本發(fā)明涉及分析檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種同時檢測血清中五種類固醇激素的方法。
背景技術(shù)：
：睪酮是一種類固醇荷爾蒙，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量，但絕經(jīng)后婦女，卵巢分泌睪酮顯著減少。睪酮分子量為288.42g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。大多數(shù)睪酮與性激素結(jié)合球蛋白(shbg)結(jié)合，少數(shù)與白蛋白結(jié)合，一小部分以游離形式存在，所有非shbg結(jié)合的睪酮被認為是生物可利用的。在兒童期，過多睪酮會誘發(fā)男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，過量的睪酮會造成不同程度的男性化，包括多毛，痤瘡，月經(jīng)稀發(fā)，或不育。睪酮輕度至中度升高對男性通常無明顯癥狀，但對女性造成嚴重的影響。對于睪酮輕度至中度升高的確切原因往往不清楚。明顯升高的常見原因包括遺傳疾病(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥)，腎上腺，睪丸和卵巢的腫瘤和運動員濫用睪丸激素或促性腺激素等。女性的睪酮降低會引起微妙的癥狀。這主要包括性欲下降和非特異性的情緒變化。在男性，它會導致性腺功能減退。這個特點將改變男性的第二性征和生育功能。雄烯二酮主要通過腎上腺分泌，其產(chǎn)量一定程度上由促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)調(diào)節(jié)，此外還由睪丸和卵巢通過將脫氫表雄酮硫酸鹽(dhea-s)轉(zhuǎn)化而來。雄烯二酮分子量為286.41g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。雄烯二酮為一種重要的性類固醇激素前提物。它主要通過兩種生物合成途徑生成：來自孕酮或脫氫表雄酮(dhea)等衍生生成。過高的雄烯二酮水平可能會引起女性雄激素過多癥的癥狀。男性通常無癥狀，但是通過外圍的雄性激素轉(zhuǎn)化為雌激素可能偶然使其經(jīng)歷雌激素過多的輕度癥狀，例如男性女性型乳房。大多數(shù)溫和的雄烯二酮水平增高是正常的，但是，顯著的增高可能表明腎上腺和性腺腫瘤。雄烯二酮主要用于評估腎上腺，卵巢或睪丸功能，如激素的產(chǎn)生影響男性生殖器官和生理特征(雄性激素)。結(jié)合實驗室其他檢測項目，最通常用于診斷引起高水平睪酮激素女性過量雄性激素癥狀的原因。11-脫氧皮質(zhì)醇(化合物s)是膽固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇的中間產(chǎn)物，皮質(zhì)醇分子量為346.46g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。11-脫氧皮質(zhì)醇主要用于診斷11-beta-羥化酶缺乏癥和原發(fā)性(腎上腺衰竭)或者繼發(fā)性(腎上腺軸acth缺乏)腎上腺機能不足?？傻乃煞肿恿繛?60.44g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。當患者患有庫欣綜合征時，皮質(zhì)醇和可的松水平同時增高，當服用外源性糖皮質(zhì)激素藥物如強的松時，皮質(zhì)醇和可的松水平會下降。對于顯著的鹽皮質(zhì)激素過?；颊?ame)可的松的形成減少，并使皮質(zhì)醇行使鹽皮質(zhì)激素功能。因此一般顯著的鹽皮質(zhì)激素過?；颊?ame)常伴隨著可的松和醛固酮水平較低，而皮質(zhì)醇水平正常。由于甘草汁可抑制皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為可的松，因此會減少可的松的血液循環(huán)水平。皮質(zhì)醇是由腎上腺產(chǎn)生的一種激素。位于顱底蝶鞍的垂體生成acth(促腎上腺皮質(zhì)激素)，后者刺激腎上腺合成分泌皮質(zhì)醇。皮質(zhì)醇分子量為362.46g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。皮質(zhì)醇在機體中扮演大量角色：皮質(zhì)醇參與蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)分解，維持血壓，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。冷熱、感染、創(chuàng)傷、精神、運動、肥胖和糖尿病可以影響皮質(zhì)醇濃度。皮質(zhì)醇的分泌具有時間周期性，早晨分泌增多，在早晨8點達到高峰；傍晚則降低。