本發(fā)明屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過熒光法同時(shí)檢測多種miRNA的方法。

背景技術(shù)：

肺癌是導(dǎo)致全球癌癥死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬，其中非小細(xì)胞肺癌(no-small cell lung cancer，NSCLC)占80％以上，包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。盡管近年來在肺癌影像學(xué)檢查及靶向治療等方面取得了較大進(jìn)展，但NSCLC 5年總生存率仍不足15％。缺乏有效的早期診斷是NSCLC預(yù)后不佳的主要原因。多數(shù)患者在臨床確診時(shí)已屬中晚期，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會。胸片和CT等檢查特異度低，而現(xiàn)有的血液腫瘤標(biāo)志物對于肺癌診斷的敏感度較低，缺乏早期診斷的效能。因此，探尋高敏感度和高特異度的標(biāo)志物成為肺癌早期診斷及治療的迫切需求。近來研究表明，一些特定的microRNA(miRNA)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肺癌的發(fā)生過程中起促癌或抑癌作用，可作為肺癌診斷和治療的靶點(diǎn)。

miRNA是一組進(jìn)化保守的單鏈非編碼RNA，長度多在21～23個(gè)核苷酸，可特異性識別靶mRNA并調(diào)控編碼基因的表達(dá)，通過促進(jìn)mRNA降解或抑制基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響mRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。miRNA參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤具有不同的miRNA表達(dá)譜，在腫瘤組織中miRNA發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，參與了包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的基因調(diào)控環(huán)路和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。此外，機(jī)體的各種體液中，包括血漿、痰液、胸液等等，有大量可檢測的細(xì)胞外miRNA，其穩(wěn)定存在且不易被RNA酶降解，使得miRNA既可作為肺癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，也可作為判斷患者預(yù)后的有效指標(biāo)，甚至可以成為一種新的治療手段。

目前，一些定性和定量分析miRNA的技術(shù)包括印跡雜交、原位雜交微球陣列雜交微陣列雜交和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等目前已經(jīng)被建立起來。然而，miRNA的分析檢測仍然具有挑戰(zhàn)性，這是由于其獨(dú)特的性質(zhì)，包括尺寸短、序列相似度高(同源性)、容降解等，使得miRNA較難應(yīng)用于以核酸雜交為基礎(chǔ)的生物傳感器領(lǐng)域中因此，在未來迫切需要開發(fā)一系列方法來對miRNA進(jìn)行快速、靈敏和多通道的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種通過熒光法同時(shí)檢測多種miRNA的方法，該方法基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)單波長激發(fā)，同時(shí)發(fā)射多種不同波長的熒光從而對應(yīng)檢測肺癌組織中過表達(dá)的多種miRNA，并對熒光信號進(jìn)行串?dāng)_校正，得到更加準(zhǔn)確的miRNA的濃度，原理簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、準(zhǔn)確性高，并且而無需任何大型儀器。

技術(shù)方案：一種通過熒光法同時(shí)檢測多種miRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)用多種熒光素分別標(biāo)記與多種miRNA對應(yīng)的核酸探針；選擇可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)將發(fā)射能量轉(zhuǎn)移給所述多種熒光素的核酸染料作為熒光供體；

2)計(jì)算多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光串?dāng)_校正因子；

3)分別取不同已知濃度的所述多種miRNA溶液，使多種miRNA、核酸探針和輔助探針雜交形成核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)，使熒光供體嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中，激發(fā)熒光供體，檢測多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光信號，用熒光串?dāng)_校正因子對熒光信號進(jìn)行校正，獲得校正后的多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光強(qiáng)度與miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式；

4)取待測miRNA溶液，使待測miRNA、核酸探針和輔助探針雜交形成核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)，使熒光供體嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中，激發(fā)熒光供體，檢測多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光信號，用步驟3)獲得的對應(yīng)關(guān)系式計(jì)算得到miRNA的濃度。

