本發(fā)明屬于藥物制劑檢測領(lǐng)域，具體涉及一種益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法。
背景技術(shù)：
：參鹿補片是由紅參、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱蓮、玉竹、女貞子(酒制)、熟地黃、鎖陽、續(xù)斷、白術(shù)(炒)、仙鶴草、黨參、雞血藤組成的中藥制劑，具有益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的功效，用于腎陽虛衰、氣血不足、畏寒肢冷、精神疲乏、腰膝酸軟和頭暈耳鳴的治療。參鹿補片為部頒標準所收載，但該標準中僅僅包括齊墩果酸的薄層色譜鑒別方法，不僅檢測的指標較為單一，而且不能檢測該中藥制劑中所含其他藥材的質(zhì)量，不利于從整體上對該中藥制劑的質(zhì)量進行有效控制。因此，建立一種快速、全面、針對性強的參鹿補片的質(zhì)量檢測及質(zhì)量控制的方法具有重要的意義?！八崴?衍生化-tlc法鑒別利康顆粒中的紅參”(《中醫(yī)藥信息》，2013，30(3)，59-61)公開了用甲醇回流法通過tlc鑒別利康顆粒中的紅參的方法，具體如下：取利康顆粒，研細，精密稱取30g，置500ml圓底燒瓶中，加甲醇200ml，置85℃水浴中回流lh，放冷，濾過取濾液250ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加熱水50ml使溶解，轉(zhuǎn)移至250ml分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次(50ml，50ml，50ml)，合并正丁醇液，用氨試液洗2次(50ml，50ml)，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲2ml使溶解，作為供試品溶液。吸取上述供試品溶液20μl，對照品溶液2μl，分別點于同一硅膠g板上，以氯仿一甲醇一水(13：7：2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。以上述方法對參鹿補片中藥材紅參中的人參皂苷rg1進行鑒別時，盡管供試品色譜中的色帶較深，但是在與對照品色譜相應位置上的斑點比較淡。因此，上述方法并不適用于參鹿補片中人參皂苷rg1。因此，建立一種參鹿補片中人參皂苷rg1的tlc鑒別方法，對于參鹿補片的質(zhì)量進行全面控制具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有的參鹿補片的檢測方法檢測的指標較為單一，不能檢測其中的人參皂苷rg1的含量，不利于從整體上對該中藥制劑的質(zhì)量進行有效控制，從而提出一種快速、全面、針對性強的參鹿補片的質(zhì)量檢測及質(zhì)量控制的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：本發(fā)明提供一種益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，該藥物制劑的原料藥組成為：紅參、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱蓮、玉竹、女貞子、熟地黃、鎖陽、續(xù)斷、白術(shù)、仙鶴草、黨參、雞血藤；該檢測方法包括如下對人參皂苷rg1的鑒別方法：取待測藥物制劑，研細，加甲醇30～50ml，水浴回流0.5～2小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20～40ml使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取1～3次，每次20～40ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水40～60ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷rg1對照品，加甲醇制成每1ml中含0.5～2mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％～15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述對人參皂苷rg1的鑒別方法如下：取待測藥物制劑，研細，加甲醇40ml，水浴回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30ml使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水50ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷rg1對照品，加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，還包括如下對淫羊藿苷的含量測定方法：取待測藥物制劑，精密稱定，研細，取1～3g，精密稱定，置40～60ml容量瓶中，加入稀乙醇30～50ml，超聲處理0.5～2小時，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1ml中含5～15μg的溶液，即得對照品溶液；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為25～35：65～75乙腈-水溶液為流動相，檢測波長為260～280nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于2000；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～15μl，注入液相色譜儀，測定，即得。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述對淫羊藿苷的含量測定方法具體如下：取待測藥物制劑，精密稱定，研細，取2g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加入稀乙醇40ml，超聲處理1小時，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1ml中含10μg的溶液，即得對照品溶液；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為29:71乙腈-水溶液為流動相，檢測波長為270nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于2000；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述超聲處理的條件為：功率350w，頻率35khz。