這種模式可被稱為：“晝夜變異”或“晝夜節(jié)律”，如果人體工作時間不固定(例如夜班)以及每天睡眠時間不固定時，上述節(jié)律會發(fā)生改變。皮質(zhì)醇不足可引發(fā)非特異性癥狀：體重減輕、肌肉無力、疲勞、血壓過低和腹痛。有時皮質(zhì)醇降低合并壓力有可能導致腎上腺危象，后者需要立即就醫(yī)。皮質(zhì)醇含量過高會導致高血壓、血糖過高、肥胖、皮膚脆弱、腹部紫紋、肌肉無力和骨質(zhì)疏松。目前國內(nèi)普遍采用免疫法分別檢測不同的類固醇激素：如睪酮、4-雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、可的松和氫化可的松等，但是免疫法普遍存在交叉反應(yīng)性強，特異性差，靈敏度低，準確度低等問題，而lc-ms/ms法是目前被廣泛接受的小分子定量檢測的金標準方法，它的優(yōu)勢在于靈敏度高，檢測限低，選擇性好及準確度和特異性高，它能夠區(qū)別結(jié)構(gòu)相似的化合物。但是由于人體內(nèi)這五種激素的濃度范圍寬，部分濃度高，部分濃度低尤其是女性及兒童的睪酮濃度，且這些類固醇激素主要以蛋白結(jié)合的形式存在，且人體血液組成復雜存在大量的高親和力結(jié)合蛋白，因此采樣質(zhì)譜法檢測但仍然需要解決以下問題：1)嚴重的基質(zhì)干擾，特異性差，靈敏度低；2)提高檢測效率，用同一種方法同時檢測這五種類固醇激素；3)不同化合物濃度相差較大或者同一化合物不同人群濃度相差大，要求線性范圍寬。為了降低基質(zhì)干擾，提高特異性、靈敏度等，目前常采用方法有：方法一：離線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀，再經(jīng)過液液萃取或者液固萃取后進行氮吹濃縮得到待測樣本，樣本經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進行檢測；方法二：在線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀后經(jīng)過在線萃取裝置得到待測物，再經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進行檢測。但是這兩種方法存在如下的問題：方法一前處理復雜、處理時間長(一個樣本約2小時)、通量低、試劑成本高、對操作人員要求高；方法二儀器投入大，且在線萃取的耗材成本高。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測血清中五種類固醇激素的方法。具體的技術(shù)方案如下：一種同時檢測血清中五種類固醇激素的方法，包括如下步驟：所述五種類固醇激素分別為：睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松；樣品前處理：在血清樣品中加入含有睪酮內(nèi)標物、雄烯二酮內(nèi)標物、11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標物、皮質(zhì)醇內(nèi)標物和可的松內(nèi)標物的乙腈溶液進行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚進行萃取，震蕩，離心取上清液于氮吹儀中，吹干，加入復溶液，震蕩離心取上清液得待測樣品；富集、分離和檢測：對所述待測樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進行富集、分離和檢測。在其中一些實施例中，所述富集、分離和檢測的步驟包括：先用流動相1洗脫富集柱中的所述待測樣品，對所述待測樣品進行富集、純化；將富集柱與分析柱連通，用流動相2將待測物依次從富集柱洗脫至分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離；斷開富集柱與分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離至四級桿質(zhì)譜進行檢測；其中，富集柱為c6柱，分析柱為c18柱；流動相1：a相為去離子水，b相為甲醇，流速為1.0-2.0ml/min；流動相2：c相為15mm/l醋酸銨水溶液，d相為含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速為0.2-1.0ml/min。在其中一些實施例中，流動相采用梯度洗脫模式：0min時，流動相1中a相與b相的體積比為100:0，流動相2中c相與d相的體積比為90:10，用流動相1洗脫富集柱中的待測樣品，對待測樣品進行富集、純化；0.15min時，將富集柱與分析柱連通，用流動相2將待測物依次從富集柱洗脫至分析柱；3.0min時，流動相2中c相與d相的體積比為55:45；4.0min時，流動相2中c相與d相的體積比為35:65；5.0min時，斷開富集柱與分析柱，用流動相2將待測物從分析柱洗脫、分離至四級桿質(zhì)譜進行檢測，流動相2中c相與d相的體積比為25:75；用流動相1將富集柱中的殘留雜質(zhì)洗脫至廢液瓶中；5.5min時，流動相2中c相與d相的體積比為5:95；8.0min時，流動相2中c相與d相的體積比為90:10；整個梯度時間為8.5～12.0min。