本發(fā)明涉及熒光定量分析方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法。

背景技術(shù)：

點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)是美國(guó)化學(xué)家Sharpless在2001年提出的一種合成概念(Kolb et al.,2001.Angew.Chem.40,2004-2021.)。它具有模塊化、可靠、高效率、高選擇性、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物收率高、副反應(yīng)少、分離提純簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。其中Cu(I)催化含疊氮和含端炔基團(tuán)物質(zhì)Huisgen偶極環(huán)加成反應(yīng)(CuAAC反應(yīng))作為點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的其中一種，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域。

DNAzymes是一段具有催化活性的DNA序列，在1994年被Gerald Joyce和Ronald Breaker發(fā)現(xiàn)(Breaker,R.R.,Joyce,G.F.,1994.chem biol.1,223-229.)，具有穩(wěn)定性好，易合成，靈敏度高等特點(diǎn)。由于金屬離子作為DNAzymes的輔酶因子可以催化對(duì)應(yīng)的金屬離子依賴的DNA切割型DNAzymes特異性切割其對(duì)應(yīng)的DNA或RNA底物鏈，因此DNAzymes已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建金屬離子的傳感器，如Mg²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺，Hg²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺等(Liu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,12298-12305.；Yin et al.,C.Xie,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,14624-14625.；Zhou et al.,Anal.Chem.,2015,87,4001-4007.；Liu et al.,Angew.Chem.,2007,119,7731-7734.)。銅離子依賴的DNA切割型脫氧核酶(Cu(II)-DNAzyme，簡(jiǎn)稱Cu-Enzyme)被Carmi等人通過體外篩選技術(shù)第一次發(fā)現(xiàn)(Carmi et al.,Bioorg.Med.Chem.,2001,9,2589-2600.,Carmi et al.,Chem.Biol.,1996,3,1039-1046.)，從此Cu-Enzyme頻繁地被用于設(shè)計(jì)各種傳感平臺(tái)的Cu(II)檢測(cè)。例如Lu等人根據(jù)Cu-Enzyme可以在Cu(II)作為輔酶因子存在的情況下，不可逆的催化氧化分裂其對(duì)應(yīng)的基底鏈(Cu-Substrate，簡(jiǎn)稱Cu-Sub)而產(chǎn)生帶有熒光信號(hào)的短鏈DNA游離到溶液中使系統(tǒng)熒光增強(qiáng)的原理，設(shè)計(jì)了一個(gè)高靈敏的快速檢測(cè)Cu(II)的熒光傳感器(Liu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,9838-9839.)。Li等人設(shè)計(jì)了一種基于DNAzyme的新型的雙色熒光納米探針可以在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)Zn(II)和Cu(II)成像(Li et al.,Anal.Chem.,2015,87,4829-4835.)。Ge等人建立了一種基于自組裝的DNA多聯(lián)體和SYBR Green I的信號(hào)放大策略檢測(cè)Cu(II)(Ge et al.,Analyst,2013,138,4737-4740.)。雖然上述的基于Cu-Enzyme的熒光傳感器能夠高靈敏度地檢測(cè)Cu(II)。值得注意的是，傳統(tǒng)的Cu-Enzyme傳感系統(tǒng)容易受其他金屬離子干擾，如Co²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺等，導(dǎo)致非特異性的DNA斷裂，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。例如上述的Li課題組雖然能實(shí)現(xiàn)在活體細(xì)胞中Cu(II)的成像，但是金屬離子Ca²⁺，Mn²⁺，Co²⁺和Pb²⁺的存在也能夠引起可檢測(cè)到的熒光信號(hào)，特別是Pb²⁺，實(shí)驗(yàn)中必須加入掩蔽劑2,6-吡啶二羧酸(PDCA)來排除Pb²⁺的干擾。此外，在Ge課題組的測(cè)定結(jié)果中顯示Pb²⁺和Co²⁺的存在一定程度的干擾并且不能有效的消除。因此我們需要尋找一些方法來解決此問題，并提高傳感器的特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的Cu(II)-DNAzyme特異性不專一等問題，提出一種基于改進(jìn)的Cu(II)-DNAzyme的高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法，其包括如下步驟：