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，還包括如下對齊墩果酸的鑒別方法：取待測藥物制劑，研細，加1～5％的氫氧化鈉溶液20～40ml，超聲處理20～60分鐘，離心，上清液用鹽酸調(diào)ph1-4，用乙醚振搖提取1～3次，每次20～40ml，合并乙醚提取液,蒸干，殘渣加甲醇0.5～2ml使溶解，作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1ml含0.5～1.5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％～15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述對齊墩果酸的鑒別方法具體如下：取待測藥物制劑，研細，加2％的氫氧化鈉溶液30ml，超聲處理30分鐘，離心，上清液用鹽酸調(diào)ph2-3，用乙醚振搖提取2次，每次30ml，合并乙醚提取液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述離心的條件為：以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的原料藥組成為：紅參18～22重量份、鹿肉27～33重量份、淫羊藿67.5～82.5重量份、狗脊67.5～82.5重量份、墨旱蓮90～110重量份、玉竹22.5～27.5重量份、女貞子136～166重量份、熟地黃90～110重量份、鎖陽46～56重量份、續(xù)斷45～55重量份、白術(shù)67.5～82.5重量份、仙鶴草90～110重量份、黨參45～55重量份、雞血藤180～221重量份。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的原料藥組成為：紅參20重量份、鹿肉30重量份、淫羊藿75重量份、狗脊75重量份、墨旱蓮100重量份、玉竹30重量份、女貞子151重量份、熟地黃100重量份、鎖陽51重量份、續(xù)斷50重量份、白術(shù)75重量份、仙鶴草100重量份、黨參50重量份、雞血藤201重量份。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述女貞子為酒制女貞子，所述白術(shù)為炒白術(shù)。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的制備方法為：以上十四味，取紅參、鹿肉7.2～8.8重量份、淫羊藿7.2～8.8重量份、狗脊7.2～8.8重量份、墨旱蓮9.9～12.1重量份、玉竹2.7～3.3重量份、女貞子15.3～18.7重量份、熟地黃1.8～2.2重量份、鎖陽5.4～6.6重量份、續(xù)斷0.9～1.1重量份、白術(shù)7.2～8.8重量份、仙鶴草9.9～12.1重量份、黨參0.9～1.1重量份、雞血藤19.8～24.2重量份、粉碎成細粉，過篩混勻；剩余鹿肉加水煎煮2～6小時，濾過；藥渣與剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次2～6小時，濾過，濾液與鹿肉合并，濃縮至80℃下相對密度為1.25～1.40的稠膏，加入上述細粉，混勻，加入常規(guī)輔料、按照常規(guī)工藝制成臨床可接受的劑型。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，所述益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的制備方法為：以上十四味，取紅參、鹿肉8重量份、淫羊藿8重量份、狗脊8重量份、墨旱蓮11重量份、玉竹3重量份、女貞子17重量份、熟地黃2重量份、鎖陽6重量份、續(xù)斷1重量份、白術(shù)8重量份、仙鶴草11重量份、黨參1重量份、雞血藤22重量份、粉碎成細粉，過篩混勻；剩余鹿肉加水煎煮4小時，濾過；藥渣與剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次4小時，濾過，濾液與鹿肉合并，濃縮至80℃下相對密度為1.32的稠膏，加入上述細粉，混勻，加入常規(guī)輔料、按照常規(guī)工藝制成臨床可接受的劑型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：本發(fā)明的益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的藥物制劑的檢測方法，通過tlc法鑒別該中藥制劑中的人參皂苷rg1，解決了現(xiàn)有的紅參的tlc鑒別法不適用于鑒別參鹿補片中藥材紅參中的人參皂苷rg1的問題，該檢測方法快速、全面、針對性強，進一步聯(lián)合淫羊藿苷的含量測定方法和現(xiàn)有的齊墩果酸的tlc鑒別方法，有利于對該中藥制劑的質(zhì)量進行全面有效控制，有助于提高該藥材使用的安全性和穩(wěn)定性。附圖說明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中：圖1是本發(fā)明實驗例1中淫羊藿苷對照品溶液的hplc圖；圖2是本發(fā)明實驗例1中益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的供試品溶液的hplc圖；圖3是本發(fā)明實驗例1中淫羊藿苷對照品溶液的紫外掃描圖；圖4是本發(fā)明實驗例1中淫羊藿的陰性樣品溶液的hplc圖；圖5是本發(fā)明實驗例1中淫羊藿苷的標準曲線圖；圖6是本發(fā)明實驗例2中實施例5的tlc色譜圖；圖7是本發(fā)明實驗例2中對比例1的tlc色譜圖。具體實施方式實施例1一種益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的制備本實施例益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的原料藥組成為：紅參20g、鹿肉30g、淫羊藿75g、狗脊75g、墨旱蓮100g、玉竹25g、女貞子(酒制)151g、熟地黃100g、鎖陽51g、續(xù)斷50g、白術(shù)(炒)75g、仙鶴草100g、黨參50g、雞血藤201g；按照以下方法進行制備：以上十四味，取紅參、鹿肉8g、淫羊藿8g、狗脊8g、墨旱蓮11g、玉竹3g、女貞子17g、熟地黃2g、鎖陽6g、續(xù)斷1g、白術(shù)8g、仙鶴草11g、黨參1g、雞血藤22g、粉碎成細粉，過篩混勻；剩余鹿肉加水煎煮4小時，濾過；藥渣與剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次4小時，濾過，濾液與鹿肉合并，濃縮至相對密度為1.32(80℃)的稠膏，加入上述細粉，混勻，制成顆粒，加入輔料適量，壓制成1000片，包薄膜衣，即得。