本發(fā)明涉及一種應(yīng)用濁點(diǎn)萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乳或乳制品中喹諾酮類藥物的方法，屬于食品檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

獸藥是指以治療、預(yù)防或者診斷為目的，或者為改變神經(jīng)功能或行為而用于食品動(dòng)物的化學(xué)物質(zhì)。獸藥的廣泛使用在保障畜牧業(yè)穩(wěn)步發(fā)展、增加畜牧產(chǎn)品供應(yīng)量、減少因動(dòng)物疾病而帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失以及控制人畜共患疾病在動(dòng)物和人類之間傳播等方面發(fā)揮巨大作用。隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)向現(xiàn)代化、集約化和規(guī)模化的發(fā)展，獸藥的使用量必然不斷增加，但是肉、蛋、乳中卻不可避免地出現(xiàn)各種藥物的殘留現(xiàn)象。在食品動(dòng)物在應(yīng)用農(nóng)獸藥后，農(nóng)獸藥的原形及其代謝產(chǎn)物、與農(nóng)獸藥有關(guān)的雜質(zhì)等有可能蓄積或者殘存在動(dòng)物的細(xì)胞、組織或者器官內(nèi)，或者計(jì)入泌乳動(dòng)物的乳、或者產(chǎn)蛋家禽的蛋中，即殘留，又稱殘毒。然而許多使用者卻根本不知曉動(dòng)物性食品中農(nóng)獸藥殘留問(wèn)題，更不清楚如何控制殘留，仍然不正確的應(yīng)用農(nóng)獸藥，如用藥劑量、給藥途徑、用藥部位和用藥動(dòng)物的種類等不符合用藥指示，在休藥期結(jié)束前屠宰動(dòng)物及屠宰前逃避宰前檢查等，這些錯(cuò)誤用藥方式極易引起農(nóng)獸藥的殘留超標(biāo)。由此在生產(chǎn)實(shí)踐中違章殘留事件屢見(jiàn)不鮮，如1987年，美國(guó)加利福尼亞查處了1166例藥物殘留超量事件。同年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部檢查了117628只肉用犢牛，發(fā)現(xiàn)其中有2036只中藥物殘留超標(biāo)。

近年來(lái)，由于農(nóng)獸藥的大量使用引起的食品安全問(wèn)題已被人們廣泛的認(rèn)識(shí)、關(guān)注和重視。為防止動(dòng)物性食品中可能出現(xiàn)的藥物殘留損害人體健康，1984年在食品立法委員會(huì)(CAC)的倡導(dǎo)下由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)起組織了食品中農(nóng)獸藥殘留立法委員會(huì)。CCRVDF的主要宗旨是：控制食品中的農(nóng)獸藥殘留，篩選并建立適用于全球的農(nóng)獸藥及其他化學(xué)物殘留的分析方法和取樣方法，對(duì)農(nóng)獸藥進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)，制定動(dòng)物組織及產(chǎn)品中的獸藥最高殘留限量法規(guī)及休藥期法規(guī)等。目前，一些主要的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口國(guó)和組織均建立有龐雜的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口管理技術(shù)性法律和法規(guī)體系。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品法典委員會(huì)(FAO/WHO/CAC)，制定了300多種食品中170種農(nóng)、獸藥最高殘留限量。從2006年5月29日起，日本實(shí)施了“食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度”，只有符合“肯定列表制度”要求的食品才能進(jìn)入日本市場(chǎng)。該制度對(duì)目前所有農(nóng)業(yè)化學(xué)品在食品中的殘留都作出了具體規(guī)定。其中，對(duì)797種農(nóng)藥、獸藥及飼料添加劑制定了53862個(gè)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)沒(méi)有設(shè)定限量標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)化學(xué)品，將執(zhí)行0.01mg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”，只有65種天然和化學(xué)合成物質(zhì)作為豁免物質(zhì)不設(shè)限量。同樣，加拿大、德國(guó)和東盟其它許多國(guó)家和區(qū)域性國(guó)際組織，也結(jié)合本國(guó)或本地區(qū)的實(shí)際情況制定了各種食品中農(nóng)獸藥最高殘留限量。與此同時(shí)，美國(guó)、歐盟、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)調(diào)整、修改政策法規(guī)和利用先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)置技術(shù)性貿(mào)易壁壘，使得農(nóng)獸藥殘留問(wèn)題不僅是影響人的身體健康，而且也嚴(yán)重影響到國(guó)家的對(duì)外貿(mào)易。

牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，不但可以滿足老年人和兒童的營(yíng)養(yǎng)需求并且能夠增強(qiáng)人們的體質(zhì)?，F(xiàn)在我國(guó)奶牛業(yè)的快速的發(fā)展，居民消費(fèi)水平的不斷的提高，人們對(duì)牛奶的消費(fèi)量也隨之大幅提高，與此同時(shí)人們對(duì)牛奶的安全性也提出了更高的要求。

喹諾酮(Quinolones，QNs)是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)菌DNA螺旋酶具有選擇性抑制的抗菌劑。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，新一代的喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、活性高、無(wú)交叉耐藥性、耐藥突變機(jī)率低、口服吸收好、半衰期長(zhǎng)、價(jià)格便宜、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用非常廣泛。喹諾酮類藥物除了被用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)外，很多地方出現(xiàn)了濫用該類藥物的情況，比如餐飲行業(yè)中的火鍋和麻辣燙，在其中添加喹諾酮類藥物已成為行業(yè)潛規(guī)則，由于此類食品主要以生鮮食材為主，極易造成微生物感染導(dǎo)致腹瀉等中毒情況，大部分商家在火鍋里添加喹諾酮類藥物作為止瀉藥，使得該類藥物在此類食品中殘留的現(xiàn)象普遍存在，己經(jīng)引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。目前，測(cè)定乳與乳制品中β-受體激動(dòng)劑類藥物的方法主要有GC、GC-MS、HPLC和LC-MS/MS法。由于大量使用有機(jī)溶劑，給環(huán)境造成污染，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，需要提供一種操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確高效且前處理過(guò)程不使用有機(jī)溶劑的檢測(cè)乳或乳制品中喹諾酮類藥物的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用濁點(diǎn)萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乳或乳制品中喹諾酮類藥物的方法，本發(fā)明利用濁點(diǎn)萃取技術(shù)的原理，結(jié)合LC-MS/MS對(duì)乳或乳制品(牛奶)中喹諾酮類藥物進(jìn)行提取、富集和分析，建立了濁點(diǎn)萃取(CPE)-LC/MS/MS法分析檢測(cè)牛奶中喹諾酮類藥物的理想方法。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)乳或乳制品中喹諾酮類藥物的方法，包括如下步驟：

(1)將所述乳或乳制品進(jìn)行破乳，經(jīng)離心后取上清液A；

(2)將所述上清液A進(jìn)行濁點(diǎn)萃取，所得富集相經(jīng)離心后取上清液B；

(3)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)所述上清液B，即實(shí)現(xiàn)對(duì)所述乳或乳制品中喹諾酮類藥物的檢測(cè)。

上述的方法中，所述喹諾酮類藥物可為諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹中至少一種。

上述的方法中，所述乳制品指的是以牛羊奶等為主要原料，經(jīng)加工制成的各種食品，如牛奶等。

上述的方法中，步驟(1)中，所述破乳的步驟如下：

向所述乳或乳制品中依次加入無(wú)水硫酸鈉和冰乙酸；

所述無(wú)水硫酸鈉的用量為：10ml所述乳或乳制品：0.8～1.0g所述無(wú)水硫酸鈉；

所述冰乙酸的用量為：10ml所述乳或乳制品：0.1～0.2ml所述冰乙酸。

上述的方法中，步驟(1)中，所述離心的條件如下：

溫度為5～10℃；

轉(zhuǎn)速為8000～10000rpm；

時(shí)間為5～10min。

上述的方法中，步驟(2)中，所述濁點(diǎn)萃取的條件如下：

表面活性劑為Tween 20，其水溶液的質(zhì)量體積濃度為50～100g/L；

平衡溫度為30～60℃；

平衡時(shí)間為20～30min。

上述的方法中，步驟(2)中，所述濁點(diǎn)萃取步驟中還加入添加劑；

所述添加劑為正丁醇和濃氨水，所述正丁醇的用量為：9ml所述上清液A：0.1～0.2ml所述正丁醇，所述濃氨水的用量為：9ml所述上清液A：50～80μL所述濃氨水。

上述的方法中，步驟(3)中，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的色譜條件如下：

流動(dòng)相：A相為乙酸銨-甲酸水溶液，其中，乙酸銨的摩爾濃度為5～10mmol/L，甲酸的體積濃度為0.1％，B相為乙腈；

洗脫梯度：0～1.0min，95％A相；1.0～6.0min，95％～80％A相；6.0～10.0min，80％～60％A相；10.0～15.0min，60％～2％A相；15.0～17.5min，2％，均指的是體積百分含量。

