振免疫分析方法在硼酸鹽緩沖溶液中標準曲線的靈敏度為82.3ng/mL，檢測范圍為17.7-383.4ng/mL，在樣品中的檢測靈敏度為108.6μg/kg，檢測范圍為32.4-363.6μg/kg；該方法快速、簡便高通量，而且能夠滿足甲萘威的殘留檢測限量要求，非常適合草莓樣品中甲萘威的檢測需求。

附圖說明

圖1為硼酸鹽緩沖液中甲萘威熒光偏振免疫檢測的標準曲線。

圖2為草莓樣品基質中甲萘威熒光偏振免疫檢測的標準曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法：下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特設說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所使用的甲萘威單克隆抗體為雜交瘤細胞株Jnw1D2所分泌的單克隆抗體。具體獲得方法：

雜交瘤細胞株Jnw1D2的篩選

1.動物免疫

購買6周齡BALB/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)，獲得甲萘威完全抗原CNH-BSA，免疫小鼠。第一次免疫將甲萘威完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點注射。第二次免疫于3周后進行，采用弗氏不完全佐劑與等體積的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠頸背部皮下多點注射。第三次與第四次免疫分別與上一次免疫間隔兩周，免疫方式與第二次相同。四次免疫劑量相同，僅為100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清效價，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價、靈敏度均相對較高的血清對應的小鼠進行加強免疫，免疫劑量為之前量的2倍。

2.細胞融合

于加強免疫3天后，采用50％(重量百分數(shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進行細胞融合，具體步驟：無菌條件下脫頸處死待融合小鼠，分離脾細胞，與鼠源骨髓瘤細胞SP2/0以5：1的個數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液洗混合細胞，1200rpm，離心5min。棄去上清，控干，加入1mL PEG，融合1分鐘，緩慢加入RPMI-1640基礎培養(yǎng)液，離心，棄上清，沉淀即為融合細胞，用20mL HAT完全培養(yǎng)基重懸，將懸起的細胞加入到80mL半固體培養(yǎng)基中，混勻后加到6孔細胞培養(yǎng)板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

所述的含1％HAT的細胞完全培養(yǎng)基含有20％(體積百分數(shù))胎牛血清，75％(體積百分數(shù))RPMI-1640基礎培養(yǎng)液，1％(重量百分數(shù))L-谷氨酰胺，1％(體積百分數(shù))HEPES，1％(體積百分數(shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素)，2％(體積百分數(shù))生長因子(HFCS)和1％(重量百分數(shù))次黃嘌呤-氨基蝶嶺-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纖維素購于sigma-Aldrich公司。

3.細胞株的篩選及克隆

待細胞融合后2-3周，細胞集落長至肉眼可見時，用微量移液器將克隆從培養(yǎng)基中挑出，轉移至96孔細胞培養(yǎng)板采用HAT液體培養(yǎng)，待細胞長至2/3孔底時，吸取培養(yǎng)上清進行檢測。采用兩步篩選法，第一步采用間接ELISA方法，篩選出抗甲萘威而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔進行檢測，用甲萘威作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競爭原為0的孔即陽性對照孔的最終測定值較高，靈敏度較高指抑制率為50％時的競爭原濃度亦IC50值較小)，采用有限稀釋法進行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步法進行檢測，如此重復亞克隆4-5次后，獲得雜交瘤細胞株Jnw1D2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號：CCTCC NO:C201654，保藏日期：2016年3月29日。

4.抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細胞株Jnw1D2抗體可變區(qū)序列測定。

(1)提取總RNA：采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細胞株Jnw1D2的總RNA；

(2)合成cDNA：以步驟1獲得的總RNA為模板，oligo(dT)15為引物，按照SuperScript^TM-2II反轉錄酶說明書進行反轉錄，合成cDNA第一鏈；引物oligo(dT)15由Invitrogen購得；

(3)PCR法克隆可變區(qū)基因：根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點設計引物，以cDNA為模板擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序為：94℃30s、58℃45s、72℃1min，擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1％(重量百分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接在載體pMD18-T中，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序。其中引物的序列分別為：重鏈可變區(qū)引物為5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和輕鏈可變區(qū)引物為5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和5’-CAG GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG G-3’(21mer)。

得到的基因序列結果：重鏈可變區(qū)編碼基因序列長339bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由113個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長315bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由105個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:4所示。

5.抗甲萘威單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定

將獲得的抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細胞株Jnw1D2注射預先用弗氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為：用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μL，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上。12000r/min，4℃離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/L和pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)該混合液的pH至7.4，冰浴中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4℃靜置2h以上，然后12000r/min，4℃離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10體積的摩爾濃度為0.01mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/LPBS透析兩天，再改用PB透析兩天，將透析袋中蛋白溶液取出，離心，收集上清，棄沉淀，放入-70℃預凍后放入凍干機中凍干。收集凍干粉，即為純化好的抗甲萘威單克隆抗體；

