本發(fā)明涉及一種食品中過敏原的檢測(cè)方法，尤其涉及一種巧克力中過敏原的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

食品過敏原是指食品中存在的能夠選擇性地激活人體細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答，引起變態(tài)反應(yīng)的抗原性物質(zhì)。一般來說，食品過敏原為分子量介于10000～70000之間的蛋白或糖蛋白。常見的致敏食品有奶類、豆類、蛋類、谷類、樹果類、貝類等。在世界衛(wèi)生組織報(bào)告指出威脅人類健康的因素中，食物過敏排在第4位。在近年來國(guó)內(nèi)外食品有關(guān)的警示通報(bào)中，過敏原問題數(shù)量排名第2，僅次于微生物污染，成為國(guó)際普遍關(guān)注的行業(yè)熱點(diǎn)。食品過敏原問題在不同國(guó)家和地區(qū)有著各不相同的理解和關(guān)注程度。國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)食品過敏原已經(jīng)有著諸多的報(bào)道和研究，甚至有較具體的立法。如歐盟2003/89/ec指令對(duì)食品生產(chǎn)和經(jīng)銷者進(jìn)行監(jiān)管，歐盟2006/142/ec指令則列出了14種必須明確標(biāo)注的食品過敏原。美國(guó)《2004年食物致敏原標(biāo)簽和消費(fèi)者保護(hù)法》將牛奶、雞蛋、魚類、甲殼貝類動(dòng)物、堅(jiān)果、小麥、花生和大豆列為需要強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)的主要致敏原。

與發(fā)達(dá)國(guó)家相比,我國(guó)對(duì)食品過敏原的研究和關(guān)注水平存在較大差距，食品過敏原問題也是目前我國(guó)食品出口企業(yè)被外方通報(bào)的最主要問題。目前，我國(guó)食品中過敏原標(biāo)識(shí)的管理還處于起步階段，最早與食品中過敏原標(biāo)識(shí)相關(guān)的管理標(biāo)準(zhǔn)為2008年北京奧運(yùn)會(huì)期間頒布的《奧運(yùn)會(huì)食品安全食品過敏原標(biāo)識(shí)標(biāo)注》，并于奧運(yùn)會(huì)結(jié)束后廢止。2009年，我國(guó)為加強(qiáng)食品中過敏原的管理，頒布了推薦性的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb，t23779-2009《預(yù)包裝食品中的過敏原成分》，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)過敏原進(jìn)行了定義，并列舉了8類推薦性標(biāo)識(shí)的食物過敏原障。2012年，gb7718-2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》的頒布首次正式將食品中過敏原的標(biāo)識(shí)問題納入標(biāo)簽管理的范疇，但對(duì)于過敏原的標(biāo)識(shí)方式仍未給出具體的規(guī)定，消費(fèi)者對(duì)由此引發(fā)的過敏反應(yīng)也沒有引起足夠的關(guān)注。隨著國(guó)家對(duì)食品安全工作的深入開展以及促進(jìn)進(jìn)出口食品貿(mào)易的發(fā)展，完善食品過敏原的標(biāo)識(shí)管理的重要性日益凸顯。

食品過敏原的標(biāo)識(shí)管理，只有在具備了完善的監(jiān)控技術(shù)手段后才可能真正實(shí)施。目前廣泛使用的食品過敏原分析方法主要有酶聯(lián)免疫法(elisa)、聚合酶鏈法(pcr)和質(zhì)譜法(ms)。elisa方法一次只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)物，效率較低；pcr方法雖可多目標(biāo)物同步檢測(cè)，但易出現(xiàn)假陽性，難以適應(yīng)當(dāng)今各種復(fù)雜食品的檢測(cè)。質(zhì)譜(ms)由于可以給出化合物的分子結(jié)構(gòu)信息，在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用越來越普及，已成為目前檢測(cè)領(lǐng)域國(guó)際通用的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前關(guān)于蛋白質(zhì)譜檢測(cè)已有較多研究，通過采用基于高效液相色譜(hplc)、毛細(xì)管電泳(ce)等分離手段和基質(zhì)輔助激光解析(maldi)、電噴霧(esi)等不同類型的離子化技術(shù)進(jìn)行蛋白檢測(cè)。檢測(cè)方法主要分為兩類：一是利用高分辨率質(zhì)譜和解卷積等數(shù)據(jù)處理技術(shù)在蛋白水平進(jìn)行研究，由于蛋白質(zhì)譜行為的不規(guī)律性，該研究在定量方面存在較大難度；二是將蛋白酶解為肽段后進(jìn)行定性和定量研究，在肽水平實(shí)現(xiàn)蛋白的定性和定量。第二種檢測(cè)方法通過色譜和質(zhì)譜技術(shù)的融合，目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)一次分析中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)同類型的過敏原，在食品過敏原蛋白研究領(lǐng)域日漸受到重視，是當(dāng)前過敏原蛋白檢測(cè)的主流技術(shù)。