在其中一些實施例中，所述流動相1的流速為1.0-1.2ml/min，所述流動相2的流速為0.4-0.6ml/min。在其中一些實施例中，所述睪酮內(nèi)標物為睪酮的c13標記物或氘代標記物，所述雄烯二酮內(nèi)標物為雄烯二酮的c13標記物或氘代標記物，所述11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標物為11-脫氧皮質(zhì)醇的c13標記物或氘代標記物，所述皮質(zhì)醇內(nèi)標物為皮質(zhì)醇的c13標記物或氘代標記物，所述可的松內(nèi)標物為可的松的c13標記物或氘代標記物。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件為：正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm；所述正離子模式中，目標定量離子對包括：睪酮離子對、雄烯二酮離子對、11-脫氧皮質(zhì)醇離子對、皮質(zhì)醇離子對和可的松定量離子對；和/或，睪酮內(nèi)標物的定量離子對、雄烯二酮內(nèi)標物的定量離子對、11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標物的定量離子對、皮質(zhì)醇內(nèi)標物的定量離子對和可的松內(nèi)標物的定量離子對；目標定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm的質(zhì)/荷比條件包括：睪酮的母離子的質(zhì)/荷比為289.0～289.5，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為108.9～109.3，96.8～97.2；雄烯二酮的母離子的質(zhì)/荷比為287.0～287.8，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，108.9～109.3；11-脫氧皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為346.9～347.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，108.9～109.3；皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為362.8～363.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，120.9～121.3；可的松母離子的質(zhì)/荷比為360.9～361.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為162.8～163.2，342.8～343.2；13c3-睪酮母離子的質(zhì)/荷比為289.9～292.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為111.9～112.2；13c3-雄烯二酮母離子的質(zhì)/荷比為290.0～290.5，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為99.8～100.2；d5-11-脫氧皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為351.9～352.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為113.9～114.3；d4-皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為366.8～367.3，對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為120.9～121.3。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件還包括以下離子源參數(shù)：電離源為電噴霧電離esi源，氣簾氣壓力為39～43psi，加熱氣壓力為46～53psi，輔助加熱氣壓力為55～62psi，加熱氣溫度為500～600℃，碰撞氣為氮氣，碰撞氣壓力為5.5～7.0psi，電噴霧針電壓為5000～6000v。