所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得。

用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株Jnw1D2分泌的抗甲萘威單克隆抗體的亞型為IgG2b。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測得抗體的效價可達1.6×10⁴。對甲萘威的50％抑制濃度IC₅₀為0.668ng/kg，與克百威、涕滅威、滅多威等無交叉反應

實例1、熒光標記物的制備

步驟1：甲萘威半抗原合成中間體(1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯)的制備

在1L四口瓶中裝上電動攪拌，配置溫度計及恒壓滴液漏斗，室溫加入240mL二氯甲烷，33mL三乙胺，31.7g甲萘酚，攪拌溶解后，用低溫反應浴降至0℃；將40.2g對硝基氯甲酸苯酯溶于60mL二氯甲烷溶液中，慢慢滴加到上述溶液中，產(chǎn)生白煙，溶液的顏色變化隨著滴加變深，1h滴加完畢后，保溫反應3h，TLC監(jiān)控原料反應完全(展開劑：二氯甲烷：石油醚＝1:3)；加入360mL 3％的鹽酸，攪拌約30min，分液，合并有機相，用300mL水洗滌2次至中性；用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至約60mL，加入180mL甲基叔丁基醚，冷卻有固體析出，抽濾得到白色固體即為甲萘威半抗原合成中間體。

步驟2：甲萘威半抗原CNH的合成

在1L四口瓶中裝上電動攪拌，配置溫度計及恒壓滴液漏斗，室溫加入360mL飽和碳酸氫鈉溶液和9.6g 6-氨基己酸，攪拌至固體溶解后，用低溫反應浴降溫至0℃；將12g中間體(中間體與6-氨基己酸的摩爾比為1:2)溶解在360mL氫呋喃中的溶液，緩慢滴加到上述溶液中，溶液顏色變?yōu)辄S色，逐漸由固體析出，1h滴加完畢，室溫攪拌過夜；抽濾，濾液用3mol/L鹽酸調至pH＝4～5，用300mL乙酸乙酯分3次萃取，合并有機相；用無水硫酸鈉干燥后，減壓脫去溶劑，得10g黃色油狀物，加入10mL乙酸乙酯和30mL甲基叔丁基醚，進行重結晶，得淡粉色固體。

步驟3：異硫氰酸熒光素乙二胺EDF的合成

稱取200mg(1.5mmol)乙二胺鹽酸鹽溶解于50mL甲醇和0.5mL三乙胺混合液中，標為A液；稱取117mg(0.3mmol)FITC溶于10mL甲醇和100μL三乙胺混合液中，標為B液。將B液在30min內逐滴加入到A液中，室溫避光攪拌反應2h后，避光靜置反應過夜。用濾紙過濾生成的橙色沉淀，用10mL甲醇洗滌沉淀，室溫避光放置自然干燥，即為EDF。熒光素BDF和HDF的合成方法與之類似。

步驟4：熒光標記物的合成

以CNH-EDF為例，合成方法如下：

稱取4mg DCC和2mg NHS至500μL DMF中，混合均勻后加入3mg甲萘威半抗原CNH，室溫振搖反應12h。接著加入2mg EDF至上述活化的CNH中，繼續(xù)室溫避光反應4h。取50μL反應液用薄層色譜法(TLC)分離，展開劑為：三氯甲烷/甲醇(v:v,4:1)。刮取硅膠板上R_f＝0.9的黃色條帶，甲醇洗脫，檢測備用。經(jīng)質譜鑒定，CNH-EDF產(chǎn)物峰m/z為733.23[M+H]⁺。

其他熒光標記物CNH-BDF和CNH-HDF的反應步驟與EDF的標記方法類似，熒光標記物置于4℃保存。

實例2、最佳熒光標記物的篩選

步驟一：首先將各熒光標記物的工作濃度均設定為熒光強度為硼酸鹽緩沖溶液背景熒光強度的10倍時對應的熒光標記物的濃度(5nM)，將抗體用硼酸鹽緩沖溶液按照1/125、1/250、1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000和1/32000稀釋，繪制抗體結合曲線，獲得信號強度變化的最大值δmP(δmP＝mP_max-mP_min)，其中CNH-EDF的信號變化值最大。實驗結果如表2所示：

表2三種熒光標記物與抗體結合的信號強度

步驟二：首先將各熒光標記物的工作濃度均設定為熒光強度為BB緩沖溶液(硼酸鹽緩沖溶液)背景熒光強度的10倍時對應的熒光標記物的濃度(5nM)，在與熒光標記物有70％結合時的抗體稀釋度(1μg/mL)條件下，建立不同標記物的甲萘威檢測標準曲線并計算IC₅₀，根據(jù)各標準曲線的IC₅₀值選出最佳熒光標記物。實驗結果如表3所示。