實施例2hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量本實施例hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量，包括如下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，精密稱定，研細，取2g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加入稀乙醇40ml，在功率350w、頻率35khz的條件下超聲處理1小時，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1ml中含10μg的溶液，即得對照品溶液；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為29:71乙腈-水溶液為流動相，檢測波長為270nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于2000；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑每片含淫羊藿以淫羊藿苷(c33h40o15)計，應不得少于50μg。實施例3hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量本實施例hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量，包括如下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，精密稱定，研細，取1g，精密稱定，置60ml容量瓶中，加入稀乙醇30ml，在功率350w、頻率35khz的條件下超聲處理2小時，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1ml中含5μg的溶液，即得對照品溶液；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為35：65乙腈-水溶液為流動相，檢測波長為260nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于2000；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各15μl，注入液相色譜儀，測定，即得。實施例4hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量本實施例hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量，包括如下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，精密稱定，研細，取3g，精密稱定，置40ml容量瓶中，加入稀乙醇50ml，在功率350w、頻率35khz的條件下超聲處理0.5小時，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1ml中含15μg的溶液，即得對照品溶液；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為25：75乙腈-水溶液為流動相，檢測波長為280nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于2000；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定，即得。實施例5tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1本實施例tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1的方法包括以下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，研細，加甲醇40ml，水浴回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30ml使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水50ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷rg1對照品，加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的供試品色譜中，應在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。實施例6tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1本實施例tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1的方法包括以下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，研細，加甲醇30ml，水浴回流2小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水60ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷rg1對照品，加甲醇制成每1ml中含2mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。實施例7tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1本實施例tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1的方法包括以下步驟：取待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑，研細，加甲醇50ml，水浴回流0.5小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40ml使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取1次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水40ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液；另取人參皂苷rg1對照品，加甲醇制成每1ml中含0.5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。