在其中一些實施例中，所述四級桿質(zhì)譜條件還包括：睪酮定量離子對的去簇電壓為95～105v，入口電壓為8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為10～14v；雄烯二酮的定量離子對的去簇電壓為95～105v，入口電壓8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為10～14v；11-脫氧皮質(zhì)醇定量離子對的去簇電壓為95～105v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為45～55v，出口電壓為20～30v；皮質(zhì)醇定量離子對的去簇電壓為105～115v，入口電壓6～10v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為8～12v；可的松定量離子對的去簇電壓為125～135v，入口電壓8～15v，碰撞電壓為40～50v，出口電壓為9～15v；睪酮-13c定量離子對的去簇電壓為115～130v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v；雄烯二酮-13c定量離子對的去簇電壓為110～120v，入口電壓8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v；11脫氧皮質(zhì)醇-d5定量離子對的去簇電壓為115～125v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為45～55v，出口電壓為9～15v；皮質(zhì)醇-d4定量離子對的去簇電壓為105～120v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v。在其中一些實施例中，所述血清樣品與所述乙腈溶液的體積比為1：1～4；所述叔丁基甲醚與所述血清樣品的體積比為1：2～8倍；所述叔丁基甲醚與上清液的體積比為1：1～2。在其中一些實施例中，所述樣品前處理中離心的條件為：溫度0～5℃，轉(zhuǎn)速11000～13000r/min，時間4～8min。上述血清中五種類固醇激素的檢測方法具有以下優(yōu)點和有益效果：(1)上述檢測方法采用一種方法同時檢測血清中五種濃度范圍不一致的化合物，同時檢測五種化合物的時間約為8.5～12.0min。其他分別檢測的方法，一個化合物的檢測時間至少7min，即五個化合物至少用時35min。對比于化合物分別檢測的方法，上述檢測方法大大縮短了檢測時間，提高了樣本的檢測通量。(2)上述檢測方法在儀器投入方面比普通的液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀僅增加了一個富集柱和一組泵，就可以大大提高了待測化合物的濃縮純化效率提高檢測靈敏度，并且采用的富集柱簡單、成本低且可重復使用數(shù)千次以上。相對于在線固相萃取，本方法的耗材成本至少降低10倍。即本發(fā)明的檢測方法成本低。(3)上述檢測方法通過對前處理的參數(shù)以及富集、分離和檢測的各參數(shù)(比如富集柱的選擇、流動相的選擇、流速等條件)進行了大量實驗研究進行優(yōu)化，使最后得到的檢測方法可以有效去除基質(zhì)干擾，特異性、抗基質(zhì)干擾能力強。定量限低，靈敏度高，精密度rsd小于10％，可以準確的定性或定量檢測出血清中極低濃度的睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松的含量。即與常用的檢測相比，本發(fā)明的檢測方法檢測靈敏度高、精密度高、特異性強。附圖說明圖1為實施例1人血清樣品中睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松及其內(nèi)標物的tic圖，順序依次為總混合物、皮質(zhì)醇、可的松、11-脫氧皮質(zhì)醇、睪酮、雄烯二酮；圖2為睪酮的標準曲線圖；圖3為雄烯二酮的標準曲線圖；圖4為11-脫氧皮質(zhì)醇的標準曲線圖；圖5為皮質(zhì)醇的標準曲線圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1本實施例的五種類固醇激素的檢測方法，包括以下步驟：一、樣品前處理取200μl樣本(標準曲線點與質(zhì)控同步處理)于2.0離心管中，加入400μl內(nèi)標工作液(13c3-睪酮4mg/l、d4-皮質(zhì)醇4mg/l、d5-11-脫氧皮質(zhì)醇16mg/l)和13c3-雄烯二酮儲備液8mg/l的乙腈溶液)，高速震蕩混勻3min；加入800ul叔丁基甲醚，高速震蕩混勻3min；于4℃，14000r離心10min；取上清液1ml于1.5ml離心管中，40℃氮氣吹干；取100ul復溶液復溶，高速震蕩3min；于4℃，10000r離心5min；轉(zhuǎn)移80μl離心后的樣本于進樣瓶中，上機檢測。二、富集、分離和檢測自動進樣器自動將50ul待測樣品加載到二維液相色譜系統(tǒng)中，對所述待測樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(lc-ms/ms)進行富集、分離與檢測。