其中，多種miRNA分別為miRNA-155、miRNA-182和miRNA-197三種miRNA；多種熒光素分別為Cy3、Cy3.5和Cy5三種熒光素；熒光供體為核酸染料TOTO-1。

步驟2)計(jì)算多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光串?dāng)_校正因子的具體方法為：分別將每種熒光素在最大發(fā)射波長處的熒光信號強(qiáng)度與所有其它熒光素在此波長處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行對比，得到熒光串?dāng)_校正因子M。

步驟3)獲得的校正后的多種miRNA對應(yīng)的熒光素的熒光強(qiáng)度P₁、P₂、P₃與miRNA濃度C_miRNA-155、C_miRNA-182、C_miRNA-197的對應(yīng)關(guān)系式為：

P₁＝1297.7lnC_miRNA-155+2758.9；

P₂＝1453.7lnC_miRNA-182+2748.1；

P₃＝788.8lnC_miRNA-197+1240.7；

其中，濃度單位為nM。

步驟3)中，不同已知濃度的多種miRNA溶液濃度在0～50nM范圍內(nèi)，熒光供體的濃度在100～300nM范圍內(nèi)。

步驟3)和步驟4)中，雜交是在無DNAse/RNAase的磷酸鹽緩沖溶液中，20～37℃下反應(yīng)2～4小時(shí)；使熒光供體嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中的方法為：向雜交形成的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中加入所述熒光供體，在20～37℃下反應(yīng)1～2小時(shí)；步驟3)和步驟4)中，激發(fā)熒光供體的激發(fā)光波長為440nm。

本發(fā)明的工作原理：核酸染料(TOTO-1)和熒光素(Cy3，Cy3.5，Cy5)標(biāo)記的核酸探針在游離狀態(tài)下不發(fā)熒光。當(dāng)目標(biāo)miRNA，輔助探針和熒光素標(biāo)記的核酸探針同時(shí)存在時(shí)，會通過雜交反應(yīng)形成核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)用440nm的激發(fā)光激發(fā)時(shí)，嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中的TOTO-1發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。TOTO-1的熒光發(fā)射光譜與Cy3，Cy3.5，Cy5的激發(fā)光譜相重疊，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(FRET)可將其發(fā)射能量轉(zhuǎn)移給三種熒光素。Cy3，Cy3.5和Cy5的最大發(fā)射波長分別為570nm，596nm和670nm，可有效區(qū)分相應(yīng)的熒光信號。當(dāng)溶液中含有miRNA-155，miRNA-182或miRNA-197時(shí)，可以檢測到對應(yīng)熒光素的熒光信號。通過對檢測信號進(jìn)行熒光串?dāng)_校正后，可以得到溶液中任意一種miRNA的準(zhǔn)確濃度。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的特色及優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明利用單一波長激發(fā)實(shí)現(xiàn)多種miRNA的同時(shí)檢測，簡化了檢測方法，提高了肺癌診斷的準(zhǔn)確度；

(2)本發(fā)明利用熒光串?dāng)_校正的方法有效降低了背景信號和熒光素信號之間的干擾，可準(zhǔn)確測量溶液中任一miRNA的濃度；

(3)本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對人體體液中miRNA的熒光檢測，不需要借助精密儀器，簡化了檢測方法，極大地降低了檢測成本，本發(fā)明具有成本低、快速、簡便、敏感且特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)和光譜串?dāng)_校正技術(shù)單波長激發(fā)熒光法檢測3種miRNA的流程圖；其中，表示TOTO-1，表示P1，表示P2，表示P3，表示輔助配體；

圖2A為熒光供體TOTO-1和熒光受體Cy3、Cy3.5、Cy5的吸收/發(fā)射光譜；圖2B為熒光供體TOTO-1的發(fā)射光譜和熒光受體Cy3，Cy3.5，Cy5的吸收光譜的重疊情況示意圖；從圖中可以看出熒光供體TOTO-1的發(fā)射光譜和熒光受體Cy3，Cy3.5，Cy5的吸收光譜有部分重疊，滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的基本條件。