(1)分別設(shè)計(jì)并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1序列和Cu-Enzyme 2序列；

(2)將Cu-Enzyme 1鏈、Cu-Enzyme 2鏈和Cu-Sub鏈在50mM PBS緩沖溶液中雜交1h；

(3)在上述雜交液中加入2μL 1M SA和不同濃度的Cu(II)引發(fā)CuAAC和DNA切割反應(yīng)；

(4)在室溫下用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行樣品測(cè)量；

(5)根據(jù)收集的熒光強(qiáng)度信號(hào)，記錄監(jiān)測(cè)結(jié)果。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中的Cu-Sub序列為從左到右5’到3’：猝滅基團(tuán)-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-熒光基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中的Cu-Enzyme 1序列為從左到右5’到3’：猝滅基團(tuán)-GGTAAGCCTGGGCCTC-炔基。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中的Cu-Enzyme 2序列為從左到右5’到3’：疊氮基-TTTCTTTTTAAGAAAGAAC。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中的Cu-Sub鏈、Cu-Enzyme 1鏈和Cu-Enzyme 2鏈的濃度均為0.5μM，雜交溫度為37℃，使用到的緩沖溶液為50mM PBS緩沖溶液。緩沖溶液的具體組成為50mM PB，pH 7.4，10mM MgCl₂，50mM NaCl。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中引發(fā)CuAAC和DNA切割反應(yīng)的時(shí)間為2h。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)中設(shè)置的激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5.0nm，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，熒光發(fā)射光譜的收集范圍為490-600nm。

進(jìn)一步地，所述熒光分光光度計(jì)為日立的型號(hào)F4600的熒光分光光度計(jì)。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，優(yōu)點(diǎn)在于：首先，本發(fā)明的三種修飾DNA合成方法簡(jiǎn)單、快速、反應(yīng)條件溫和、容易控制，得到的DNA化合物具有良好的活性和穩(wěn)定性。其次，對(duì)于傳統(tǒng)Cu-Enzyme，雖然對(duì)于檢測(cè)Cu(II)具有較高的靈敏度，較快的反應(yīng)時(shí)間，但其它離子大量的存在也會(huì)干擾，因此限制了它在實(shí)際樣品中的測(cè)定，而本方法兼具了Cu-Enzyme的高靈敏度，又具備極好的特異性與專一性，使其它常見金屬離子不會(huì)干擾Cu(II)的測(cè)定。另外，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)熒光檢測(cè)具有高效，快速，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明；

圖1為本發(fā)明一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法的流程示意圖；

圖2為本發(fā)明一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法的原理示意圖；

圖3為本發(fā)明一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法的熒光檢測(cè)效果圖；

圖4為基于傳統(tǒng)的Cu(II)-Enzyme傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法的熒光檢測(cè)效果圖。

具體實(shí)施方式

如圖1-4之一所示，本發(fā)明公開一種基于高選擇性熒光傳感器檢測(cè)Cu(II)的方法，其包括如下步驟：

(1)分別設(shè)計(jì)并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1序列和Cu-Enzyme 2序列；具體地，參考文獻(xiàn)(Liu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,9838-9839.)，設(shè)計(jì)并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1和Cu-Enzyme 2序列。進(jìn)一步地，所述步驟(1)中的Cu-Sub序列為從左到右5’到3’：猝滅基團(tuán)-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-熒光基團(tuán)。Cu-Enzyme1序列為從左到右5’到3’：猝滅基團(tuán)-GGTAAGCCTGGGCCTC-炔基。Cu-Enzyme 2序列為從左到右5’到3’：疊氮基-TTTCTTTTTAAGAAAGAAC。

(2)將Cu-Enzyme 1鏈、Cu-Enzyme 2鏈和Cu-Sub鏈在50mM PBS緩沖溶液中雜交1h；具體地，將0.5μM的Cu-Enzyme 1，0.5μM的Cu-Enzyme 2與0.5μM Cu-Sub序列溶液在200μL的PBS緩沖溶液中37℃雜交1h，形成DNA三倍體雜交結(jié)構(gòu)，如圖1所示。使用到的緩沖溶液為50mM PBS緩沖溶液。緩沖溶液的具體組成為50mM PB，pH 7.4，10mM MgCl₂，50mM NaCl。

