本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用SERS探針檢測(cè)水果或蔬菜氧化還原水平的方法。

背景技術(shù)：

生物體內(nèi)氧化還原水平對(duì)個(gè)體來說至關(guān)重要，許多疾病的發(fā)生都伴隨著氧化還原水平的改變，可以說氧化還原水平在一定程度上反映了個(gè)體的健康狀況。體內(nèi)氧化還原水平是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，其中包括了過氧化氫、羥基自由基、單線態(tài)氧等活性氧分子，相關(guān)的氧化酶以及如還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽等小分子的氧化還原對(duì)、活性氮，抗氧化物質(zhì)等。這些分子相互作用，互相轉(zhuǎn)換，最終使得體內(nèi)的氧化還原達(dá)到了微妙的平衡狀態(tài)。對(duì)于單個(gè)細(xì)胞而言，其新陳代謝過程、分化以及凋亡或者壞死的過程都伴隨著電位的變化；對(duì)于個(gè)體而言，個(gè)體氧化還原水平發(fā)生變化，個(gè)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)可能出現(xiàn)嚴(yán)重問題，而氧化應(yīng)激是由于體內(nèi)氧化性物質(zhì)含量過高而產(chǎn)生的，人體長(zhǎng)時(shí)間處于這種狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥的發(fā)生等。

藥物和果蔬是人體獲取抗氧化物質(zhì)最主要的兩個(gè)途徑，果蔬中抗氧化物質(zhì)含量很高且不具有毒副作用。因?yàn)樗褪卟吮蛔C明富含天然抗氧化物質(zhì)，如酚類化合物、黃酮類，維他命C等。因此，如何快速且簡(jiǎn)便地檢測(cè)果蔬氧化還原水平對(duì)人類的日常健康生活以及食品的加工管理具有重大的意義。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括：硫氰酸鹽法，總氧自由基清除能力測(cè)定(TOSCA)，總抗氧化能力檢測(cè)法(TEAC)，氧自由基吸收能力檢測(cè)(ORAC)，二苯基苦酰肼基自由基清除能力評(píng)價(jià)法(DPPH)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)清除能力評(píng)價(jià)法，三價(jià)鐵還原能力評(píng)價(jià)(FRAP)等。

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)作為一種有發(fā)展?jié)摿Φ墓庾V分析技術(shù)，在化學(xué)、物理、生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、公共安全等各個(gè)方面得到了一定的應(yīng)用。無毒性、無損、靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)是其巨大的優(yōu)勢(shì)。因此，結(jié)合拉曼技術(shù)在果蔬氧化還原水平的評(píng)價(jià)方面具有很大的前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：提供一種使用SERS探針檢測(cè)水果或蔬菜氧化還原水平的方法，使用該方法可靈敏、定量地檢測(cè)水果或蔬菜的氧化還原水平，可重復(fù)性好。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種使用SERS探針檢測(cè)水果或蔬菜氧化還原水平的方法，包括以下步驟：

1)在納米SERS基底表面修飾具有明顯SERS信號(hào)且對(duì)氧化還原水平敏感的信號(hào)分子，獲得氧化還原檢測(cè)探針1；在納米SERS基底表面修飾具有明顯SERS信號(hào)且對(duì)pH敏感的信號(hào)分子，獲得pH檢測(cè)探針2；

2)獲得氧化還原檢測(cè)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系；

3)將pH檢測(cè)探針2滴加到水果或蔬菜的切口上，通過SERS檢測(cè)其pH值；根據(jù)氧化還原檢測(cè)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及待測(cè)水果或蔬菜的pH值，計(jì)算待測(cè)水果或蔬菜本身pH值對(duì)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值的影響；將氧化還原檢測(cè)探針1滴加到水果或蔬菜的切口上，待探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度不變時(shí)，記錄其特征峰強(qiáng)度的比值，并扣除待測(cè)水果或蔬菜本身pH值對(duì)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值的影響，評(píng)價(jià)水果或蔬菜的氧化還原水平。