圖3A顯示了熒光供體TOTO-1在沒有發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)的熒光發(fā)射光譜以及溶液中存在對應(yīng)的一種miRNA引發(fā)能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)的熒光受體Cy3，Cy3.5，Cy5的對應(yīng)熒光發(fā)射光譜；從圖中可以看出熒光供體TOTO-1在沒有發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號，當(dāng)溶液中含有miRNA-155時(shí)，miRNA-155與對應(yīng)的探針發(fā)生雜交反應(yīng)，嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中的熒光供體TOTO-1的能量會轉(zhuǎn)移給熒光受體Cy3，可以檢測到溶液中Cy3的熒光發(fā)射信號；同理，當(dāng)溶液中含有miRNA-182或miRNA-197時(shí)，可以檢測到溶液中Cy3.5或Cy5的熒光發(fā)射信號。圖3B顯示當(dāng)溶液中存在兩種或三種miRNA時(shí)，對應(yīng)溶液的熒光發(fā)射光譜；從圖中可以看出熒光供體TOTO-1可將其能量同時(shí)轉(zhuǎn)移給兩種或三種熒光素，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測溶液中的三種miRNA。

圖4A、4B和4C為熒光串?dāng)_校正前的熒光信號隨miRNA濃度的變化；圖4A′、4B′和4C′為使用公式1熒光串?dāng)_校正后的熒光信號隨miRNA濃度的變化。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1～3中用到的試劑和儀器：

未標(biāo)記熒光素Cy3的核酸探針P1′，Cy3標(biāo)記的熒光探針P1，Cy3.5標(biāo)記的熒光探針P2和Cy3.5標(biāo)記的熒光探針P3，輔助探針L1、L2、L3和miRNA-155，miRNA-182，miRNA-197(Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&Services Co.Ltd.，Shanghai，China)，其具體堿基序列見表2。TOTO-1(Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)，無DNA/RNA酶的1×PBS(Sunshine Biotechnology，Nanjing，China)，紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-2450，Kyoto，Japan)，熒光儀(Fluoromax-4，Horiba Jobin Yvon，Japan)，離心機(jī)(Eppendorf，German)，石英比色皿。

發(fā)明人利用熒光光譜儀分別測量TOTO-1，Cy3，Cy3.5和Cy5的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，對得到的圖譜進(jìn)行歸一化處理，得到圖2。

從圖2中可以看出熒光供體TOTO-1的發(fā)射光譜和熒光受體Cy3，Cy3.5，Cy5的吸收光譜有部分重疊，滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的基本條件。

實(shí)施例1

(1)探針的制備和熒光供體的選擇

對應(yīng)于miRNA-155的熒光素Cy3標(biāo)記的核酸探針為P1，對應(yīng)miRNA-182制備的熒光素Cy3.5標(biāo)記的核酸探針為P2，對應(yīng)于miRNA-197制備的熒光素Cy5標(biāo)記的核酸探針為P3，對應(yīng)于miRNA-155制備的輔助探針為L1，對應(yīng)于miRNA-182制備的輔助探針為L2，對應(yīng)于miRNA-197制備的輔助探針為L3，選擇核酸染料TOTO-1作為熒光供體。其中，miRNA-155、miRNA-182、miRNA-197，熒光素標(biāo)記的核酸探針P1、P2、P3以及輔助探針L1、L2、L3的核酸序列如表1所示。

表1

(2)原理驗(yàn)證

取8個(gè)EP管，第一管加入10nM的L1、P1′(未標(biāo)記熒光素Cy3的核酸探針)、miRNA-155，第二管加入10nM的L1、P1、miRNA-155，第三管加入10nM的L2、P2、miRNA-182，第四管加入10nM的L3、P3、miRNA-197，第五管加入10nM的L1、P1、miRNA-155和L2、P2、miRNA-182，第六管加入10nM的L1、P1、miRNA-155和L3、P3、miRNA-197，第七管加入10nM的L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197，第八管加入10nM的L1、P1、miRNA-155、L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197。