上述的方法中，步驟(3)中，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的色譜條件如下：

柱溫為40℃；

進(jìn)樣體積為5μL；

流速為0.4mL/min。

上述的方法中，步驟(3)中，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件如下：

電噴霧正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式。

上述的方法中，步驟(3)中，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件如下：

離子源溫度為120℃；

毛細(xì)管電壓為3.5kV；

脫溶劑溫度為350℃；

脫溶劑氣流速為16L/min；

碰撞氣為氬氣；

霧化氣壓力為35psi。

本發(fā)明提供的乳或乳制品中喹諾酮類藥物的多殘留檢測(cè)方法，進(jìn)行了萃取溶劑的選擇、凈化方法的研究、反應(yīng)條件的確定、色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立藥物的LC/MS/MS(ESI)數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)定目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢出限，并用回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等參數(shù)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，使各目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)大于0.99；檢出限滿足監(jiān)管需要；方法回收率達(dá)到60％以上，方法重現(xiàn)性RSD在20％以內(nèi)，均符合藥物殘留分析的要求。

本發(fā)明采用濁點(diǎn)萃取方法，通過(guò)喹諾酮類藥物的添加回收率實(shí)驗(yàn)，建立了目標(biāo)化合物的濁點(diǎn)萃取-LC-MS/MS測(cè)定方法。該技術(shù)不僅大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理的步驟，節(jié)約了分析時(shí)間，而且由于有機(jī)溶劑用量少，減少了對(duì)環(huán)境的污染，是一種環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)，并避免了樣品轉(zhuǎn)溶、乳化帶來(lái)的損失。添加回收率試驗(yàn)表明：喹諾酮類藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合農(nóng)獸藥殘留分析要求。

附圖說(shuō)明

圖1為11種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜總離子流圖(TIC圖)。

圖2為牛奶樣品中11種喹諾酮類藥物的MRM色譜圖。

圖3為表面活性劑類型對(duì)六種目標(biāo)物回收率的影響。

圖4為Tween 20濃度對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖5為濃氨水體積對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖6為正丁醇添加量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖7為平衡溫度對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖8為平衡時(shí)間對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖9為超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

一、檢測(cè)方法的建立

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1樣品原料：牛奶為伊利集團(tuán)純牛奶。

1.2獸藥標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、萘啶酸、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、惡喹酸、奧比沙星、氟甲喹均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司(純度>99.0％)。

1.3試劑：PEG 4000、Triton X-100(上海凌峰化學(xué)試劑公司，化學(xué)純)；Tween 20、Tween 40(天津博迪化工股份有限公司，分析純)；Triton X-114(上海滬尚生物科技有限公司，分析純)；乙腈(天津博迪化工股份有限公司，色譜純)；冰乙酸、濃氨水、正丁醇、乙酸銨、硫酸銨、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉均為分析純(天津博迪化工股份有限公司)。

1.4儀器：Agilent 1290UPLC-6490A超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；漩渦混合器VOATEX-2(Scientific Industries)；SB5200型超聲波清洗機(jī)(上海Branson公司)；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi公司)；Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore公司)；氮吹濃縮儀(美國(guó)Organomation Associates公司)。HH-4水浴鍋(江蘇天佑有限公司)；FA2004電子天平(0.0001g，上海天平儀器廠)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別精密稱取11種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，折合成目標(biāo)化合物20mg(精確至0.1mg)置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，混勻，儲(chǔ)備液保存于4℃冰箱中。

分別準(zhǔn)確移取1mL各單標(biāo)儲(chǔ)備液置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成2mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用0.1％甲酸乙腈水(V/V，1:1)稀釋成適用濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2樣品前處理技術(shù)

(1)破乳步驟

用移液管準(zhǔn)確移取10mL牛奶于25mL具塞刻度試管中，加入3mL Tween 20(400g/L)溶液并充分混勻。準(zhǔn)確加入150μL冰乙酸和0.95g無(wú)水Na2SO4，混合均勻。35℃水浴確保無(wú)水硫酸鈉充分溶解，混合溶液用蒸餾水定容至15mL并混勻。將定容后的溶液在10000r/min轉(zhuǎn)速，5℃條件下離心10min。將上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾，得澄清溶液。