常見的納米SERS基底包括金銀納米球基底、金銀納米星基底、金銀納米花基底、金銀納米棒基底、金納米三角片基底以及金納米殼基底等，因此選擇金、銀或金銀復(fù)合納米材料作為納米SERS基底；由于金納米殼在同等濃度的條件下其SERS增強(qiáng)效果高于上述的其他材料且組裝過程更加簡(jiǎn)單，材料更加穩(wěn)定，選擇金納米殼材料作為納米SERS基底；由于直徑在165～175nm范圍的金納米殼紫外-可見光吸收峰在700nm，為近紅外區(qū)域，與拉曼的激發(fā)波長(zhǎng)785nm接近，可以獲得強(qiáng)的SERS信號(hào)，因此，使金納米殼探針直徑為165～175nm。

步驟1)中，具有明顯SERS信號(hào)且對(duì)氧化還原水平敏感的信號(hào)分子為醌類衍生物，優(yōu)選為2-羧基蒽醌；具有明顯SERS信號(hào)且對(duì)pH敏感的信號(hào)分子為巰基苯甲酸、氨基苯硫酚、三硫代氰脲酸或5-巰基-2-硝基苯甲酸，優(yōu)選4-巰基苯甲酸。

步驟2)中，獲得氧化還原檢測(cè)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系的方法為：配制不同pH的緩沖液，將探針1分別與等體積不同pH的緩沖液在25℃共孵育30分鐘后，計(jì)算不同pH對(duì)應(yīng)的SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值，獲得特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

步驟3)中，所述使用探針2SERS檢測(cè)水果或蔬菜的pH值的方法為：獲得探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系；在待測(cè)水果或蔬菜切口上滴加探針2，待探針2的SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度不變時(shí)，記錄特征峰強(qiáng)度的比值，根據(jù)所述探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算待測(cè)水果或蔬菜的pH值。其中，獲得探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系的方法為：配制不同pH的緩沖液，將探針2分別與等體積不同pH的緩沖液在25℃共孵育30分鐘后，計(jì)算出不同pH對(duì)應(yīng)的SERS譜圖特征峰強(qiáng)度的比值，獲得探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

本發(fā)明工作原理：本發(fā)明利用具有明顯SERS信號(hào)且對(duì)pH和電位敏感的信號(hào)分子，將其修飾在金納米殼表面上，獲得探針1和探針2。金納米殼的直徑為165～175nm，直徑在該范圍內(nèi)的金納米殼，對(duì)785nm的激光有強(qiáng)烈的共振，結(jié)合785nm激光的穿透性，可實(shí)現(xiàn)表面甚至更深度的探針信號(hào)變化的檢測(cè)。其中，基于表面修飾2-羧基蒽醌的探針1，對(duì)氧化還原性物質(zhì)敏感反應(yīng)，產(chǎn)生SERS變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)果蔬等氧化還原態(tài)的評(píng)價(jià)；基于表面修飾4-巰基苯甲酸的探針2，對(duì)pH敏感，產(chǎn)生SERS變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)果蔬等pH的檢測(cè)。不同果蔬組織液內(nèi)還原性物質(zhì)的含量的不同，對(duì)探針分子的還原效率存在差異，通過對(duì)比相同時(shí)間段內(nèi)SERS信號(hào)的變化程度以及SERS信號(hào)的最終變化程度來實(shí)現(xiàn)果蔬內(nèi)還原性物質(zhì)定量的檢測(cè)。