將八管樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中25℃雜交2小時(shí)。向反應(yīng)溶液中分別加入100nMTOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，25℃反應(yīng)1小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。第一管樣品為TOTO-1嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號，對應(yīng)圖3A中TOTO-1標(biāo)注的黑色曲線；第二管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3標(biāo)注的綠色曲線；第三管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3.5標(biāo)注的橙色曲線；第四管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy5標(biāo)注的紅色曲線；第五管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的黑色曲線；第六管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的綠色曲線；第七管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的藍(lán)色曲線；第八管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的紅色曲線。由圖3可以看出，當(dāng)溶液中存在一種(對應(yīng)圖3A中的四條曲線)，兩種或三種miRNA(對應(yīng)圖3B中的四條曲線)時(shí)均可檢測到對應(yīng)的熒光素信號，結(jié)果表明基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光法檢測三種miRNA的方法是可行的。

(3)計(jì)算熒光串?dāng)_校正因子

依據(jù)圖3A，確立熒光素Cy3，Cy3.5和Cy5的熒光最大發(fā)射波長處為各自對應(yīng)miRNA的輸出通道，其通道對應(yīng)熒光素?zé)晒庾畲蟀l(fā)射信號為目標(biāo)信號，在各自通道中的其它兩種熒光素的信號為熒光串?dāng)_信號。然后將各通道中的目標(biāo)信號歸一化，計(jì)算各通道中熒光串?dāng)_信號與目標(biāo)信號的比值，得到對應(yīng)的熒光串?dāng)_校正因子M，M為3×3光譜串?dāng)_校正矩陣，參見表2。表2為單波長激發(fā)下不同熒光素在各檢測通道中光譜串?dāng)_強(qiáng)度比值。

表2

^*加粗部分是方程1中的3×3光譜串?dāng)_校正矩陣M。

(4)熒光信號與miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系

取三組EP管，每組9個(gè)EP管。第一組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nMmiRNA-155。第二組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nM miRNA-182。第三組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nM miRNA-197。三組樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中25℃雜交2小時(shí)。向上述溶液中分別加入100nM TOTO-1，反應(yīng)液總體積為500μL，25℃反應(yīng)1小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。然后使用公式1對原始測量熒光強(qiáng)度(I)進(jìn)行校正，扣除兩種熒光素在第三種熒光素最大發(fā)射波長處的熒光串?dāng)_背景信號，得到每個(gè)熒光素在各自最大發(fā)射波長處的校正熒光強(qiáng)度(P)，從而得到對應(yīng)miRNA的真實(shí)濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。4A、4B和4C圖顯示熒光串?dāng)_校正前的熒光信號隨miRNA濃度的變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾很明顯；A′B′C′圖顯示了使用公式1熒光串?dāng)_校正后的熒光強(qiáng)度(P)隨miRNA濃度(C_miRNA)的對數(shù)變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾明顯被消除，miRNA在0.2nM到10nM之間其濃度的對數(shù)與對應(yīng)熒光信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式為：

P₁＝1297.7lnC_miRNA-155+2758.9；

P₂＝1453.7lnC_miRNA-182+2748.1；

P₃＝788.8lnC_miRNA-197+1240.7。

(5)三種miRNA同時(shí)檢測

取三個(gè)EP管，記作第一管、第二管和第三管。第一管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和0.5nM miRNA-155、10nM miRNA-182、10nM miRNA-197；第二管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和1nM miRNA-155、7nM miRNA-182、10nM miRNA-197；第三管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和3nM miRNA-155、3nM miRNA-182、3nM miRNA-197。

三管樣品分別在無DNAse/RNAase的1×PBS中25℃雜交2小時(shí)。向上述溶液中分別加入100nM TOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，25℃反應(yīng)1小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。將原始測量熒光強(qiáng)度(I)利用公式1計(jì)算得到校正熒光強(qiáng)度(P)，代入校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式，得到各管樣本中三種miRNA的測量值，將測量值與已知加入值進(jìn)行比較得到三管樣品中三種miRNA的回收率。

