本發(fā)明涉及一種測(cè)定鳥類棲息地水源中汞離子濃度的方法。

技術(shù)背景

汞是一種易揮發(fā)且具有嚴(yán)重毒性的元素，汞元素一旦進(jìn)入水體，環(huán)境中的汞離子就會(huì)被細(xì)菌轉(zhuǎn)化為有機(jī)汞(如甲基汞等)，并且會(huì)一直累積在生物體內(nèi)，經(jīng)食物鏈富集作用，最后被人類以及其他動(dòng)物例如鳥類吸收產(chǎn)生危害。汞和它的衍生物會(huì)破壞生物體分子結(jié)構(gòu)，這是由于汞離子可以和蛋白質(zhì)、酶中的含硫的基團(tuán)結(jié)合。尤其是甲基汞，會(huì)嚴(yán)重毒害動(dòng)物的神經(jīng)，造成動(dòng)物的行為感知紊亂，毒害神經(jīng)和腎臟，對(duì)人類以及其他動(dòng)物例如鳥類的產(chǎn)生很大威脅。

鳥的羽毛和卵對(duì)汞富集程度高，水源中汞離子含量對(duì)鳥類群落結(jié)構(gòu)或者種群的影響是顯而易見的，另外鳥類是環(huán)境的指示劑。所以政府部門監(jiān)測(cè)水環(huán)境中汞的含量是至關(guān)重要的。因此，研究和開發(fā)更具高選擇性、更加快速、更高靈敏度的可以在自然水體等環(huán)境中實(shí)時(shí)汞離子含量檢測(cè)的方法是非常重要的，因?yàn)槿绱艘粊?lái)可以追蹤水源中汞離子含量或其變化對(duì)鳥類群落結(jié)構(gòu)或者種群的影響。

目前，常見的汞元素檢測(cè)手段主要是傳統(tǒng)的雙硫腙法比色法、陽(yáng)極溶出伏安法、氧化還原電位法、電感耦合等離子體-質(zhì)譜、原子吸收/發(fā)射光譜法、X射線熒光光譜法等。但在實(shí)際應(yīng)用中，這些檢測(cè)方法費(fèi)用高且操作復(fù)雜。而熒光探針檢測(cè)法由于具有便捷性好、選擇性、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而極為引人注目。近年來(lái)，正是處于上述的種種背景下才使得汞離子熒光探針的研究得到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。

中國(guó)專利申請(qǐng)201610463837.9公開了一種基于萘酰亞胺的汞離子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，所制備的汞離子熒光探針是以1,8-萘酰亞胺為熒光母體，依次通過(guò)與正丁胺反應(yīng)，得到強(qiáng)熒光性的中間體N-丁基-4-溴-1,8-萘酰亞胺，所得中間體與2-甲氧基芐胺反應(yīng)引入氮原子和氧原子，增強(qiáng)該化合物和金屬離子的配位能力，檢測(cè)過(guò)程中發(fā)明的該小分子傳感器上的氮原子和氧原子能很快地和汞離子發(fā)生配位，使熒光迅速增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的檢測(cè)。

中國(guó)專利申請(qǐng)201610397020.6公開了一種檸檬酸酯類熒光化合物，以二環(huán)己基碳二亞胺作為催化劑，不僅可以活化羧基，起到活化作用，還可以作為縛水劑，吸收酯化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的水，使得反應(yīng)向生成酯的方向進(jìn)行；通過(guò)簡(jiǎn)單的制備方法、較低的溫度和較短的時(shí)間就可以得到熒光強(qiáng)度較高的黃綠色的檸檬酸酯類熒光化合物，熒光量子產(chǎn)率可達(dá)5.0％。

中國(guó)專利申請(qǐng)201610112770.4公開了一種檢測(cè)汞離子的新型羅丹明熒光探針及其制備方法，屬于熒光探針及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域。該申請(qǐng)除了公開了羅丹明熒光探針的結(jié)構(gòu)，還公開了羅丹明熒光探針的制備方法：將羅丹明B與水合肼在乙醇中回流反應(yīng)生成羅丹明酰肼；然后與苯基乙二醛在乙醇中回流反應(yīng)，經(jīng)重結(jié)晶得到席夫堿；再經(jīng)硼氫化鈉還原生成熒光探針。