本發(fā)明利用蒽醌衍生物(優(yōu)選2-羧基蒽醌)作為氧化還原敏感分子探針，4-巰基苯甲酸作為pH敏感分子探針是由于，當(dāng)2-羧基蒽醌與果蔬內(nèi)還原性物質(zhì)接觸時(shí)，其中間苯環(huán)連接的兩個(gè)羰基會(huì)被還原成羥基，從而發(fā)生官能團(tuán)的變化。通過表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)的表征，可以在低濃度的條件下靈敏檢測(cè)出結(jié)構(gòu)的變化，即SERS譜圖在1606cm^-1和1666cm^-1處的峰強(qiáng)度發(fā)生改變(還原水平越高，1666cm^-1對(duì)應(yīng)的峰值越低，而1606cm^-1對(duì)應(yīng)的峰值越高)。而4-巰基苯甲酸、三硫代氰脲酸以及4-氨基苯硫酚及它們的衍生物對(duì)pH敏感則是由于：其本身結(jié)構(gòu)內(nèi)的羧基、伯氨基或仲氨基會(huì)在不同pH的條件下，自身解離程度發(fā)生改變，從而引起自身空間結(jié)構(gòu)的改變，這類改變能夠反映到其對(duì)應(yīng)的SERS譜圖上，通過對(duì)譜圖的處理，從而計(jì)算出SERS與pH的對(duì)應(yīng)關(guān)系。但由于不同pH條件下，對(duì)應(yīng)的緩沖液的氧化還原水平(電位)存在差異，故本發(fā)明要結(jié)合氧化還原電位和pH進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，旨在于更加準(zhǔn)確的反映出不同果蔬等氧化還原水平的高低。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的特色及優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明直接將探針滴加到水果或蔬菜切口的果肉上，與果肉組織液相互作用，隨時(shí)間以及樣品的變化，SERS信號(hào)發(fā)生明顯變化，實(shí)現(xiàn)pH和氧化還原水平聯(lián)測(cè)的方法來進(jìn)行氧化還原水平的評(píng)價(jià)，和傳統(tǒng)方法相比，無須樣品前處理、不消耗額外試劑，有成本低、快速、簡(jiǎn)便、敏感且可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明有效利用了納米材料小的特性和顯微拉曼光譜儀的微區(qū)分辨特性，可以對(duì)水果或蔬菜的微小組織在微米分辨的水平上進(jìn)行原位實(shí)時(shí)檢測(cè)，如傳統(tǒng)的基于萃取前處理在檢測(cè)的方法是很難得到例如果皮等薄或小的組織進(jìn)行氧化還原水平檢測(cè)，因?yàn)楹茈y將這些薄或小的組織和其他組織完全分開用于萃取。

附圖說明

圖1顯示了基于金納米殼探針1、2SERS檢測(cè)果蔬氧化還原水平的方法的原理圖；圖1A顯示了探針2檢測(cè)果蔬pH原理，圖1B顯示了探針1檢測(cè)氧化還原水平(總抗氧化活性)原理圖，圖1C為待測(cè)樣品處理后的實(shí)物圖。

圖2顯示了金納米殼電鏡圖；圖2A為高濃度金納米殼的掃描電鏡圖；圖2B為高分散的金納米殼掃描電鏡圖；圖2C為高分散性的金納米殼的透射電鏡圖；圖2D為金納米殼吸附濃度為10^-6mol/L的羅尼蘭A后的SERS譜圖。

圖3顯示了探針1對(duì)還原性物質(zhì)的敏感性以及其可重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果；圖3A為拉曼光譜儀表征的用5mM NaBH₄和10mM H₂O₂處理探針1，得到的探針1氧化態(tài)和還原態(tài)的SERS光譜圖；圖3B為依次用5mM NaBH₄和10mM H₂O₂對(duì)探針1交替處理，SERS光譜圖中特征峰1606Gm^-1和1666cm^-1比值的變化，可看出探針分子具有很好的可重復(fù)性。

圖4顯示了不同濃度還原劑對(duì)探針1譜圖的影響。由圖4可以看出，隨著原還劑濃度的提高，探針1譜圖的變化愈加明顯，這證明該探針1可用于還原性物質(zhì)的檢測(cè)，且0.1mM還原劑對(duì)應(yīng)的探針1的譜圖也表明探針1可用于生物樣品的檢測(cè)。

圖5顯示了探針1對(duì)陜西紅富士蘋果氧化還原水平評(píng)價(jià)的結(jié)果；圖5A為未進(jìn)行修飾的金納米殼以及探針1在蘋果切面反應(yīng)50min前后SERS譜圖對(duì)比；圖5B為探針1在蘋果切面反應(yīng)900min內(nèi)SERS譜圖變化的記錄；圖5A通過將實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的對(duì)比，以及各組不同時(shí)間的對(duì)比，可以得出以下結(jié)論：1)在檢測(cè)生物樣品時(shí)，生物體本身沒有對(duì)檢測(cè)造成干擾；2)SERS譜圖的變化僅是由于探針1中的信號(hào)分子被還原，與其他條件沒有關(guān)系。