實施例8tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中齊墩果酸本實施例tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中齊墩果酸的方法包括以下步驟：取待測藥物制劑，研細，加2％的氫氧化鈉溶液30ml，超聲處理30分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，上清液用鹽酸調(diào)ph2-3，用乙醚振搖提取2次，每次30ml，合并乙醚提取液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；另取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5-10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠g薄層板上，以體積比為20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。待測益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的供試品色譜中，應在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。對比例1本對比例tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1的方法包括以下步驟：取待測藥物制劑，研細，精密稱取30g，置500ml圓底燒瓶中，加甲醇200ml，置85℃水浴中回流lh，放冷，濾過取濾液250ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加熱水50ml使溶解，轉(zhuǎn)移至250ml分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次(50ml，50ml，50ml)，合并正丁醇液，用氨試液洗2次(50ml，50ml)，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲2ml使溶解，作為供試品溶液。吸取上述供試品溶液20μl，對照品溶液2μl，分別點于同一硅膠g板上，以氯仿一甲醇一水(13：7：2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。實驗例1hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量的方法學驗證1、實驗目的對hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量進行方法學驗證。2、實驗方法2.1儀器、藥品與試劑高效液相色譜儀(安捷侖1200)，高效液相色譜儀(島津lc-20ad)，包括在線脫氣機，全自動進樣器，紫外可變波長檢測器；diamonsil(鉆石1代)c184.6i250mm5μm色譜柱，diamonsil(2)c184.6l250mm5μm色譜柱，spurisilc184.6紫250mm5μm色譜柱，sartoriusbs電子天平(cp224scp225d)；色譜純乙腈，其它試劑均為分析純；淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，編號為110737-200415),實施例1制備的益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑(即：參鹿補片，江西藥都仁和制藥有限期公司生產(chǎn)，批號見文內(nèi))。2.2實驗步驟按照實施例2的方法進行測定。2.3重復性實驗照上述條件分析，取淫羊藿苷對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，具體實驗結(jié)果如表1所示。表1重復性實驗的實驗結(jié)果由表1可知，hplc法測定益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中淫羊藿苷的含量的重復性試驗結(jié)果rsd為0.72％，這表明其重復性良好；且分離度均大于1.5，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算均大于2000。淫羊藿苷對照品溶液hplc圖如圖1所示，益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑的供試品溶液hplc圖如圖2所示。由圖1和圖2可知，淫羊藿苷對照品的和制劑中的其它組分均能達到基線分離。2.4波長選擇取淫羊藿苷對照品一定量，加稀乙醇溶液使溶解，置uv-2450(島津)紫外儀內(nèi)掃描，結(jié)果淫羊藿苷在270nm處有一吸收峰，淫羊藿苷對照品溶液紫外掃描圖如圖3所示。故結(jié)合《中國藥典》2010年版一部淫羊藿藥材【含量測定】項下條件，選擇淫羊藿苷270nm為檢測波長。2.5溶劑的選擇曾取淫羊藿苷對照品14.86mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇70ml，超聲，結(jié)果溶液一直呈混濁狀態(tài)，不能完全溶解，再加入20ml水后超聲，則能溶解，溶液呈澄清、透明狀態(tài)。故參照《中國藥典》2010年版一部淫羊藿藥材【含量測定】項下條件以稀乙醇為溶劑。2.6預試驗參照《中國藥典》2010年版一部淫羊藿藥材【含量測定】項下條件進行試驗：淫羊藿苷對照品溶液約14.06μg/ml，供試品取樣量分別為1g、2g，稀釋倍數(shù)為50ml，進樣量為10μl，結(jié)果取樣量為2g的供試品溶液峰面積比對照品溶液峰面積還稍小，故擬定淫羊藿苷濃度應配制成10μg/ml、供試品取樣量約為2g，稀釋倍數(shù)為50，進樣量為10μl。2.7供試品溶液制備的條件考察參考中國藥典2010年版淫羊藿藥材項下條件，采用稀乙醇作為溶劑，比較不同的超聲提取時間(超聲處理20、40、60、80分鐘)對含量結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。表2不同的超聲提取時間對含量結(jié)果的影響樣品編號超聲時間(分鐘)淫羊藿苷含量(mg/g)12055.824062.936070.248070.1由表2可知，超聲處理60分鐘比超聲處理40分鐘的含量高，超聲處理60分鐘與超聲處理80分鐘效果一樣，故選擇超聲處理60分鐘可以充分提取出供試品中的淫羊藿苷。