(2)濁點(diǎn)萃取步驟

準(zhǔn)確移取上述溶液9mL于25mL具塞刻度試管中，加入60μL濃氨水于試管中，混勻，再加入正丁醇200μL并混勻。于50℃下水浴30min。移出下層水相，用甲醇定容富集相至2mL，并將定容后的富集相在10000r/min下，5℃離心5min，上層液體過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)行檢測(cè)。

2.3色譜條件：色譜柱為Poroshell 120 EC-C18柱(3.0mm×100mm，2.7μm)；柱溫40℃；進(jìn)樣體積5μL。流動(dòng)相A為含5mmol/L乙酸銨的0.1％(體積)甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.4mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫程序

注：曲線0表示保持目前流動(dòng)相比例不變；曲線6表示上一流動(dòng)相比例是漸變至要求的比例；曲線1表示上一流動(dòng)相比例是直接變換至要求的比例。

2.4質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；離子源溫度120℃；毛細(xì)管電壓3.5kV；脫溶劑溫度350℃；脫溶劑氣流速(氮?dú)?：16L/min；碰撞氣：氬氣；霧化氣壓力：35psi；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

3結(jié)果與分析

3.1色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本發(fā)明采用不同比例的甲醇、乙腈、水等混合溶劑體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，甲醇對(duì)各組分的電離效果較差，且喹諾酮類藥物幾乎在同一時(shí)間被洗脫；以不同比例的乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，儀器響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，分離效果較好，但采用該流動(dòng)相體系時(shí)不能使所有的藥物在短時(shí)間內(nèi)被洗脫和分離。

流動(dòng)相的pH值對(duì)喹諾酮類化合物的分離和保留也具有顯著影響，其解離狀態(tài)和在流動(dòng)相中的溶解性隨流動(dòng)相的pH值而變化。為維持流動(dòng)相的低pH值以抑制硅醇基的解離和保證喹諾酮類化合物在流動(dòng)相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，本發(fā)明將流動(dòng)相的pH值控制在2.5～3.0之間，可以保證兩類化合物在流動(dòng)相中的穩(wěn)定性，還不至于使流動(dòng)相酸性太大從而使柱子受損。本發(fā)明考察了采用0.1％甲酸或乙酸來(lái)控制流動(dòng)相的pH值，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者均可使藥物得到對(duì)稱、尖銳的峰形，但甲酸更利于喹諾酮類化合物的離子化，可得到較高的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)在流動(dòng)相的水相中加入揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨，可以在保持較好分離度的前提下獲得的色譜峰峰型更尖銳、分子離子峰的峰強(qiáng)度增大、響應(yīng)更穩(wěn)定。

喹諾酮類藥物因含有羰基等多電子基團(tuán)而適合在ESI源的正離子模式下形成[M+H]母離子。在ESI⁺模式下分別對(duì)1.0mg/L的14種藥物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，通過(guò)母離子全掃描(MS scan)確定化合物的準(zhǔn)分子離子，再作選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)優(yōu)化其碎裂電壓及毛細(xì)管電壓等使[M+H]的響應(yīng)最大，然后對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，獲得碎片離子信息，選擇豐度較高的2～3個(gè)特征碎片離子，優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最大，最后得到該化合物的2～3個(gè)MRM離子對(duì)及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)，最終確定表2所述的質(zhì)譜條件。

表2 11種藥物的MRM參數(shù)

*為定量離子

在優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜條件下，11種喹諾酮類藥物得到很好的分離，峰形對(duì)稱、尖銳，具有良好的質(zhì)譜響應(yīng)(見(jiàn)圖1和圖2)。

3.2破乳條件的優(yōu)化

牛奶基質(zhì)組成復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、脂肪及其他干擾物質(zhì)，易被表面活性劑增溶于疏水性的膠束內(nèi)核中而對(duì)濁點(diǎn)現(xiàn)象及兩相分離產(chǎn)生很大影響，由此可見(jiàn)，牛奶中的雜質(zhì)直接關(guān)系著實(shí)驗(yàn)分析的準(zhǔn)確性和效率，同時(shí)基于對(duì)色譜柱的保護(hù)，需要先將其除去。喹諾酮類藥物在牛奶中的分布主要是在其水溶液和脂肪球內(nèi)，并且藥物的疏水性越大越傾向存在于脂肪顆粒中，因此需要進(jìn)行破乳操作將脂肪球內(nèi)的藥物釋放出來(lái)，否則會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)的提取效率和分析的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明選擇冰乙酸對(duì)牛奶進(jìn)行破乳操作。電解質(zhì)的加入能夠降低蛋白質(zhì)的溶解度，從而對(duì)牛奶破乳有一定的輔助作用，常用的破乳無(wú)機(jī)鹽有硫酸銨、無(wú)水硫酸鈉及氯化鈉。離心對(duì)于沉淀蛋白、去除大部分脂肪是必不可少的步驟，乳脂肪在5℃以下呈固態(tài)，將破乳后的溶液在5℃下冷凍離心，可以去除乳脂肪和蛋白質(zhì)等固體雜質(zhì)。