實(shí)施例2

(1)探針的制備和熒光供體的選擇

參見實(shí)施例1第(1)部分。

(2)原理驗(yàn)證

取8個(gè)EP管，第一管加入5nM的L1、P1′(未標(biāo)記熒光素Cy3的核酸探針)、miRNA-155，第二管加入5nM的L1、P1、miRNA-155，第三管加入5nM的L2、P2、miRNA-182，第四管加入5nM的L3、P3、miRNA-197，第五管加入5nM的L1、P1、miRNA-155和L2、P2、miRNA-182，第六管加入5nM的L1、P1、miRNA-155和L3、P3、miRNA-197，第七管加入5nM的L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197，第八管加入5nM的L1、P1、miRNA-155、L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197。

將八管樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中20℃雜交4小時(shí)。向反應(yīng)溶液中分別加入100nMTOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，20℃反應(yīng)2小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例獲得的熒光發(fā)射譜圖與實(shí)施例1相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。第一管樣品為TOTO-1嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號，對應(yīng)圖3A中TOTO-1標(biāo)注的黑色曲線；第二管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3標(biāo)注的綠色曲線；第三管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3.5標(biāo)注的橙色曲線；第四管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy5標(biāo)注的紅色曲線；第五管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的黑色曲線；第六管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的綠色曲線；第七管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的藍(lán)色曲線；第八管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的紅色曲線。由圖3可以看出，當(dāng)溶液中存在一種(對應(yīng)圖3A中的四條曲線)，兩種或三種miRNA(對應(yīng)圖3B中的四條曲線)時(shí)均可檢測到對應(yīng)的熒光素信號，結(jié)果表明基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光法檢測三種miRNA的方法是可行的。

(3)計(jì)算熒光串?dāng)_校正因子

依據(jù)圖3A，確立熒光素Cy3，Cy3.5和Cy5的熒光最大發(fā)射波長處為各自對應(yīng)miRNA的輸出通道，其通道對應(yīng)熒光素?zé)晒庾畲蟀l(fā)射信號為目標(biāo)信號，在各自通道中的其它兩種熒光素的信號為熒光串?dāng)_信號。然后將各通道中的目標(biāo)信號歸一化，計(jì)算各通道中熒光串?dāng)_信號與目標(biāo)信號的比值，得到對應(yīng)的熒光串?dāng)_校正因子M，M為3×3光譜串?dāng)_校正矩陣，參見表2。表2為單波長激發(fā)下不同熒光素在各檢測通道中光譜串?dāng)_強(qiáng)度比值。

(4)熒光信號與miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系

取三組EP管，每組9個(gè)EP管。第一組每個(gè)EP管中均加入5nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4或5nMmiRNA-155。第二組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4或5nMmiRNA-182。第三組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4或5nMmiRNA-197。三組樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中20℃雜交4小時(shí)。向上述溶液中分別加入100nM TOTO-1，反應(yīng)液總體積為500μL，20℃反應(yīng)2小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。然后使用公式1對原始測量熒光強(qiáng)度(I)進(jìn)行校正，扣除兩種熒光素在第三種熒光素最大發(fā)射波長處的熒光串?dāng)_背景信號，得到每個(gè)熒光素在各自最大發(fā)射波長處的校正熒光強(qiáng)度(P)，從而得到對應(yīng)miRNA的真實(shí)濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。4A、4B和4C圖顯示熒光串?dāng)_校正前的熒光信號隨miRNA濃度的變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾很明顯；A′B′C′圖顯示了使用公式1熒光串?dāng)_校正后的熒光強(qiáng)度(P)隨miRNA濃度(C_miRNA)的對數(shù)變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾明顯被消除，miRNA在0.1nM到5nM之間其濃度的對數(shù)與對應(yīng)熒光信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式為：