中國(guó)專利申請(qǐng)201511031104.X公開了一種汞離子熒光探針化合物、制備方法及應(yīng)用，涉及分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該汞離子熒光探針的化學(xué)分子式為，是由2-(2’-羥苯基)苯并咪唑?yàn)槟阁w結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)衍生化得到的。此探針對(duì)汞離子選擇性好、靈敏度高且易于制備，是一種理想的汞離子傳感分子。

根據(jù)汞離子與探針分子的作用類型，可以將汞離子熒光探針分為配位型和反應(yīng)型兩大類，配位型的熒光探針通過(guò)非共價(jià)鍵的形式將熒光探針和汞離子相絡(luò)合，但是這種絡(luò)作用力在應(yīng)用于汞離子識(shí)別時(shí)，專一選擇性并不高，而反應(yīng)型的探針是基于二者之間的化學(xué)反應(yīng)，會(huì)生成新的反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)而引起體系的熒光或紫外吸收光譜發(fā)生改變，有很強(qiáng)的專一選擇性，所以這種類型的探針具備更高的靈敏度和良好的抗陽(yáng)離子干擾能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本領(lǐng)域急需一種通過(guò)高選擇性比色比率測(cè)定Hg²⁺的方法，從而能夠有效檢測(cè)特別是能夠檢測(cè)環(huán)境中(例如鳥類棲息地中水源)的Hg²⁺。本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了一種脫硒作用來(lái)識(shí)別汞離子的探針，建立了一種可以用于汞離子含量檢測(cè)的方法。為此，本發(fā)明提出了一種新穎的高選擇性比色比率檢測(cè)Hg²⁺的探針，該探針的制備簡(jiǎn)單，和/或選擇性高，并利用該探針測(cè)定樣品中的Hg²⁺濃度。

本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中(例如鳥類棲息地中水源)的Hg²⁺的方法，其包括將如下結(jié)構(gòu)的探針與樣品接觸的步驟。

示例性地，本發(fā)明中所述的環(huán)境是指水源地，例如鳥類棲息地中水源。所述水源的存在形式可以為河流，湖泊，溝渠等。

優(yōu)選地，在探針和樣品接觸后，檢測(cè)其在456nm處的熒光強(qiáng)度。

進(jìn)一步任選地，在探針和樣品接觸前將樣品進(jìn)行稀釋，例如稀釋1-20倍，以使得稀釋后的樣品中汞離子的濃度在本發(fā)明所述探針的檢測(cè)范圍。

優(yōu)選地，在檢測(cè)樣品中汞離子濃度時(shí)，設(shè)置對(duì)照并檢測(cè)其在456nm處的熒光強(qiáng)度。

附圖說(shuō)明

圖1：探針(5μmol/L)在pH 7.4PBS乙醇/水(5：5)的緩沖溶液中隨汞離子濃度(0-10μmol/L)改變的熒光發(fā)射光譜圖，插入圖表示探針(5μmol/L)456nm處的熒光強(qiáng)度隨汞離子濃度(0-10μmol/L)的改變。汞離子的濃度從下到上分別為0，0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10μmol/L。

圖2：探針對(duì)汞離子響應(yīng)的工作曲線。

圖3：探針(5μmol/L)在pH 7.4PBS乙醇/水(5：5)的緩沖溶液中對(duì)汞離子(2.5μmol/L)響應(yīng)隨時(shí)間變化關(guān)系。

圖4：在pH 7.4PBS乙醇/水(5：5)的緩沖溶液中不同金屬離子(3μmol/L)對(duì)探針(5μmol/L)熒光強(qiáng)度的影響。F：加入不同金屬離子的熒光強(qiáng)度；F₀：不加金屬離子的熒光強(qiáng)度。