因此本發(fā)明在0～0.2mL范圍內(nèi)優(yōu)化冰乙酸的用量；選擇硫酸銨、無(wú)水硫酸鈉及氯化鈉輔助破乳，并在0～1.8g范圍內(nèi)進(jìn)行添加量的優(yōu)化，并對(duì)冷凍離心條件加以優(yōu)化，破乳的效果通過(guò)離心后上清液的澄清程度來(lái)判斷。最終確定了最佳破乳條件：冰乙酸用量0.15mL；無(wú)水硫酸鈉用量0.95g；5℃，10000r/min，離心10min。

3.3濁點(diǎn)萃取條件的優(yōu)化

本發(fā)明選用6種喹諾酮類藥物作為代表對(duì)濁點(diǎn)萃取技術(shù)對(duì)牛奶中的喹諾酮類藥物進(jìn)行富集分離，確定表面活性劑種類及用量等條件，優(yōu)化前處理?xiàng)l件。

(1)表面活性劑種類的選擇

圖3為表面活性劑濃度為60g/L，濃氨水體積為20μL，離心后無(wú)水硫酸鈉的用量為0.2g，50℃平衡30min，不同表面活性劑對(duì)六種喹諾酮抗生素回收率的影響。本研究選擇的是對(duì)回收率表現(xiàn)較好的Tween20。

(2)表面活性劑濃度的優(yōu)化

從圖4可以看出，隨著表面活性劑濃度的增加，回收率增長(zhǎng)顯著；在80g/L時(shí)，目標(biāo)物回收率達(dá)到最大值。表面活性劑濃度越高，所得到的富集相粘度越高，這使得在操作過(guò)程中目標(biāo)物更易損失，并且粘度大的組分進(jìn)入液相分析系統(tǒng)會(huì)對(duì)色譜柱造成損害，因此要盡量降低表面活性劑的使用量，本發(fā)明選擇最優(yōu)的表面活性劑濃度為80g/L。

(3)濃氨水體積的優(yōu)化

圖5結(jié)果顯示：隨著濃氨水體積的增大，三種酸性喹諾酮藥物的回收率逐漸下降；氧氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的回收率在濃氨水添加體積為90μL時(shí)最大，隨后逐漸下降，但這時(shí)三種酸性喹諾酮回收率損失較大；當(dāng)濃氨水用量為90μL時(shí)，兩相界面產(chǎn)生較多白色泡沫狀雜質(zhì)，因此選擇60μL為最優(yōu)的濃氨水添加量來(lái)進(jìn)一步完成實(shí)驗(yàn)研究。

(4)正丁醇添加量的優(yōu)化

圖6結(jié)果表明：正丁醇的添加促進(jìn)了分相，并稀釋了富集相，避免了富集相過(guò)于黏稠而在去除水相的過(guò)程中造成損失，當(dāng)添加量在0.2mL時(shí)，回收率最好，因此選擇0.2mL為最佳正丁醇添加量。

(5)溫度的優(yōu)化

濁點(diǎn)溫度是濁點(diǎn)萃取的核心因素，主要取決于表面活性劑的結(jié)構(gòu)和濃度。表面活性劑溶液達(dá)到濁點(diǎn)溫度才能發(fā)生相分離完成萃取與富集，如果平衡溫度低于其濁點(diǎn)溫度，則體系無(wú)法實(shí)現(xiàn)分相。高于濁點(diǎn)溫度的條件下，表面活性劑單體聚集在一起，與水溶液分離。最佳的平衡溫度通常高于表面活性劑濁點(diǎn)溫度15～20℃，但是如果平衡溫度太高，可能會(huì)造成目標(biāo)物的熱分解。因此，為確定最佳平衡溫度，本發(fā)明在30～70℃范圍內(nèi)對(duì)平衡溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖7。其他實(shí)驗(yàn)條件：表面活性劑為Tween 20，濃度80g/L，離心前無(wú)水硫酸鈉質(zhì)量為0.95g，濃氨水添加量為60μL，平衡時(shí)間為30min，平衡溫度對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示：平衡溫度從30℃增加到70℃時(shí)，六種目標(biāo)物的回收率先升高，超過(guò)50℃后回收率開始下降，因此最佳平衡溫度確定為50℃。