P₁＝1297.7lnC_miRNA-155+2758.9；

P₂＝1453.7lnC_miRNA-182+2748.1；

P₃＝788.8lnC_miRNA-197+1240.7。

(5)三種miRNA同時(shí)檢測

取3個(gè)EP管，分別記為第四管、第五管和第六管。第四管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和7nM miRAN-155、1nM miRNA-182、10nM miRNA-197；第五管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和10nM miRAN-155、0.5nM miRNA-182、10nM miRNA-197；第六管加入10nM的L1、P1、L2、P2、L3、P3和10nM miRAN-155、1nM miRNA-182、7nM miRNA-197。

三管樣品分別在無DNAse/RNAase的1×PBS中20℃雜交4小時(shí)。向上述溶液中分別加入100nM TOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，20℃反應(yīng)2小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。將原始測量熒光強(qiáng)度(I)利用公式1計(jì)算得到校正熒光強(qiáng)度(P)，代入校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式，得到各管樣本中三種miRNA的測量值，將測量值與已知加入值進(jìn)行比較得到三管樣品中三種miRNA的回收率。

實(shí)施例3

(1)探針的制備和熒光供體的選擇

參見實(shí)施例1第(1)部分。

(2)原理驗(yàn)證步驟

取8個(gè)EP管，第一管加入10nM的L1、P1′(未標(biāo)記熒光素Cy3的核酸探針)、miRNA-155，第二管加入10nM的L1、P1、miRNA-155，第三管加入10nM的L2、P2、miRNA-182，第四管加入10nM的L3、P3、miRNA-197，第五管加入10nM的L1、P1、miRNA-155和L2、P2、miRNA-182，第六管加入10nM的L1、P1、miRNA-155和L3、P3、miRNA-197，第七管加入10nM的L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197，第八管加入10nM的L1、P1、miRNA-155、L2、P2、miRNA-182和L3、P3、miRNA-197。

將八管樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中37℃雜交3小時(shí)。向反應(yīng)溶液中分別加入100nMTOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，37℃反應(yīng)1小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例獲得的熒光發(fā)射譜圖與實(shí)施例1相同，見圖3。第一管樣品為TOTO-1嵌入到核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號，對應(yīng)圖3A中TOTO-1標(biāo)注的黑色曲線；第二管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3標(biāo)注的綠色曲線；第三管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy3.5標(biāo)注的橙色曲線；第四管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3A中Cy5標(biāo)注的紅色曲線；第五管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的黑色曲線；第六管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的綠色曲線；第七管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的藍(lán)色曲線；第八管樣品熒光發(fā)射譜圖對應(yīng)圖3B中的紅色曲線。由圖3可以看出，當(dāng)溶液中存在一種(對應(yīng)圖3A中的四條曲線)，兩種或三種miRNA(對應(yīng)圖3B中的四條曲線)時(shí)均可檢測到對應(yīng)的熒光素信號，結(jié)果表明基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的熒光法檢測三種miRNA的方法是可行的。

(3)計(jì)算熒光串?dāng)_校正因子

依據(jù)圖3A，確立熒光素Cy3，Cy3.5和Cy5的熒光最大發(fā)射波長處為各自對應(yīng)miRNA的輸出通道，其通道對應(yīng)熒光素?zé)晒庾畲蟀l(fā)射信號為目標(biāo)信號，在各自通道中的其它兩種熒光素的信號為熒光串?dāng)_信號。然后將各通道中的目標(biāo)信號歸一化，計(jì)算各通道中熒光串?dāng)_信號與目標(biāo)信號的比值，得到對應(yīng)的熒光串?dāng)_校正因子M，M為3×3光譜串?dāng)_校正矩陣，參見表2。表2為單波長激發(fā)下不同熒光素在各檢測通道中光譜串?dāng)_強(qiáng)度比值。