其中，富集柱為c6-phenyl(4×2.0mm)；分析柱為c18(50×2.0mm,3μm)；柱溫為40℃。該系統(tǒng)配置了兩套泵，兩套泵通過一個六通閥實現(xiàn)切換(也可以通過兩個六通閥或者其它的方式進行切換)，六通閥3號位連接flow1(流動相1)，1號和4號位連接富集柱，5號位連接flow2(流動相2)，6號位連接分析柱，2號位連接廢液瓶。flow1流動相1：a相為去離子水、b相為甲醇，流速為1.0ml/min；flow2流動相2：c相為含15mm/l醋酸銨水溶液、d相為含0.1％甲酸的甲醇溶液，流速0.45ml/min。六通閥的起始模式為0，即富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測樣品經(jīng)進樣器進入富集柱進行富集、純化，此過程中富集柱用flow1流動相進行洗脫；0.15min切換六通閥為1，即富集柱與分析柱連通，將待測樣品洗脫至分析柱，此過程中富集柱與分析柱中的洗脫流動相均為flow2流動相；5.0min六通閥切回起始模式0，斷開富集柱與分析柱，待測物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫(流動相為flow2流動相)至分離后進入質(zhì)譜進行檢測，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫(流動相為flow1流動相)至廢液瓶中。流動相的梯度洗脫如表1所示。表1流動相的洗脫梯度上述梯度下，可的松的保留時間為：5.22min；皮質(zhì)醇的保留時間為：5.38min；11-脫氧皮質(zhì)醇的保留時間為：5.78min；4-雄烯二酮的保留時間為:6.04min；睪酮的保留時間為：6.16min。本實施例lc-ms/ms采用具有電噴霧電離源(esi)的appliedbiochemistryapi4500plus串聯(lián)質(zhì)譜分析儀作為檢測器進行分析。其中，氣簾氣壓力為40.0psi；加熱氣壓力為40psi；輔助加熱氣壓力為60psi；加熱氣溫度為550℃；碰撞氣為高純氮氣，壓力為6psi；電噴霧針電壓為5500v。其它質(zhì)譜條件：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm，其條件參見表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描mrm條件待測物隨流動相流出分析柱后，在壓力的作用下進入質(zhì)譜儀離子源，由六通閥控制進入離子源的樣品通道，和進入切換時間。在離子源內(nèi)液體樣品被汽化并且電離為帶電分子，帶電分子在電壓和真空作用下，進入q1、q2和q3，其中，q1和q3為質(zhì)量過濾器，只允許根據(jù)上述五種類固醇激素及其內(nèi)標物的質(zhì)荷比選擇的母離子和子離子通過，q2為碰撞單元，母離子在此處與惰性氣體原子碰撞，產(chǎn)生特定的碎片離子。質(zhì)譜儀的第一個四極(q1)選擇具有待測物及其內(nèi)標物的特定質(zhì)荷比m/z的母離子，具有這些m/z比的母離子被允許進入q2，q2產(chǎn)生的碎片離子進入到q3，其中待測物及其內(nèi)標物的碎片離子(子離子)被選擇通過，而其它離子被除去。參見表3，示出了被用于鑒別和定量的待測物的離子對的質(zhì)荷比m/z。表3待測物的質(zhì)量轉(zhuǎn)變表隨著離子與檢測器碰撞，它們將捕獲到的離子數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計算機，其將所收集的離子數(shù)對時間作圖，即得總離子流圖(tic圖)(如圖1所示)。三、定性判斷和定量計算(1)依據(jù)待測物、內(nèi)標物的相對保留時間和檢測的定量離子對的豐度比判斷待測物的存在。在相同試驗條件下，檢測樣品中被測目標物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液中對應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間一致；檢測樣品的色譜圖中所選擇的檢測離子對的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子對相對豐度比的偏差(即表4中的最大允許誤差)不超過表4規(guī)定的范圍，則可以判斷樣品中存在對應(yīng)的目標物質(zhì)。表4定性判斷相對豐度的最大允許誤差相對豐度(k)k≥50％20％≤k≤50％10％≤k≤20％k≤10％最大允許誤差±20％±25％±30％±50％(2)采用內(nèi)標標準曲線法定量，以待測物與內(nèi)標物的峰面積比值計算樣品中的待測物的含量。