(6)時(shí)間的優(yōu)化

濁點(diǎn)萃取是基于表面活性劑水溶液中相分離現(xiàn)象的萃取濃縮技術(shù)。表面活性劑在兩相中的分配與溶質(zhì)的增溶性質(zhì)與萃取效率密切相關(guān)，而平衡時(shí)間是決定分配是否發(fā)生完全的關(guān)鍵因素，因此實(shí)驗(yàn)對(duì)10～50min范圍的平衡時(shí)間進(jìn)行了研究。圖8為表面活性劑為Tween 20，濃度80g/L，無(wú)水硫酸鈉添加量0.25g，濃氨水添加量為60μL，平衡溫度為50℃，平衡時(shí)間對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著平衡時(shí)間從10min延長(zhǎng)到30min，六種喹諾酮類藥物的回收率都有所提高；超過(guò)30min后，回收率略降。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳的平衡時(shí)間為30min。

(7)超聲時(shí)間的優(yōu)化

濁點(diǎn)萃取過(guò)程中一些輔助手段也可以加速兩相的分離、提高萃取率，如離心、超聲、微波和攪拌等。但必須考慮溫度、時(shí)間和功率等對(duì)目標(biāo)物造成的損失。圖9為表面活性劑為Tween 20，濃度80g/L，離心前無(wú)水硫酸鈉質(zhì)量為0.95g，濃氨水添加量為60μL，平衡溫度50℃，平衡時(shí)間30min，超聲頻率為40KHZ，超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，超聲對(duì)萃取效果影響甚微，說(shuō)明增加超聲步驟對(duì)提高喹諾酮類藥物萃取率效果不顯著，反而增加實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性，因此，實(shí)驗(yàn)最終放棄超聲處理。

3.4方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1添加回收率實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的濁點(diǎn)萃取對(duì)牛奶中喹諾酮類藥物進(jìn)行富集分離的條件下(包括破乳方式和濁點(diǎn)萃取方法，確定了冰乙酸的用量為0.15mL及無(wú)水硫酸鈉添加量為0.95g，離心參數(shù)為5℃、10000r/min條件下離心10min的最佳破乳條件；以80g/L Tween 20水溶液為萃取劑，濃氨水的體積為60μL，正丁醇的添加量為0.2mL，平衡溫度和時(shí)間為50℃和30min的濁點(diǎn)萃取條件)，在0.05、0.1、0.2mg/L三個(gè)水平上對(duì)供試牛奶進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：11種喹諾酮類藥物在優(yōu)化條件下的添加回收率在71.3％～96.8％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.24％～6.02％之間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，符合藥物殘留檢測(cè)的要求。

表3 11種喹諾酮類物質(zhì)的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)

3.4.2方法的線性范圍和檢出限

在質(zhì)量濃度為10.0～100.0μg/kg時(shí)，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y為縱坐標(biāo)，工作溶液的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。在10.0～100.0μg/kg范圍內(nèi)，11種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定性檢出限和定量檢出限見(jiàn)表4，由表4中的數(shù)據(jù)可以看出，11種目標(biāo)物線性方程具有良好的線性關(guān)系，且實(shí)驗(yàn)添加濃度高于方法的檢測(cè)限并低于線性方程的濃度上限，能達(dá)到分析的要求。

表4 11種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定性檢出限和定量檢出限

3.4.3基質(zhì)效應(yīng)的消除

本發(fā)明在建立方法過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)很多喹諾酮類藥物均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，消除基質(zhì)效應(yīng)除改進(jìn)樣品凈化手段外，還有使用同位素內(nèi)標(biāo)(理化性質(zhì)與目標(biāo)物幾乎一致)、稀釋樣品溶液(降低基質(zhì)成分濃度)、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(為標(biāo)準(zhǔn)液提供與樣品溶液相似的離子化環(huán)境)等方法。綜合考慮，本發(fā)明采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，很好地消除了基質(zhì)影響，完全能滿足殘留檢測(cè)的要求。

3.5實(shí)際樣品檢測(cè)

在市超市隨機(jī)選取選取四個(gè)品牌的牛奶，應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)其進(jìn)行喹諾酮類抗生素殘留的測(cè)定，結(jié)果均未檢出。