圖6顯示了探針2對(duì)不同果蔬pH的檢測(cè)結(jié)果；圖6A為探針1SERS強(qiáng)度-pH的折線圖；圖6B為不同果蔬pH值的條形圖。

圖7顯示了不同pH對(duì)探針1SERS譜圖的影響；圖7A為不同pH下探針1的SERS譜圖，圖7B為對(duì)應(yīng)圖7A的不同pH下特征峰強(qiáng)度比值的折線圖；通過圖7A和圖7B中數(shù)據(jù)的表征，可以使得探針1在評(píng)價(jià)氧化還原水平時(shí)排除由于樣品本身pH存在差異而無法進(jìn)行不同種類果蔬之間橫向比較的情況，使得探針1、2的應(yīng)用范圍更加廣泛、實(shí)用且具有準(zhǔn)確性。

圖8顯示了不同水果氧化還原水平的評(píng)價(jià)結(jié)果；圖8A為未排除水果自身pH不同影響情況下探針1SERS特征峰強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況，從圖中還能看出不同果蔬對(duì)應(yīng)的還原速率的快慢也存在差異；圖8B為排除水果自身pH不同影響情況下的檢測(cè)結(jié)果圖，圖8B中的結(jié)果相比圖8A更具說服力。

圖9顯示了在實(shí)施例4中對(duì)應(yīng)的檢測(cè)樣品，圖9A和圖9B分別對(duì)應(yīng)新鮮蘋果切塊和變質(zhì)水果切塊，圖9C和圖9D分別對(duì)應(yīng)新鮮蘋果切塊未滴加探針區(qū)域和滴加探針區(qū)域在顯微鏡下的圖像。從圖9C和圖9D中可以看出，在顯微鏡下，樣品的果皮和果肉存在明顯差異，這體現(xiàn)出顯微拉曼的巨大用途以及納米級(jí)探針的巨大潛力所在。顯微拉曼和納米級(jí)探針的結(jié)合可以做到微小樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。

圖10為實(shí)施例4所得到的評(píng)價(jià)結(jié)果，10A為紅富士不同區(qū)域(新鮮果皮、果肉以及變質(zhì)果皮、果肉)對(duì)應(yīng)的pH；圖10B為紅富士不同區(qū)域(新鮮果皮、果肉以及變質(zhì)果皮、果肉)對(duì)應(yīng)的氧化還原水平的評(píng)價(jià)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

金納米殼的合成：首先在直徑約為110nm的SiO₂表面進(jìn)行氨基化修飾并吸附2-3nm的金納米顆粒形成復(fù)合顆粒，所形成的復(fù)合顆粒為金納米殼生長(zhǎng)前體物；再以過氧化氫為還原劑，在前體物表面的催化下不斷還原氯金酸并不斷沉積在其表面，從而形成一定厚度的完整的金納米殼。而后3000rpm離心10min，棄上清，收集沉淀，重懸(OD_700nm＝1.0)。取上述重懸液7mL，加入3μL 0.02M新配置的氫氟酸水溶液，放入磁子攪拌待顏色無變化后收集，離心重懸(OD_700nm＝2.0)，避光保存?zhèn)溆?。圖2顯示了金納米殼電鏡圖；圖2A為高濃度金納米殼的掃描電鏡圖，可用于評(píng)價(jià)所制備的金納米殼的均一性和分散性；圖2B為高分散的金納米殼掃描電鏡圖；圖2C為高分散性的金納米殼的透射電鏡圖，表明其為核殼結(jié)構(gòu)；圖2D為金納米殼吸附濃度為10^-6mol/L的羅尼蘭A后的SERS譜圖，由圖2D可以看出，該金納米殼具有很好的拉曼增強(qiáng)效果。

氧化還原檢測(cè)探針1的合成：

取一支體積為50mL的離心管，向其中加入20mL的二甲基亞砜(DMSO)，用天平稱取100毫克2-羧基蒽醌、80毫克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)以及115毫克N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于DMSO中，超聲混勻，并在室溫下反應(yīng)3小時(shí)后，加入22.5毫克胱胺二鹽酸鹽，超聲混勻，放置在4℃冰箱內(nèi)反應(yīng)10小時(shí)，移除沉淀，取出100μL加入到3mL的金納米殼溶液(OD₇₀₀為2.0)中，共孵育6小時(shí)后，離心清洗3次并重懸，將探針1配制成濃度為10⁹個(gè)/mL的探針溶液。

pH檢測(cè)探針2的合成：取一離心管，加入1mL，1mM的4-巰基苯甲酸，再加入100μL的金納米殼溶液(OD₇₀₀為2.0)中，共孵育3小時(shí)，用乙醇多次清洗、離心，最后重懸，將探針2配制成濃度為10⁹個(gè)/mL的探針溶液。