(3)在上述雜交液中加入2μL 1M SA和不同濃度的Cu(II)引發(fā)CuAAC和DNA切割反應(yīng)；形成的Cu-Enzyme能夠在分裂位點(diǎn)切割Cu-Sub序列鏈，此過程于37℃反應(yīng)2h。

(4)在室溫下用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行樣品測(cè)量；進(jìn)一步地，所述熒光分光光度計(jì)為日立的型號(hào)為F4600的熒光分光光度計(jì)(F4600Hitachi,Inc.)。所述步驟(4)中設(shè)置的激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5.0nm，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，熒光發(fā)射光譜的收集范圍為490-600nm。

(5)根據(jù)收集的熒光強(qiáng)度信號(hào)，記錄監(jiān)測(cè)結(jié)果。根據(jù)記錄的讀數(shù)擬合相關(guān)線性方程。隨著Cu(II)濃度升高，相對(duì)應(yīng)的熒光值升高。

本發(fā)明的具體應(yīng)用于自來水中Cu(II)濃度的檢測(cè)時(shí)的具體方法如下：

向0.5μM雜交過的DNA混合物中加入10mM SA和自來水樣品，37℃培育(2.0±0.05)小時(shí)，最后將200μL液體移置于熒光微量石英比色皿中于熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行檢測(cè)。記錄數(shù)據(jù)，算出該自來水中Cu(II)的含量。檢測(cè)結(jié)果顯示三組自來水品中Cu(II)濃度分別為0μM、0.27μM、0μM。

為了檢測(cè)本發(fā)明所述的方法對(duì)Cu(II)檢測(cè)的特異性，將本發(fā)明中所使用的Cu(II)換成其他干擾離子，分別為Cu²⁺,Pb²⁺,Fe³⁺,Ba²⁺,Sn²⁺,Ca²⁺,Ni²⁺,Cr³⁺,Ag⁺,Na⁺,K⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Co²⁺,Zn²⁺,Fe²⁺和空白溶液，Cu(II)的濃度為5μM，其他干擾離子的濃度均為100μM。

如圖3所示，對(duì)于改進(jìn)的Cu-Enzyme的傳感器，在Cu(II)存在的時(shí)候檢測(cè)到的明顯的增強(qiáng)的熒光信號(hào)，但是其它金屬離子的熒光強(qiáng)度幾乎與空白溶液是相同的，這表明，所提出的傳感器對(duì)其它金屬離子是沒有響應(yīng)的，并且所提出的Cu(II)傳感器有著顯著的特異性。

如圖4所示，對(duì)于傳統(tǒng)的Cu-Enzyme傳感器，Cu(II)也可以產(chǎn)生的增強(qiáng)的熒光信號(hào)。然而，100μM的其他金屬離子，如Pb²⁺,Ni²⁺,Ag⁺,Mg²⁺,Co²⁺,Zn²⁺等也能夠產(chǎn)生可測(cè)得的熒光信號(hào)變化，這表明傳統(tǒng)的Cu-Enzyme與改進(jìn)后的Cu-Enzyme相比，具有較差的特異性。這些結(jié)果清晰地證明了提出的改進(jìn)后的Cu-Enzyme具有高特異性。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，優(yōu)點(diǎn)在于：首先，本發(fā)明的三種修飾DNA合成方法簡(jiǎn)單、快速、反應(yīng)條件溫和、容易控制，得到的DNA化合物具有良好的活性和穩(wěn)定性。其次，對(duì)于傳統(tǒng)Cu-Enzyme，雖然對(duì)于檢測(cè)Cu(II)具有較高的靈敏度，較快的反應(yīng)時(shí)間，但其它離子大量的存在也會(huì)干擾，因此限制了它在實(shí)際樣品中的測(cè)定，而本方法兼具了Cu-Enzyme的高靈敏度，又具備極好的特異性與專一性，使其它常見金屬離子不會(huì)干擾Cu(II)的測(cè)定。另外，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)熒光檢測(cè)具有高效，快速，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。