本發(fā)明涉及成分檢測領(lǐng)域，具體涉及一種離子色譜法測定山楂中酒石酸、草酸和檸檬酸含量的方法。

背景技術(shù)：

準(zhǔn)噶爾山楂(學(xué)名：crataegussongorica)是薔薇科山楂屬的植物。分布在俄羅斯、阿富汗、伊朗以及中國大陸的新疆(伊犁、霍城)等地，生長于海拔500米至2,000米的地區(qū)，一般生于河谷以及峽谷灌木叢中，目前尚未由人工引種栽培。果實(shí)為瞢莢果、瘦果、梨果或核果，稀蒴果；種子通常不含胚乳，極稀具少量胚乳；子葉為肉質(zhì)，背部隆起，稀對(duì)褶或呈席卷狀。山楂的干燥成熟果實(shí)，味酸、甘，微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂的功效。到目前為止，從山楂中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)主要有黃酮類、黃烷及其聚合物類、有機(jī)酸類，另外還有三萜類和甾體類等。山楂中所含的有機(jī)酸成分對(duì)調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防腫瘤及改善記憶有明顯的藥理作用。

有機(jī)酸在中草藥的葉、根、特別是果實(shí)中廣泛分布，如烏梅、山楂，覆盆子等。常見的植物中的有機(jī)酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸(即維生素c)等，芳香族有機(jī)酸如苯甲酸、水楊酸、咖啡酸(caffelcacid)等。除少數(shù)以游離狀態(tài)存在外，一般都與鉀、鈉、鈣等結(jié)合成鹽，有些與生物堿類結(jié)合成鹽。脂肪酸多與甘油結(jié)合成酯或與高級(jí)醇結(jié)合成蠟。有的有機(jī)酸是揮發(fā)油與樹脂的組成成分。一般認(rèn)為脂肪族有機(jī)酸無特殊生物活性，但有些有機(jī)酸如酒石酸、枸椽酸作藥用。有報(bào)告認(rèn)為蘋果酸、構(gòu)椽酸、酒石酸、抗壞血酸等綜合作用于中樞神經(jīng)。有些特殊的酸是某些中草藥的有效成分，如土槿皮中的土槿皮酸有抗真菌作用?？Х人岬难苌镉幸欢ǖ纳锘钚?，如綠原酸(chlorogenicacid)為許多中草藥的有效成分。有抗菌、利膽、升高白血球等作用。

總有機(jī)酸的含量測定一般采用：酸堿滴定法、反相高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法。離子色譜法是高效液相色譜法的一種，具有高速、高效、高靈敏、高選擇的特點(diǎn)，可同時(shí)分析多種離子化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種離子色譜法測定山楂中酒石酸、草酸和檸檬酸含量的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

離子色譜法測定山楂中酒石酸、草酸和檸檬酸含量的方法，包括如下步驟：

s1、將山楂去核留果皮與果肉粉碎，過40目篩，稱取山楂粉末試樣0.4000g，加入40mmol/l氫氧化鉀溶液40.0ml，超聲30min，溫度20℃，功率100w；先用布氏漏斗過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，定容至刻度，最后用0.45μm微孔濾膜過濾；

s2、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c16h18o9)＝1000mg/l]，準(zhǔn)確稱取0.1000g綠原酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻；

蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c4h6o5)＝1000mg/l]，準(zhǔn)確稱取0.1000g蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻；

酒石酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c4h6o6)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g經(jīng)酒石酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻；

草酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(h2c2o4)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g草酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻；

檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c6h8o7)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻；

s3、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液配制：分別配制濃度為20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液待用；

s4、取ionpacas-11型高效陰離子分離柱，dionex淋洗液發(fā)生器，koh淋洗液梯度淋洗，0-12minkoh濃度為10mmol/l，15-23minkoh濃度為30mmol/l，淋洗液流速為1.000ml/min，樣品進(jìn)樣環(huán)體積為25.0μl，抑制型電導(dǎo)檢測；

s5、待儀器基線穩(wěn)定后，將步驟s3配好的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液依次進(jìn)行檢測，以各個(gè)單標(biāo)有機(jī)酸的出峰時(shí)間來定性，峰面積定量進(jìn)行線性擬合，重復(fù)次數(shù)11。根據(jù)各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍，采用3s計(jì)算方法測定各陰離子的方法最低檢出限(dl＝3s/k)；

s6、將步驟s1經(jīng)0.45μm濾頭過濾后的山楂樣品，其中一份精密加入酒石酸、草酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過手動(dòng)進(jìn)樣1.0ml測試，計(jì)算有機(jī)酸含量及加標(biāo)回收率。