原理驗(yàn)證：

取濃度分別為10mM，5mM，2.5mM，1mM，0.5mM，0.25mM，0.1mM的NaBH₄各9900μL分別與100μL濃度為10⁹個(gè)/mL探針1溶液混合，反應(yīng)5分鐘后，離心清洗2次，重懸，再將其滴在已經(jīng)氨基化修飾后的載玻片上，然后使用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜的檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著NaBH₄濃度的提高，1666cm^-1處的峰值強(qiáng)度降低，這表明探針可用于還原性物質(zhì)的檢測(cè)，該探針分子在不低于0.1mM的濃度范圍內(nèi)都具有靈敏性，而這恰能夠滿足生物體內(nèi)的還原能力。

實(shí)施例2

探針1和探針2的合成參照實(shí)施例1的方法，本實(shí)施例不再贅述。

空白對(duì)照組：將未進(jìn)行修飾的的金納米殼溶液(OD₇₀₀為2.0)直接滴在如圖1C中實(shí)物圖所示的已暴露出果肉的蘋果的切面上，本實(shí)施例以陜西紅富士蘋果為例。利用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀分別記錄50分鐘內(nèi)SERS光譜變化情況。圖5A中，NS+Shanxi Fuji 0min表示將未進(jìn)行修飾的金納米殼溶液直接滴在蘋果的切面上0min時(shí)的SERS譜圖，NS+Shanxi Fuji 50min表示將未進(jìn)行修飾的金納米殼溶液直接滴在蘋果的切面上50min時(shí)的SERS譜圖。

實(shí)驗(yàn)組：用移液槍吸取1μL濃度為10⁹個(gè)/mL的探針1的溶液滴加在如圖1中所示的暴露出果肉的陜西紅富士蘋果切面上，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀對(duì)探針1在蘋果表面900分鐘內(nèi)SERS光譜變化進(jìn)行記錄。圖5A中，(AQ+NS)+Shanxi Fuji 0min表示將探針1的溶液直接滴在蘋果的切面上然后進(jìn)行檢測(cè)的最初始的SERS譜圖，(AQ+NS)+Shanxi Fuji 50min表示將探針1的溶液直接滴在蘋果的切面上50min時(shí)的SERS譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從圖5A中可以看出，反應(yīng)50分鐘前后，空白組未進(jìn)行功能化分子修飾的金納米殼的譜圖并沒有明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組探針1的譜圖，尤其是特征峰1666cm^-1處的強(qiáng)度，發(fā)生了明顯變化。對(duì)實(shí)驗(yàn)組探針1進(jìn)行的900分鐘SERS光譜變化的記錄參見圖5B，可以看出特征峰1666cm^-1處的強(qiáng)度的變化規(guī)律是：0～30分鐘內(nèi)，特征峰強(qiáng)度隨時(shí)間增加而降低，表明該時(shí)間段內(nèi)探針1逐漸被蘋果中的還原性物質(zhì)還原；30～120分鐘內(nèi)特征峰強(qiáng)度幾乎不發(fā)生明顯變化，表明該時(shí)間段內(nèi)探針1已與蘋果中的還原性物質(zhì)充分反應(yīng)，氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定；120～900分鐘，隨時(shí)間的增加，特征峰強(qiáng)度也逐漸增加，表明該時(shí)間段內(nèi)探針1逐漸被空氣氧化。該結(jié)果一方面表明了探針1對(duì)果蔬原位檢測(cè)的可行性，另一方面表明，探針1可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地檢測(cè)被檢測(cè)對(duì)象的氧化還原態(tài)的變化，并且探針1的氧化還原狀態(tài)具有可逆性，可重復(fù)使用。