然而，除了檢測(cè)方法之外，還需要考慮預(yù)處理程序中關(guān)鍵的目標(biāo)分析物純化步驟，特別是在分析復(fù)雜食品時(shí)。食物基質(zhì)可以對(duì)過敏性食物殘留物的純化和測(cè)定具有相當(dāng)大的影響，因?yàn)榛|(zhì)組分易于與靶蛋白形成共價(jià)鍵，離子型和氫鍵或疏水相互作用。巧克力是最具挑戰(zhàn)性的食品基質(zhì)之一。巧克力含有大量的糖，單寧，特別是能與食物蛋白質(zhì)反應(yīng)的多酚化合物，從而掩蓋了目前被研究的蛋白質(zhì)。在一些關(guān)于巧克力中過敏原檢測(cè)的研究中，使用固相萃取(spe)和/或超濾的蛋白質(zhì)純化，需要長(zhǎng)達(dá)60分鐘甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這大大降低了分析量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，能夠?qū)η煽肆|(zhì)中的過敏原蛋白質(zhì)進(jìn)行快速純化，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度，高通量的巧克力中多種過敏原的快速篩選檢測(cè)。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采用的技術(shù)方案是提供一種巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，包括如下步驟：s1)先對(duì)巧克力基質(zhì)中的糖類和酚類進(jìn)行吸附，達(dá)到巧克力中過敏蛋白質(zhì)的快速純化；s2)建立多種過敏原同時(shí)檢測(cè)的色譜質(zhì)譜方法；s3)建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，收集不同來源樣品的定性定量數(shù)據(jù)，并獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s1)在巧克力磁性顆粒外鍵合一種苯硼酸基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)巧克力基質(zhì)中糖類和酚類物質(zhì)的吸附。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s2)結(jié)合靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)，建立多種過敏原同時(shí)檢測(cè)的色譜質(zhì)譜方法。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述多種過敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和開心果。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s2)考察色譜柱參數(shù)對(duì)色譜分離的影響，優(yōu)化流動(dòng)相流速、梯度、時(shí)間參數(shù)對(duì)分離效率的影響，選擇合適的柱溫和試液溫度，并針對(duì)每種特征肽考察其色譜保留時(shí)間的重現(xiàn)性。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述色譜柱參數(shù)包括類型、柱長(zhǎng)和內(nèi)徑。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s2)對(duì)噴針位置、毛細(xì)管電壓，錐孔電壓，各路氣體流量和溫度以及碰撞能參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并采用全掃描方式觀測(cè)蛋白酶解產(chǎn)物產(chǎn)生多電荷離子的排布與質(zhì)量數(shù)范圍。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s3)從uniport過敏原數(shù)據(jù)庫中下載過敏原蛋白的氨基酸序列，形成自己的食品過敏原數(shù)據(jù)庫；對(duì)酶解產(chǎn)生的多肽混合物進(jìn)行掃描，將肽質(zhì)量指紋圖譜法和肽段碎片離子鑒定法相結(jié)合進(jìn)行蛋白質(zhì)的確證。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s3)根據(jù)特征肽的選擇原則，確定每種過敏原蛋白的特征肽，針對(duì)每個(gè)蛋白選擇1-2個(gè)特征肽，建立多肽混合物的mrm方法；然后采用基質(zhì)加標(biāo)方法，考察方法的線性范圍、靈敏度、重現(xiàn)性、回收率等指標(biāo)；對(duì)于含油酯較高的食品基質(zhì)，采用正己烷去除，降低其對(duì)分析結(jié)果的影響。