表3

由表3可知，最佳的熒光標記物為CNH-EDF。

實例3、FPIA方法的建立

步驟一：競爭FPIA；硼酸鹽緩沖液配制：稱取0.47mg Na₂B₄O₇，0.05mg NaN₃溶解于0.5mL高純水中，pH值為8.5。

利用含10％甲醇的硼酸鹽緩沖液分別配置100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL和0.001μg/mL 9個濃度梯度的甲萘威標準品，在反應試管中分別加入50μL甲萘威標準品、500μL工作濃度(5nM)的熒光標記物以及500μL工作濃度(1μg/mL)的甲萘威單克隆抗體溶液，室溫避光孵育10min后測定熒光偏振值；測定條件為激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長530nm，cutoff值515nm。

步驟二：繪制標準曲線：競爭反應結束后，以測定的熒光偏振值為縱坐標，甲萘威標準品的濃度為橫坐標，利用Origin 9.0的四參數(shù)模型擬合標準曲線。

硼酸鹽緩沖溶液中的甲萘威熒光偏振標準曲線見附圖1.

所建立的標準曲線的靈敏度為82.3ng/mL，檢測范圍為17.7-383.4ng/mL。

實例4、樣品檢測應用例

步驟一：稱取搗碎后的草莓空白樣品(經(jīng)液相色譜法檢測確定不含甲萘威)20.0g，加入20.0mL乙腈中，高速勻漿2min后，過濾到裝有4g氯化鈉的50mL離心管中，劇烈震蕩3min，5000g離心2min，吸取上清提取液10mL到燒杯中，80℃水浴加熱，杯內通入氮氣，蒸發(fā)至近干，加入10mL甲醇溶解樣品殘渣即得樣品基質溶液。用樣品基質溶液分別配置100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL和0.001μg/mL 9個濃度梯度的甲萘威標準品。依次加入50μL甲萘威基質加標溶液，500μL熒光標記物溶液和500μL甲萘威單克隆抗體溶液，25℃孵育5min后進行FPIA檢測。根據(jù)熒光偏振信號與甲萘威標準品濃度之間的相關性即得到草莓樣品中甲萘威檢測的標準曲線也就是圖2。草莓基質中甲萘威的檢測靈敏度為108.6μg/kg，檢測范圍為32.4-363.6μg/kg；國際標準中規(guī)定水果中甲萘威最高殘留限量為1mg/kg，因此本發(fā)明的方法能夠很好的滿足檢測靈敏度的需要。

步驟二：添加回收率測定；草莓空白基質中加入甲萘威標準品，使其終濃度為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg，每個濃度三個平行，按照上述樣品處理方法處理并檢測，按照如下公式計算添加回收率。

添加回收率(％)＝(測定值/添加值)×100％

利用計算獲得的檢測回收率來評價本發(fā)明所建立的甲萘威熒光偏振免疫檢測方法的準確度；實驗結果見表4所示：

表4草莓中添加回收結果(n＝3)

由表4可見，甲萘威在草莓中的平均添加回收率在90.2-105.6％之間，變異系數(shù)(CV)小于6.7％；表明本發(fā)明建立的甲萘威熒光偏振免疫檢測方法可滿足草莓中甲萘威的殘留檢測要求；而且本發(fā)明快速高效、反應靈敏，解決了傳統(tǒng)免疫方法操作復雜、耗時長的缺點，能夠很好地用于甲萘威的快速、高靈敏檢測。

序列表

＜110＞ 中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所

＜120＞ 一種用于檢測甲萘威的熒光偏振免疫分析方法

＜160＞ 4

＜210＞ 1

＜211＞ 339bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 1

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag 50

cctgtccatc acttgcactg tctctgggct ttcattaacc agctatggtg 100

tacactgggt tcgtcaggcc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta 150

atttggggtg gtggaaacac aaattataat tcggctctca tgtccagact 200

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gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcgtca 339

＜210＞ 1

＜211＞ 315bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 2

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga 50

aagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattagt agctatttag 100

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gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaa 315

＜210＞ 1

＜211＞ 113

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile

1 5 10 15 20

Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala

25 30 35 40

Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn

45 50 55 60

Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Arg Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Met

81 85 90 95 100

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

105 110 113

＜210＞ 1

＜211＞ 105

＜212＞ PRT

＜213＞ 小鼠

＜400＞ 4

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr

1 5 10 15 20

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Gln Gln Lys Pro

25 30 35 40

Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser

45 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

85 90 95 100

Gly Thr Lys Leu Glu

105