實(shí)施例3

探針1和探針2的合成參照實(shí)施例1的方法，本實(shí)施例不再贅述。

繪制探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值-pH折線L1：將濃度均為0.1M的磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉以及氫氧化鈉溶液分別進(jìn)行不同體積的混合，用pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，配制成不同pH的緩沖液；然后，將濃度為10⁹個(gè)/mL的探針1溶液分別與10倍體積的不同pH的緩沖液共孵育30分鐘后，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同pH對(duì)應(yīng)的光譜圖，每個(gè)pH檢測(cè)10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終譜圖，如圖7A所示。計(jì)算出其在特征峰1606cm^-1和1666cm^-1處強(qiáng)度的比值，繪制強(qiáng)度的比值-pH的折線圖，如圖7B所示。

繪制探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值-pH折線L2：將濃度均為0.1M的磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉以及氫氧化鈉溶液分別進(jìn)行不同體積的混合，用pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，配制成不同pH的緩沖液；然后，將濃度為10⁹個(gè)/mL的探針2溶液分別與10倍體積的不同pH的緩沖液共孵育30分鐘后，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同pH對(duì)應(yīng)的光譜圖，每個(gè)pH檢測(cè)10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終譜圖。通過計(jì)算出其在pH特征峰1076cm^-1和1380-1400cm^-1處強(qiáng)度的比值，繪制了強(qiáng)度-pH的折線圖，如圖6A所示。

檢測(cè)待測(cè)水果或蔬菜的pH值：按照實(shí)施例2中的步驟，在不同水果(包括陜西紅富士、新疆庫(kù)爾勒香梨、青蛇果、金帥蘋果、云南水晶梨、貢梨)切面上分別滴加探針1、2的溶液，如圖1C所示，圖1C蘋果切面左側(cè)樣斑為探針2樣斑，右側(cè)樣斑為探針1樣斑。用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀檢測(cè)不同水果切面探針1、2SERS譜圖，并將不同水果切面探針1、2SERS譜圖中。更具體地，將1μL濃度為10⁹個(gè)/mL的探針2溶液滴加在不同果蔬的切面，30分鐘后記錄其對(duì)應(yīng)的SERS譜圖，每個(gè)樣品記錄10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終的譜圖；計(jì)算出不同水果平均譜圖中的特征峰1380-1400cm^-1和1076cm^-1處強(qiáng)度的比值，再參照?qǐng)D6A，根據(jù)強(qiáng)度比值找出對(duì)應(yīng)的pH值，進(jìn)而繪制出圖6B所示的不同果蔬pH值的條形圖，其結(jié)果符合客觀事實(shí)，且能夠說明探針2的實(shí)用性和在體檢測(cè)的可行性。

檢測(cè)水果或蔬菜氧化還原水平：按照實(shí)施例2的方法，分別在不同水果(包括陜西紅富士、新疆庫(kù)爾勒香梨、青蛇果、金帥蘋果、云南水晶梨、貢梨)的切面上滴加1μL濃度為10⁹個(gè)/mL的探針1溶液，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同水果對(duì)應(yīng)的光譜變化。其中，在每個(gè)果蔬切面探針1樣斑處選擇3個(gè)固定點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，最后再求出相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)光譜的平均譜圖。通過計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)不同水果的譜圖在特征峰1606cm^-1和1666cm^-1處強(qiáng)度的比值的變化，繪制出如圖8A所示的折線圖。從圖中可以看出，隨著時(shí)間推移，折線逐漸平穩(wěn)，當(dāng)折線變平穩(wěn)后所對(duì)應(yīng)的值，應(yīng)與該探針1的氧化還原水平成正比，該值的大小直接反映出待測(cè)果蔬樣品氧化還原能力的高低。由于從圖7B中可以看出，pH變化會(huì)對(duì)探針1的SERS譜圖產(chǎn)生影響，因此需要從圖8A中扣除由于水果本身pH差異所帶來的SERS譜圖影響。結(jié)合反應(yīng)探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值與pH關(guān)系的折線L1，以及測(cè)得的不同水果對(duì)應(yīng)的pH，可以得出不同水果所應(yīng)扣除的基礎(chǔ)值，再將圖8A中平穩(wěn)處對(duì)應(yīng)的值減去所得到的水果本身pH影響的基礎(chǔ)值，獲得最終的校正后的條形圖，圖8B。從圖中可以看出不同水果的氧化還原水平差異性明顯，且相對(duì)于圖8A的結(jié)果也存在差異，也使得檢測(cè)的結(jié)果更加具有說服力。