上述的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，其中，所述步驟s3)還包括收集各種不同品牌的巧克力，采用優(yōu)化后的前處理和色譜質(zhì)譜方法，進(jìn)行致敏蛋白的定性鑒定和快速篩查工作。

本發(fā)明對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)有如下的有益效果：本發(fā)明提供的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，能夠?qū)η煽肆|(zhì)中的過敏原蛋白質(zhì)進(jìn)行快速純化，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度，高通量的巧克力中多種過敏原的快速篩選檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的巧克力中過敏原的檢測(cè)流程示意圖；

圖2為本發(fā)明蛋白質(zhì)純化前后mrm離子對(duì)hplc-msms響應(yīng)信號(hào)對(duì)比示意圖；

圖3為本發(fā)明過敏原蛋白特征肽段在mrm模式下的提取離子流色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

圖1為本發(fā)明的巧克力中過敏原的檢測(cè)流程示意圖。

請(qǐng)參見圖1，本發(fā)明提供的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1)先對(duì)巧克力基質(zhì)中的糖類和酚類進(jìn)行吸附，達(dá)到巧克力中過敏蛋白質(zhì)的快速純化；

s2)建立多種過敏原同時(shí)檢測(cè)的色譜質(zhì)譜方法；

s3)建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，收集不同來源樣品的定性定量數(shù)據(jù)，并獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

本發(fā)明針對(duì)目前巧克力食品基質(zhì)中，過敏原蛋白質(zhì)純化耗時(shí)長(zhǎng)的問題，提供一種新型高效的蛋白質(zhì)純化方法，所述步驟s1)在磁性顆粒外鍵合一種特殊苯硼酸基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)巧克力基質(zhì)中糖類和酚類物質(zhì)的吸附，達(dá)到快速純化的目的。所述s2)結(jié)合靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(q/orbitrap)和串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(qqq)系統(tǒng)，建立了巧克力中多種蛋白類過敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和開心果的定性鑒定和精確定量研究。

下面對(duì)各步驟做進(jìn)一步的展開：

s1)過敏原蛋白的純化?？疾毂脚鹚峄鶊F(tuán)固相萃取材料用量與純化效果的相關(guān)關(guān)系；考察不同的洗脫溶液對(duì)蛋白質(zhì)純化和回收率的影響,得到優(yōu)化的蛋白質(zhì)提取和純化條件。

s2)建立多種過敏原同時(shí)檢測(cè)的色譜質(zhì)譜方法

(1)優(yōu)化hplc條件?？疾焐V柱參數(shù)包括類型、柱長(zhǎng)、內(nèi)徑等對(duì)色譜分離的影響；優(yōu)化流動(dòng)相流速、梯度、時(shí)間等參數(shù)對(duì)分離效率的影響；選擇合適的柱溫和試液溫度；針對(duì)每種特征肽考察其色譜保留時(shí)間的重現(xiàn)性。

(2)優(yōu)化esi-q/orbitrap和esi-qqq條件。優(yōu)化噴針位置、毛細(xì)管電壓，錐孔電壓，各路氣體流量和溫度以及碰撞能參數(shù)；采用全掃描方式觀測(cè)蛋白酶解產(chǎn)物產(chǎn)生多電荷離子的排布與質(zhì)量數(shù)范圍。

s3)建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)定性確證和精準(zhǔn)定量方法

(1)從uniport過敏原數(shù)據(jù)庫中下載過敏原蛋白的氨基酸序列，形成自己的食品過敏原數(shù)據(jù)庫。對(duì)酶解產(chǎn)生的多肽混合物進(jìn)行掃描，利用pfind搜索軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的確證。將肽質(zhì)量指紋圖譜法(peptidemassfingerprint,pmf)和肽段碎片離子鑒定法(peptidefragmentsidentification,pfi)相結(jié)合，提高蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確度。