2.8專屬性試驗按處方取不含淫羊藿的其它藥材，按制法制成陰性樣品，再按正文供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。淫羊藿的陰性樣品溶液hplc圖如圖4所示。分別吸取淫羊藿苷對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10μl，分別注入液色譜儀，測定。由圖1、2和4可知，供試品色譜中，在與淫羊藿苷對照品溶液色譜相同保留時間處，有相應的色譜峰，且與其它組分均能達到基線分離；而陰性樣品溶液色譜中，在與淫羊藿苷對照品色譜相同保留時間處無特征峰，證明陰性無干擾，本法具有專屬性。2.9線性關(guān)系的考察精密稱取淫羊藿苷對照品11.92mg，置100ml的量瓶中，加稀乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻,得母液(119.2μg/ml)，再分別精密吸取1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml，分別置50ml量瓶中，用加稀乙醇稀釋成不同濃度的對照品溶液：2.384μg/ml、7.152μg/ml、11.92μg/ml、16.688μg/ml、21.456μg/ml。分別精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按標準正文中色譜條件分析，測定峰面積，結(jié)果見表3。表3線性關(guān)系考察結(jié)果以淫羊藿苷的濃度(μg/ml)為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線，結(jié)果如圖5所示。進行線性回歸，得回歸方程y＝20.274x–0.8025，相關(guān)系數(shù)r2＝1，表明淫羊藿苷在2.384～21.456μg/ml(進樣量為10μl)范圍內(nèi)線性良好，呈一條直線，且?guī)缀跬ㄟ^原點，可以用單點外標面積法測定并計算含量。2.10精密度試驗取淫羊藿苷對照品溶液(濃度為11.92μg/ml)，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果見表4。表4精密度試驗結(jié)果由表4可知，淫羊藿苷峰面積積分值的相對標準偏差為0.33％，小于2％，表明此法精密度良好。2.11穩(wěn)定性試驗取本品(批號為120801)，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，同時取淫羊藿苷對照品溶液(11.92μg/ml)，分別在放置0、2、4、6、8、10、12、24小時后，依法測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表5。表5穩(wěn)定性試驗結(jié)果由表5可知，在放置24小時內(nèi)的淫羊藿苷對照品峰面積、供試品峰面積以及兩者峰面積比值、淫羊藿苷的含量的rsd均小于2％，穩(wěn)定性良好。2.12重復性試驗取本品(批號為110801)各6份，按正文中含量測定項下方法試驗，測定淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表6。表6重復性試驗結(jié)果由表6可知，樣品中淫羊藿苷含量的相對標準偏差均小于2％，表明此法重復性良好。2.13加樣回收試驗采用加樣回收法，取本品(批號為120801，已知淫羊藿苷含量為232.03μg/g)1g共6份；精密稱定，分別定量加入淫羊藿苷對照品適量，按正文中含量測定項下方法測定淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表7。表7回收率試驗結(jié)果由表7可知，淫羊藿苷平均回收率99.46％，相對標準偏差0.63％；表明此法回收率良好。2.14耐用性試驗不同時間，不同人員分別采用不同的高效液相色譜儀及不同的色譜柱，在色譜條件如溫度、流速、流動相比例稍改變的情況下，對同一批樣品(110801)中淫羊藿苷的含量進行測定，結(jié)果見表8。表8耐用性試驗結(jié)果由表8可知，不同時間，不同人員分別采用不同的高效液相色譜儀及不同的色譜柱，在色譜條件如溫度、流速、流動相比例稍改變的情況下，對同一批樣品(110801)中淫羊藿苷的含量進行測定，平均含量為232.08μg/g，rsd為1.66％，結(jié)果精密度良好，表明作為測定本品中的淫羊藿苷的含量方法，耐用性良好。2.15樣品測定取本品6批，按正文中含量測定項下方法測定淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表9。表9參鹿補片中淫羊藿苷含量測定結(jié)果批號淫羊藿苷含量(μg/片)13020170.613020271.213020370.9150301711503027115030371結(jié)合上述6批樣品的含量測定結(jié)果，擬定本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(c33h40o15)計，不得少于50μg。結(jié)論：以上試驗結(jié)果表明，所建立的參鹿補片中淫羊藿苷的含量測定方法科學、簡便，能有效地控制參鹿補片中淫羊藿苷的含量。實驗例2tlc法鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1的方法學驗證按照實施例5的方法對實施例1制備的益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑(即：參鹿補片，江西藥都仁和制藥有限期公司生產(chǎn)，批號120901、120902、1220903)三批各10片中人參皂苷rg1進行鑒別，所得tlc色譜圖見圖6，其中：1表示的為陰性對照品，2表示的為人參皂苷rg1對照品，3、4、5均表示的為參鹿補片。由圖6可知，人參皂苷rg1的rf約0.60，各供試品色譜中，在與人參皂苷rg1對品色譜相應位置上，均顯相同顏色的斑點，斑點清晰、圓整、分離理想，而陰性對照中卻沒有相應的斑點，證明方法可行，可用于本品中人參皂苷rg1的檢識。對比例1的tlc色譜圖如圖7所示，其中，1表示的為陰性對照品，2表示的人參皂苷rg1對照品，3、4、5均表示的為參鹿補片。由圖7可知，盡管供試品色譜中的色帶較深，但是在與對照品色譜相應位置上的斑點比較淡。原因可能如下：采用氨試液洗滌會造成提取中人參皂苷rg1的損失。因此，對比例1的方法并不適用于鑒別益氣養(yǎng)血、補腎壯陽的片劑中人參皂苷rg1。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。當前第1頁12