本發(fā)明具有以下有益效果：

建立離子色譜法同時(shí)檢測準(zhǔn)噶爾山楂中有機(jī)酸的分析方法。以koh溶液為提取劑超聲輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂中的有機(jī)酸，用10mmol/lkoh和30mmol/lkoh梯度淋洗，流速為1.00ml/min準(zhǔn)確測定了準(zhǔn)噶爾山楂中的酒石酸、草酸和檸檬酸等成份。最佳提取條件為提取時(shí)間為30min，koh濃度為40mmol/l提取功率為100w。在測定濃度范圍內(nèi)，酒石酸、草酸和檸檬酸在檢測條件下有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r²＞0.99，檢出限為0.4～2.2mg/l，測得樣品中酒石酸、草酸和檸檬酸含量為8.7mg/g、3.5mg/g、43.2mg/g?；厥章蕿?0.7％～100.3％；本發(fā)明具有分析時(shí)間短、線性范圍寬，靈敏和準(zhǔn)確、簡單快速、試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1-a濃度為10.0mmol/l的淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響。

圖1-b濃度為20.0mmol/l的淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響。

圖1-c濃度為30.0mmol/l的淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響。

圖1-d濃度為40.0mmol/l的淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響。

圖1-e濃度為50.0mmol/l的淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響。

圖2-a流速條件為0.60ml/min時(shí)洗液流速對(duì)分離效果的影響

圖2-b流速條件為0.80ml/min時(shí)洗液流速對(duì)分離效果的影響

圖2-c流速條件為1.00ml/min時(shí)洗液流速對(duì)分離效果的影響

圖2-d流速條件為1.20ml/min時(shí)洗液流速對(duì)分離效果的影響

圖2-e流速條件為1.40ml/min時(shí)洗液流速對(duì)分離效果的影響.

圖3-a梯度洗脫的標(biāo)準(zhǔn)溶液

圖3-b梯度洗脫的樣品

圖4-a為不同濃度氫氧化鉀對(duì)酒石酸和草酸的提取率。

圖4-b為不同濃度氫氧化鉀對(duì)檸檬酸的提取率。

圖5-a不同提取時(shí)間對(duì)酒石酸的提取率。

圖5-b不同提取時(shí)間對(duì)草酸的提取率。

圖5-c不同提取時(shí)間對(duì)檸檬酸的提取率。

圖6-a不同提取功率對(duì)酒石酸的提取率。

圖6-b不同提取功率對(duì)草酸的提取率。

圖6-c不同提取功率對(duì)檸檬酸的提取率。

圖7-a酒石酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7-b草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7-c檸檬酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

以下實(shí)施例的中的材料為：

山楂(新疆伊犁伊寧市霍城縣小西溝)；綠原酸(br，源葉生物)；蘋果酸(ar，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；酒石酸(gr，北京化工廠)；草酸(ar，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司)；檸檬酸(ar，成都市科龍化工試劑廠)；琥珀酸(ar，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)；甲酸(ar，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司)；乙酸(ar，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；氫氧化鉀(ar，天津市科盟化工工貿(mào)有限公司)；超純水

色譜條件

ionpacas-11型高效陰離子分離柱，dionex淋洗液發(fā)生器，koh淋洗液梯度淋洗，0-12minkoh濃度為10mmol/l，15-23minkoh濃度為30mmol/l，淋洗液流速為1.000ml/min，樣品進(jìn)樣環(huán)體積為25.0μl，抑制型電導(dǎo)檢測。山楂樣品經(jīng)0.45μm濾頭過濾后，按儀器優(yōu)化條件通過手動(dòng)進(jìn)樣1.0ml測試。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c16h18o9)＝1000mg/l]，準(zhǔn)確稱取0.1000g綠原酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻。

蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c4h6o5)＝1000mg/l]，準(zhǔn)確稱取0.1000g蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻。

酒石酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c4h6o6)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g經(jīng)酒石酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻。

草酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(h2c2o4)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g草酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻。

檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[ρ(c6h8o7)＝1000mg/l]準(zhǔn)確稱取0.1000g檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，用40mmol/lkoh溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度定容，搖勻。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液配制：分別配制濃度為20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

樣品前處理

將山楂去核留果皮與果肉粉碎，過40目篩，稱取山楂粉末試樣0.4000g，加入40mmol/l氫氧化鉀溶液40.0ml，超聲30min，溫度20℃，功率100w。先用布氏漏斗過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，定容至刻度，最后用0.45μm微孔濾膜過濾。

淋洗液濃度對(duì)分離效果的影響

依次使用10.0mmol/l、20.0mmol/l、30.0mmol/l、40.0mmol/l、50.0mmol/l的koh淋洗液，對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行條件測試；

從圖2-a，圖2-b，圖2-c，圖2-d，圖2-e可以看出，各個(gè)有機(jī)酸在色譜柱中洗脫時(shí)間受淋洗液濃度影響較大，淋洗液濃度越高，分離速度越快；尤其檸檬酸表現(xiàn)比較活躍。在10.0mmol/l淋洗液條件下，各有機(jī)酸色譜峰能很好分離，但檸檬酸未出峰，若在此條件下檢測樣品會(huì)導(dǎo)致檸檬酸無法檢測；在20.0mmol/l淋洗液條件下，蘋果酸和酒石酸分離度較差，兩峰不能完全分離，影響蘋果酸和酒石酸濃度的測定；在30.0mmol/l淋洗液條件下，蘋果酸和酒石酸部分峰重疊，但是草酸與檸檬酸出峰時(shí)間短，且分離度很好；在40.0mmol/l和50.0mmol/l淋洗液條件下，蘋果酸和酒石酸完全重合，無法分離。