實(shí)施例4

探針1和探針2的合成參照實(shí)施例1的方法，本實(shí)施例不再贅述。

繪制探針1SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值-pH折線L1：將濃度均為0.1M的磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉以及氫氧化鈉溶液分別進(jìn)行不同體積的混合，用pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，配制成不同pH的緩沖液；然后，將濃度為10⁹個(gè)/mL的探針1溶液分別與10倍體積的不同pH的緩沖液共孵育30分鐘后，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同pH對(duì)應(yīng)的光譜圖，每個(gè)pH檢測(cè)10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終譜圖，如圖7A所示，計(jì)算出其在特征峰1606cm^-1和1666cm^-1處強(qiáng)度的比值，繪制強(qiáng)度的比值-pH的折線圖，如圖7B所示。

繪制探針2SERS譜圖中特征峰強(qiáng)度的比值-pH折線L2：將濃度均為0.1M的磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉以及氫氧化鈉溶液分別進(jìn)行不同體積的混合，用pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，配制成不同pH的緩沖液；然后，將濃度為10⁹個(gè)/mL的探針2溶液分別與10倍體積的不同pH的緩沖液共孵育30分鐘后，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同pH對(duì)應(yīng)的光譜圖，每個(gè)pH檢測(cè)10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終譜圖，通過計(jì)算出其在pH特征峰1380-1400cm^-1和1076cm^-1處強(qiáng)度的比值，繪制了強(qiáng)度-pH的折線圖，如圖6A所示。

檢測(cè)待測(cè)變質(zhì)紅富士不同區(qū)域的pH值：按照實(shí)施例2中的步驟，在待測(cè)變質(zhì)紅富士不同區(qū)域的切面上分別滴加探針1、2的溶液，圖9中A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)待測(cè)變質(zhì)紅富士新鮮果肉及果皮切塊、變質(zhì)果肉及果皮切塊、新鮮果肉及果皮切塊未滴加探針區(qū)域在顯微鏡下的圖像、新鮮果肉及果皮切塊滴加探針區(qū)域的顯微鏡下的圖像。在蘋果切面的新鮮果皮果肉分界處滴加探針溶液，得到如圖9D所示的樣斑，D圖左側(cè)為新鮮果皮樣斑區(qū)域，右側(cè)為新鮮果肉樣斑區(qū)域。用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀檢測(cè)不同區(qū)域切面探針1、2SERS譜圖。更具體地，將1μL(OD₇₀₀＝2)的探針2溶液滴加在不同果蔬的切面，30分鐘后記錄其對(duì)應(yīng)的SERS譜圖，每個(gè)樣品記錄10個(gè)譜圖，并求出平均光譜作為最終的譜圖；計(jì)算出不同水果平均譜圖中的特征峰1380-1400cm^-1和1076cm^-1處強(qiáng)度的比值，再參照?qǐng)D6A，根據(jù)強(qiáng)度比值找出對(duì)應(yīng)的pH值，進(jìn)而繪制出圖10A所示的不同區(qū)域pH值的條形圖，其結(jié)果符合客觀事實(shí)，且能夠說明探針2的實(shí)用性和在體檢測(cè)的可行性。

檢測(cè)變質(zhì)紅富士不同區(qū)域氧化還原水平：按照實(shí)施例2的方法，分別在不同區(qū)域的切面上滴加1μL的探針1溶液(OD₇₀₀＝2)，用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀記錄不同水果對(duì)應(yīng)的光譜變化。其中，在每個(gè)切面探針1樣斑處選擇3個(gè)固定點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，最后再求出相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)光譜的平均譜圖。通過計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)不同區(qū)域的譜圖在特征峰1606cm^-1和1666cm^-1處強(qiáng)度的比值的變化。結(jié)合圖10A以及上述實(shí)施例3的數(shù)據(jù)處理方法，可以得到相對(duì)應(yīng)的不同區(qū)域校正后的的氧化還原水平的條形圖(圖10B)。結(jié)果表明新鮮果皮具有很高的還原性，而變質(zhì)區(qū)域的果肉和果皮的氧化還原水平接近，新鮮果肉區(qū)域的還原性在本組實(shí)驗(yàn)中最低。