配置系列濃度的含有待測物的血清標準樣品，用本實施例的上述方法進行樣品前處理以及分離檢測，以血清標準樣品中待測物和內(nèi)標物的峰面積的比值構(gòu)建內(nèi)標標準曲線，睪酮的標準曲線見圖2，曲線的方程y＝0.000122x+0.00188，r＝0.9998；雄烯二酮的標準曲線見圖3，曲線的方程為y＝2.98e-005x+0.00267,r＝0.9992；11-脫氧皮質(zhì)醇的標準曲線見圖4，曲線的方程為y＝0.00068x+0.0105,r＝0.9997；皮質(zhì)醇的標準曲線見圖5，曲線的方程為y＝0.000957x+0.00105,r＝0.9997；可的松的標準曲線的方程為y＝0.0428x+0.00172,r＝0.9993然后利用該標準曲線計算待測樣品或質(zhì)量控制物中的待測物的濃度。本實施例測得睪酮的峰面積為3.10e+005，其內(nèi)標物的峰面積為6.10e+006，計算得到本實施例的人血清樣品中睪酮的濃度為403ng/l；雄烯二酮的峰面積為6.65e+005，其內(nèi)標物的峰面積為1.96e+007，計算得到雄烯二酮的濃度為1050ng/l；11-脫氧皮質(zhì)醇的峰面積為5.23e+004，其內(nèi)標物的峰面積為3.27e+005，計算得到11-脫氧皮質(zhì)醇的濃度為220ng/l；皮質(zhì)醇的峰面積為3.44e+005，其內(nèi)標物的峰面積為8.63e+006，計算得到皮質(zhì)醇的濃度為4.06ug/l；可的松的峰面積為3.28e+004，其內(nèi)標物的峰面積為8.63e+006，計算得到可的松的濃度為3.79ug/l。實施例2方法學驗證實驗本實施例對實施例1中的五種類固醇激素的檢測方法進行方法學驗證實驗。1、精密度(precision)實驗1.1批內(nèi)精密度(intra-assay)：取實際血清樣本分別加標至低、中、高三水平，得到的樣本進行批內(nèi)精密度實驗；每個濃度水平的樣本平行處理20個，每個進樣1次；計算檢測結(jié)果的平均值及相對標準偏差(rsd)。1.2批間精密度(inter-assay)：取預(yù)先配制好的低、中、高三水平的質(zhì)控品，進行批間精密度實驗；每個水平的樣本分別做4個平行，即檢測得4組數(shù)據(jù)，連續(xù)測定5天；計算檢測結(jié)果的平均值及相對標準偏差(rsd)。睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇、可的松的批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)分別如表5～9所示，經(jīng)驗證，批內(nèi)精密度范圍為1.31％～5.89％，批間精密度范圍為1.67％～6.31％。表5睪酮批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表6雄烯二酮批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表711-脫氧皮質(zhì)醇批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表8皮質(zhì)醇批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)(單位：ug/l)表9可的松批內(nèi)精密度及批間精密度實驗數(shù)據(jù)(單位：ug/l)2、分析靈敏度和線性范圍(analyticalsensitivityandanalyticalm--easurementrangeandlinearitystudy)2.1方法定量限與線性范圍(limitofquantitationandlinearity)a.配制空白基質(zhì)；b.配置標準曲線；c.每個濃度的樣本平行處理6個，分別檢測一次；d.計算各濃度樣本的平均值、rsd和回收率；e.方法定量限的確定標準：rsd小于20％且回收率在85％-115％范圍內(nèi)的最低濃度點視為定量限濃度，即loq；f.線性范圍的確定標準：rsd小于20％，回收率在85％-115％范圍內(nèi)，且以理論濃度比率與實際信號響應(yīng)峰面積比率繪制成的回歸曲線r2>0.98，即滿足線性范圍的要求；g.驗證實驗數(shù)據(jù)如表10～14與圖2-圖5所示，睪酮的loq為2.75ng/l，線性范圍為2.75-10000ng/l；雄烯二酮的loq為9.7ng/l，線性范圍為9.7-25000ng/l；11-脫氧皮質(zhì)醇的loq為2.75ng/l，線性范圍為2.75-10000ng/l；皮質(zhì)醇的loq為0.0275ug/l，線性范圍為0.0275-100ug/l；可的松的loq為0.046ug/l，線性范圍為0.046-191ug/l。