(4)熒光信號與miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系

取三組EP管，每組9個(gè)EP管。第一組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nMmiRNA-155。第二組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nMmiRNA-182。第三組每個(gè)EP管中均加入10nM L1、P1、L2、P2、L3和P3，然后分別向9個(gè)EP管中加入0、0.2、0.5、1、2、4、6、8或10nMmiRNA-197。三組樣品在無DNAse/RNAase的1×PBS中37℃雜交3小時(shí)。向上述溶液中分別加入200nM TOTO-1，反應(yīng)液總體積為500μL，37℃反應(yīng)2小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。然后使用公式1對原始測量熒光強(qiáng)度(I)進(jìn)行校正，扣除兩種熒光素在第三種熒光素最大發(fā)射波長處的熒光串?dāng)_背景信號，得到每個(gè)熒光素在各自最大發(fā)射波長處的校正熒光強(qiáng)度(P)，從而得到對應(yīng)miRNA的真實(shí)濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。4A、4B和4C圖顯示熒光串?dāng)_校正前的熒光信號隨miRNA濃度的變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾很明顯；A′B′C′圖顯示了使用公式1熒光串?dāng)_校正后的熒光強(qiáng)度(P)隨miRNA濃度(C_miRNA)的對數(shù)變化；從圖中可以看出熒光素之間的信號干擾明顯被消除，miRNA在0.2nM到10nM之間其濃度的對數(shù)與對應(yīng)熒光信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式為：

P₁＝1297.7lnC_miRNA-155+2758.9；

P₂＝1453.7lnC_miRNA-182+2748.1；

P₃＝788.8lnC_miRNA-197+1240.7。

(5)三種miRNA同時(shí)檢測

取三個(gè)EP管，分別記為第七管、第八管和第九管。第七管加入10nM的L1，P1，L2，P2，L3，P3和10nM miRAN-155，3nM miRNA-182，3nM miRNA-197。第八管加入10nM的L1，P1，L2，P2，L3，P3和10nM miRAN-155，7nM miRNA-182，1nM miRNA-197。第九管加入10nM的L1，P1，L2，P2，L3，P3和10nM miRAN-155，10nM miRNA-182，0.5nM miRNA-197。

三管樣品分別在無DNAse/RNAase的1×PBS中37℃雜交3小時(shí)。向上述溶液中分別加入100nM TOTO-1，反應(yīng)總體積為500μL，37℃反應(yīng)1小時(shí)后，熒光儀440nm處激發(fā)，檢測上述溶液的熒光發(fā)射譜圖。將原始測量熒光強(qiáng)度(I)利用公式1計(jì)算得到校正熒光強(qiáng)度(P)，代入校正后的熒光強(qiáng)度與三種miRNA濃度的對應(yīng)關(guān)系式，得到各管樣本中三種miRNA的測量值，將測量值與已知加入值進(jìn)行比較得到三管樣品中三種miRNA的回收率。

實(shí)施例1～3中第(5)部分獲得的第一管到第九管的相關(guān)數(shù)據(jù)參見表3，經(jīng)過熒光串?dāng)_校正后樣品回收率在90％到109％，由此可見，本發(fā)明的方案檢測三種miRNA濃度誤差在±10％以內(nèi)。結(jié)果顯示本方法可用于同時(shí)檢測三種miRNA。

表3

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，本發(fā)明的方法不僅僅限于以上三種miRNA的檢測，還適用于其他多種miRNA的檢測，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110>東南大學(xué)

<120>一種通過熒光法同時(shí)檢測多種miRNA的方法

<130> SG20170105001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> P1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<400> 1

acccctatca cgattag 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> P2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<400> 2

agtgtgagtt ctaccatt 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> P3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<400> 3

gctgggtgga gaaggt 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213>P1′

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<400> 4

acccctatca cgattag 17

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-155

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(23)

<400> 5

uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

<210> 6

<211> 24

<212> RNA

<213> miRNA-182

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(24)

<400> 6

uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA-197

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(22)

<400> 7

uucaccaccu ucuccaccca gc 22