淋洗液流速對(duì)分離效果的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法使用同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在淋洗液濃度20mmol/lkoh溶液條件下，通過儀器泵系統(tǒng)設(shè)置淋洗液流速依次0.60ml/min、0.80ml/min、1.00ml/min、1.20ml/min和1.40ml/min條件下進(jìn)行流速對(duì)有機(jī)酸出峰時(shí)間試驗(yàn)。

通過對(duì)不同流速下標(biāo)準(zhǔn)溶液有機(jī)酸的色譜圖進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)淋洗液流速?zèng)Q定著有機(jī)酸出峰時(shí)間，流速越快，檢測時(shí)間越短。在流速為0.60ml/min和0.80ml/min的條件下，檸檬酸未出峰；在流速為1.00ml/min的條件下，檸檬酸出峰時(shí)間在19min左右；在流速為1.20ml/min和1.40ml/min的條件下，分析周期短，但是蘋果酸與酒石酸沒有完全分離。所以等度洗脫無法測定，因此選擇梯度洗脫。根據(jù)以上研究結(jié)果實(shí)驗(yàn)選擇在0-12min用10.0mmol/lkoh淋洗液，15-23min用30.0mmol/lkoh淋洗液條件下，有機(jī)酸能很好分離，且能在25min內(nèi)完成樣品檢測。

由圖3-a，圖3-b可以看出，在梯b度淋洗的條件下綠原酸和蘋果酸與其他物質(zhì)依然無法分開，無法精確測定其含量，故只測定酒石酸、草酸和檸檬酸的含量。

氫氧化鉀濃度對(duì)提取率的影響

稱取0.4000g山楂粉末，分別加入10mmol/l、20mmol/l、30mmol/l、40mmol/l、50mmol/l氫氧化鉀溶液40.0ml，溫度20℃，功率100w，超聲時(shí)間分別為30min條件下提取。

從圖4-a和圖4-b可以看出不同濃度的提取液濃度對(duì)各個(gè)有機(jī)酸提取率的結(jié)果有影響，在koh濃度為40mmol/l的條件下提取率最高。

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取0.4000g山楂粉末，加入40mmol/l氫氧化鉀溶液40.0ml，溫度20℃，功率100w，超聲時(shí)間分別為20min、30min、40min、50min、60min條件下提取。

從圖5-a，圖5-b，圖5-c可以看出不同提取時(shí)間對(duì)各個(gè)有機(jī)酸提取率的結(jié)果有影響，提取時(shí)間為20min時(shí)樣品中酒石酸和草酸的總提取率最低，這可能是由于提取時(shí)間較短。在30min時(shí)達(dá)到最大值，隨后總提取率略有降低，總提取率下降趨勢可能是由于隨著提取時(shí)間的延長，雜質(zhì)的浸出率增大從而導(dǎo)致有機(jī)酸總提取率呈下降趨勢。

提取功率對(duì)提取率的影響

稱取0.4000g山楂粉末，加入40mmol/l氫氧化鉀溶液40.0ml，溫度20℃，超聲時(shí)間為30min，功率分別設(shè)為100w、200w、300w、400w、500w條件下提取。儀器的可調(diào)范圍最低100w。

從圖6-a，圖6-b，圖6-c可以看出不同提取功率對(duì)各個(gè)有機(jī)酸提取率的結(jié)果有影響，當(dāng)功率為100w時(shí)各個(gè)有機(jī)酸的提取率最大。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過對(duì)儀器條件優(yōu)化試驗(yàn)，得出最佳儀器工作條件為：0～12minkoh濃度為10mmol/l，15～23minkoh濃度為30mmol/l，流速1.00ml/min。待儀器基線穩(wěn)定后，將2.2.2以配好的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液依次進(jìn)行檢測。以各個(gè)單標(biāo)有機(jī)酸的出峰時(shí)間來定性，峰面積定量進(jìn)行線性擬合，重復(fù)次數(shù)11。采用3s計(jì)算方法測定各陰離子的方法最低檢出限(dl＝3s/k)，各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限見表1

表1方法線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限(n＝11)

樣品測定及回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取未知含量的山楂粉末，定容至50ml，其中一份精密加入酒石酸、草酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣25μl。

表2回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3山楂樣品分析結(jié)果

計(jì)算結(jié)果表明，酒石酸的回收率為90.7％、草酸的回收率為98.8％、檸檬酸的回收率為100.5％，此方法加樣回收率較高，可用于酒石酸、草酸和檸檬酸的含量測定。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。