表10睪酮定量限實驗數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測平均值(ng/l)rsd回收率00——1.23752.0325％164.04％2.752.723.59％99.03％5.55.424.07％98.52％1110.924.27％99.24％2221.373.01％97.12％44.142.402.62％96.15％88.184.604.63％96.03％156154.502.04％99.04％313313.832.36％100.27％625632.331.29％101.17％12501238.331.19％99.07％25002506.671.74％100.27％50005030.001.56％100.60％100009960.001.91％99.60％表11雄烯二酮定量限實驗數(shù)據(jù)表1211-脫氧皮質(zhì)醇定量限實驗數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測平均值(ng/l)rsd回收率00——1.3751.71920.06％125.1％2.752.775.77％100.67％5.55.353.45％97.21％1111.055.45％100.45％2221.035.10％95.61％44.141.177.09％93.35％88.184.873.66％96.33％156159.003.98％101.92％313325.333.89％103.94％625641.333.24％102.61％12501278.332.64％102.27％25002531.671.53％101.27％50005051.671.13％101.03％100009870.002.42％98.70％表13皮質(zhì)醇定量限實驗數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測平均值(ng/l)rsd回收率00——0.013750.0144525.03％105.11％0.02750.036.26％104.12％0.0550.067.96％101.61％0.110.114.05％103.03％0.220.212.94％95.68％0.4410.424.41％94.63％0.8810.842.72％95.89％1.561.591.68％101.71％3.133.231.30％103.09％6.256.481.68％103.60％12.512.781.67％102.27％2525.081.52％100.33％5050.281.51％100.57％10099.072.47％99.07％表14可的松定量限實驗數(shù)據(jù)2.2方法檢出限(limitofdetection)a.收集濃度均在定量限loq附近的病人血清樣本；b.平行處理此病人樣本20個，分別檢測1次；c.計算各濃度樣本的平均值、sd和方法檢出限(lod)；d.實驗結(jié)果如表15所示，睪酮的lod為1.595ng/l，雄烯二酮的lod為2.45ng/l，11-脫氧皮質(zhì)醇的lod為1.90ng/l，皮質(zhì)醇的lod為0.012ug/l，可的松的lod為0.0238ug/l。表15方法檢出限試驗數(shù)據(jù)2.3結(jié)論(summaryoftheamrstudy)表16分析靈敏度與線性范圍結(jié)果匯總3.方法準確度-回收率(recovery)a.收集一批混合血清樣本，測得基礎(chǔ)濃度，分別加標至高、中、低三水平的樣本，進行加標回收率實驗；b.未加標及加標樣品，每個平行處理3個，分別進行檢測，計算加標樣品的回收率結(jié)果，回收率在85-115％范圍內(nèi)，認為方法準確；c.回收率實驗結(jié)果如表17～21所示。由結(jié)果可知，方法的回收率在95.42～105％之間，滿足要求。表17睪酮加標回收率試驗結(jié)果表18雄烯二酮加標回收率試驗結(jié)果表1911-脫氧皮質(zhì)醇加標回收率試驗結(jié)果表20皮質(zhì)醇加標回收率試驗結(jié)果表21可的松加標回收率試驗結(jié)果由上述的檢測結(jié)果顯示本發(fā)明的五種類固醇激素的檢測方法檢測血清樣品或者質(zhì)控物質(zhì)結(jié)果準確，睪酮的定量限為2.75ng/l，檢測限為1.6ng/l，精密度rsd<5％，加標回收率在90％-110％之間；雄烯二酮的定量限為9.7ng/l，檢測限為2.45ng/l，精密度rsd<5％，加標回收率在90％-115％之間；11-脫氧皮質(zhì)醇的定量限為2.75ng/l，檢測限為1.90ng/l，精密度rsd<5％，加標回收率在87％-110％之間；皮質(zhì)醇的定量限為0.0275ug/l，檢測限為0.0120ug/l，精密度rsd<5％，加標回收率在85％-115％之間；可的松的定量限為0.046ug/l，檢測限為0.0238ug/l，精密度rsd<5％，加標回收率在90％-110％之間，檢測時間時間約11.0min，檢測效率高。說明本方法準確可靠，精密度高、靈敏度高、檢測通量高、成本低。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12