圖5：不同金屬離子共存對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響。1：空白；2：汞離子；3：汞離子+鎳離子；4：汞離子+鎂離子；5：汞離子+鈉離子；6：汞離子+鉻離子；7：汞離子+鋅離子；8：汞離子+鉛離子；9：汞離子+銅離子；10：汞離子+鉀離子；11：汞離子+鎘離子。

實(shí)施例1：熒光探針的合成

本發(fā)明的汞離子熒光探針的合成路線和方法如下所示：

具體地，將7-羥基香豆素(0.49g，3mmol)溶于THF(2mL)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下慢慢滴加硒粉(0.19g，24mmol)THF(5mL)溶液，室溫?cái)嚢?0min，加入溶于三乙胺(2mL)和THF(20mL)混合溶液的二苯基氯化膦(0.53g，24mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24h，旋干溶劑，加入25mL甲苯用分水器回洗4h，除去固體，將有機(jī)相旋干，用柱層析分離提純目標(biāo)產(chǎn)物(二氯甲烷：石油醚＝1：1)，得到1.01g紅色粉末狀熒光探針，產(chǎn)率52％。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.77-7.68(m,6H),7.62(dd,J＝10.9,4.0Hz,1H),7.55-7.43(m,8H).[M+H]⁺C₂₁H₁₆O₃PSe 427.0，發(fā)現(xiàn)427.0。

實(shí)施例2：反應(yīng)試劑的配制

探針儲(chǔ)備液和探針測(cè)試液：準(zhǔn)確稱取4.26mg的實(shí)施例1中所合成的探針，先用少量二氯甲烷溶解，然后將其移入10mL容量瓶，用乙醇定容至刻度，混勻，此時(shí)得到濃度為1mmol/L的探針儲(chǔ)備液液。并取1mL的儲(chǔ)備液加入到100mL的乙醇中，先加一些去離子水，再加入5mL的PBS緩沖液(pH＝7.4)，繼續(xù)加去離子水定容至200mL，得到5μmol/L的探針測(cè)試液。

汞離子儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取32.46mg硝酸汞(Hg(NO₃)₂)，加入去離子水進(jìn)行溶解，待樣品完全溶解后，全部移入10mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，此溶液的濃度為10mmol/L。取1mL上述溶液將其稀釋到1mmol/L。

實(shí)施例3：探針熒光光譜的測(cè)定

分別取15個(gè)10mL的比色管，然后進(jìn)行編號(hào)，分別加入5μmol/L的探針測(cè)試液5mL、然后分別加入1mmol/L的汞離子依次為0μL，2.5μL，5μL，10μL，12.5μL，15μL，17.5μL，20μL，22.5μL，25μL，30μL，35μL，40μL，45μL，50μL，搖勻。分別取上述15個(gè)比色管中溶液4mL于比色皿，在456nm處進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。

實(shí)施例1中所合成的探針中加入不同濃度汞離子熒光強(qiáng)度的變化，如圖1所示。隨著汞離子濃度的增加，其熒光強(qiáng)度也在增加，當(dāng)汞離子的濃度大于4μmol/L時(shí)，實(shí)施例1中所合成的探針的熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定，而且可以看出，汞離子濃度在0～4μmol/L時(shí)，汞離子濃度與熒光強(qiáng)度值呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。

以汞離子濃度(0～4μmol/L)為橫坐標(biāo)，在456nm處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2所示。

由圖2可以看出，當(dāng)汞離子濃度在0～4μmol/L內(nèi)，汞離子的濃度和熒光強(qiáng)度成較好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝107305x+99254(R²＝0.9875)，檢出限為0.07μmol/L。因此，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的汞離子探針能利用熒光光譜確定待測(cè)汞離子的含量。

檢出限的計(jì)算：測(cè)定20次空白溶液在456nm處的熒光強(qiáng)度值，然后計(jì)算出σ，且由工作曲線可知工作曲線的斜率K＝107305代入圖2中的公式中得出，計(jì)算出該方法的檢出限為0.07μmol/L。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1中所合成的探針與汞離子可以在水溶液中響應(yīng)，可以用熒光信號(hào)對(duì)水中的汞離子進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例4：反應(yīng)時(shí)間的確定