(2)利用skyline軟件結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)特征肽的選擇原則，確定每種過敏原蛋白的特征肽，針對(duì)每個(gè)蛋白選擇1-2個(gè)特征肽，建立多肽混合物的mrm方法。采用基質(zhì)加標(biāo)方法，考察方法的線性范圍、靈敏度、重現(xiàn)性、回收率等指標(biāo)。對(duì)于含油酯較高的食品基質(zhì)，擬采用正己烷去除，降低其對(duì)分析結(jié)果的影響。

(3)收集各種不同品牌的巧克力，采用優(yōu)化后的前處理和色譜質(zhì)譜方法，進(jìn)行致敏蛋白的定性鑒定和快速篩查工作。并收集不同來源樣品的定性定量數(shù)據(jù)，獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

本發(fā)明提供的巧克力中過敏原的檢測(cè)方法，能夠?qū)η煽肆|(zhì)中的過敏原蛋白質(zhì)進(jìn)行快速純化，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度，高通量的巧克力中多種過敏原的快速篩選檢測(cè)。具體優(yōu)點(diǎn)如下：1)巧克力食品中蛋白質(zhì)純化時(shí)間由目前文獻(xiàn)報(bào)道的1個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)，縮短至5分鐘。2)純化后質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)有所提高，信噪比提高了約10倍，如圖2所示，蛋白質(zhì)純化前(圖2a)和純化后(圖2b)mrm離子對(duì)m/z452.22+→701.4+的hplc-msms響應(yīng)信號(hào)對(duì)比圖。mrm色譜圖顯示去除了其它雜質(zhì)的干擾，如圖3所示。3)回收率在60.1-92.4％，比部分文獻(xiàn)報(bào)道的50％左右有了很大的提高。

下面給出一個(gè)具體實(shí)施例。

1、將巧克力樣品經(jīng)均質(zhì)機(jī)打碎并混合均勻，稱取1g均勻樣品，用20ml40mmtris-hcl緩沖液提取，在60℃提取3h。將提取物以4000rpm離心10分鐘，并將上清液通過0.45μm乙酸纖維素膜過濾。將上述提取液稀釋1000倍，

2、取1ml稀釋后的提取液于1.5ml離心管中，加入0.1g鍵合了苯硼酸基的磁性顆粒，混合2min。

3、利用磁性吸附作用，聚集吸附了巧克力中糖和多酚物質(zhì)的磁性顆粒，將純化后的蛋白質(zhì)溶液移入另一1.5ml離心管中。

4、300μl乙酸銨水溶液(ph＝6.5)加入含有磁性顆粒的離心管中，進(jìn)一步洗脫顆粒上可能吸附的蛋白類物質(zhì)。

5、合并洗脫液，進(jìn)行下一步的酶解。

6、酶解后的樣品在hplc-q/orbitrap上以數(shù)據(jù)依賴采集(data-dependentacquisition，dda)方式獲得的全掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行蛋白質(zhì)定性確證。

7、酶解后的樣品在hplc-qqq上以mrm方式進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。

考慮到巧克力基質(zhì)的復(fù)雜性，本發(fā)明引入快速固相萃取步驟進(jìn)行樣品凈化，并證明其在巧克力樣品中的應(yīng)用用于多變應(yīng)原測(cè)定。在所研究的巧克力基質(zhì)的靈敏度，線性，重復(fù)性和回收率方面進(jìn)行了該方法的驗(yàn)證。然后將該方法用于市售巧克力中的八種變應(yīng)原成分(牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和開心果)的分析。目的是形成自主研發(fā)的快速、高通量的食品過敏原篩查系統(tǒng)和方法技術(shù)體系,推動(dòng)我國(guó)食品過敏原標(biāo)識(shí)管理的完善發(fā)展。預(yù)期研究結(jié)果可轉(zhuǎn)化為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用于進(jìn)出口食品的過敏原監(jiān)測(cè)，對(duì)于確保我國(guó)食品安全，破除國(guó)際食品技術(shù)貿(mào)易壁壘具有重要意義。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的修改和完善，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。