取出一個(gè)10mL的比色管，加入1mmol/L的探針儲(chǔ)備液5mL、然后加入1mmol/L的汞離子儲(chǔ)備液12.5μL，搖勻。取上述溶液4mL于比色皿，檢測(cè)456nm處的熒光強(qiáng)度在30min內(nèi)隨時(shí)間的變化。記錄熒光強(qiáng)度值隨著時(shí)間發(fā)生變化的情況，從而確定反應(yīng)的最佳時(shí)間。

以同一濃度的含汞溶液在不同的反應(yīng)時(shí)間條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度值，繪制在不同的反應(yīng)時(shí)間條件下的熒光強(qiáng)度值的變化曲線，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，汞離子與實(shí)施例1中所合成的探針反應(yīng)1min內(nèi)熒光強(qiáng)度急劇增加并達(dá)到穩(wěn)定，說(shuō)明該反應(yīng)為瞬時(shí)反應(yīng)。

實(shí)施例5：離子干擾試驗(yàn)

考慮在汞離子測(cè)定方法的實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)受到一些其它的金屬離子的干擾，因此，需要探討不同類型的常見的金屬離子對(duì)汞離子測(cè)定結(jié)果的影響。測(cè)試的離子包括：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Cu²⁺。

取10個(gè)10mL比色管進(jìn)行編號(hào)，分別加入5μmol/L的探針測(cè)試液5mL、然后分別不同離子：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺(濃度為1mmol/L)溶液15μL，搖勻。分別取上述10個(gè)比色管中溶液4mL于比色皿，在456nm處進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。

研究實(shí)施例1中所合成的探針對(duì)汞離子的選擇性，不同測(cè)試離子對(duì)探針熒光強(qiáng)度值的影響。測(cè)試的離子包括：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺，結(jié)果如圖4。從圖4可以看出，由于汞和硒的專一反應(yīng)，加入汞離子，在456nm處熒光強(qiáng)度值有明顯變化，而加入鎳離子、鎂離子、鈉離子、鋅離子、鉛離子、鉀離子、鎘離子和鉻離子對(duì)實(shí)施例1中所合成的探針的熒光強(qiáng)度基本無(wú)影響，相對(duì)而言，銅離子有較弱的響應(yīng)，這可能是由于銅和汞屬于同一主族，銅離子能發(fā)生汞離子的反應(yīng)，但和加入汞離子相比，其影響很小可以忽略。實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例1中所合成的探針能夠?qū)Ｒ恍缘睾凸x子進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)汞離子具有較高的選擇性。

繼續(xù)考察離子共存對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。取9個(gè)10mL比色管進(jìn)行編號(hào)，分別加入1mmol/L的實(shí)施例1中所合成的探針測(cè)試液5mL、15μL的1mmol/L汞離子、然后分別不同離子：K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、(濃度為1mmol/L)溶液15μL，搖勻。分別取上述9個(gè)比色管中溶液4mL于比色皿，在456nm處進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，其它金屬離子的加入不會(huì)干擾汞對(duì)硒的特征反應(yīng)，與單獨(dú)加入汞離子的熒光強(qiáng)度差別不大，說(shuō)明本文所探討的上述共存金屬離子對(duì)檢測(cè)汞離子的干擾比較小，可知該探針對(duì)汞離子具有較好的選擇性。

總之，基于硒與汞的強(qiáng)親和性，成功設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)新型的熒光增強(qiáng)的香豆素類探針，建立了一種用于檢測(cè)汞離子含量的方法。在乙醇/水(1/1，v/v)體系(pH＝7.4，PBS緩沖液)中，探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的檢測(cè)。探針對(duì)汞離子的響應(yīng)不受共存離子K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺的干擾，對(duì)Hg²⁺的選擇性很好。當(dāng)汞離子濃度在0-4μmol/L范圍內(nèi)，汞離子的濃度和熒光強(qiáng)度成良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝107305x+99254(R²＝0.9875)，檢出限為0.07μmol/L。

雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動(dòng)，且這些修飾和變動(dòng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。