本發(fā)明涉及檢測樣品中汞離子濃度的方法，具體而言，本發(fā)明的方法使用硫代碳酸苯酯類化合物作為汞離子熒光探針，該探針能夠迅速對汞離子高選擇性靈敏識別并可測定樣品中汞離子的濃度或?qū)ζ溥M(jìn)行定性測定。

背景技術(shù)：

汞是一種具有嚴(yán)重生理毒性的金屬元素,由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性,使其成為目前最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一。環(huán)境中的無機(jī)汞離子可在一定條件下由生物體轉(zhuǎn)化為劇毒的甲基汞。無機(jī)汞主要影響腎臟,而甲基汞進(jìn)入人體后主要侵害神經(jīng)系統(tǒng),尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。兩者均可通過食物鏈在生物組織里高度富集,從而對人和自然界造成巨大的危害。汞中毒會對整個社會產(chǎn)生極其惡劣的影響,現(xiàn)在汞被優(yōu)先列在全球環(huán)境監(jiān)控系統(tǒng)清單上,因此,對汞離子的選擇性識別,尤其是汞離子的原位、實(shí)時、在線監(jiān)測對于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)都具有重要意義。

鑒于此，發(fā)展能夠有效檢測汞離子的分析方法是極其重要和有意義的。現(xiàn)如今已報(bào)導(dǎo)的檢測汞離子的分析方法包括原子吸收-發(fā)射光譜法、高效液相色譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜、核磁共振、比色法(如傳統(tǒng)的雙硫腙法)、電化學(xué)方法(如陽極溶出伏安法、氧化還原電位法等)，在這些眾多的檢測方法中比色熒光探針由于其特有的優(yōu)點(diǎn)而成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，目前報(bào)道的比色和熒光探針仍存在一些問題，包括選擇性不夠好、響應(yīng)速度不夠快、合成復(fù)雜。由于生命體內(nèi)的其他離子如碳酸氫根離子，硫酸根離子，溴離子，氯離子，硝酸根離子，亞硝酸根離子和磷酸根離子等其他金屬離子，它會對汞離子的檢測構(gòu)成潛在干擾，因此，發(fā)展能夠高靈敏性檢測生命體內(nèi)汞離子的分析方法是必要的?？傊l(fā)展快速，高選擇性、高靈敏度、合成簡單的汞離子比色熒光雙通道探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本領(lǐng)域急需一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，從而能夠有效檢測汞離子。為此，本發(fā)明的方法是用了一類新穎的檢測汞離子的比色熒光探針，該探針其合成簡單、選擇性高、靈敏度高、能夠即刻識別汞離子。

具體而言，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其包括將具有如下結(jié)構(gòu)的汞離子熒光探針與樣品接觸的步驟，其中熒光探針結(jié)構(gòu)如下：

優(yōu)選的，本發(fā)明的熒光探針是：

優(yōu)選地，本發(fā)明中所述的樣本是水樣樣本。

本發(fā)明還提供了汞離子熒光探針的制備方法，其是通過將對應(yīng)于本發(fā)明探針的相應(yīng)熒光素類化合物與硫代氯甲酸苯酯在二氯甲烷溶液中常溫?cái)嚢?小時而合成制得。優(yōu)選的，本發(fā)明的對應(yīng)于本發(fā)明探針的相應(yīng)的熒光素類化合物是羅丹明B雜化的熒光素。

本發(fā)明還提供了檢測樣本中汞離子濃度的方法，其包括將本發(fā)明的探針與待測樣本接觸的步驟。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測樣本中汞離子濃度的制劑或試劑盒中的用途。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測樣本(例如水樣樣本)中汞離子濃度的制劑或試劑盒中的用途。

本發(fā)明的汞離子比色熒光探針可與汞離子進(jìn)行作用，產(chǎn)生熒光光譜和紫外吸收光譜的變化，從而實(shí)現(xiàn)對汞離子的定量檢測。

具體而言，本發(fā)明方法所使用的汞離子比色熒光探針分別與鋁離子、銅離子、鎂離子、鉀離子、鋅離子、鎳離子、鈉離子、亞硝酸根離子、碳酸氫根離子、硫酸根離子、碳酸根離子、氯離子、硝酸根離子、氟離子等其他離子進(jìn)行作用均不能導(dǎo)致熒光光譜和紫外吸收光譜的明顯改變，從而實(shí)現(xiàn)對汞離子的選擇性識別，進(jìn)而可任選地用于排除這些離子以及人體內(nèi)其他離子的存在對汞離子的定量測定的干擾。

可選擇地，本發(fā)明方法所用用的汞離子熒光探針的穩(wěn)定性好，進(jìn)而能夠長期保存使用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法所使用的汞離子比色熒光探針是靈敏度極高的汞離子比色熒光探針，且合成簡單，有利于商業(yè)化的推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1是探針(5μM)加入Hg²⁺(10μM)前后的熒光光譜。

圖2a是不同濃度Hg²⁺(0-0.8μM)對探針(5μM)熒光光譜的影響；圖2b是不同濃度Hg²⁺(0-10μM)對探針(10μM)吸收光譜的影響。

圖3a和圖3b是Hg²⁺(5μM)和其它不同離子分析物(50μM)對探針(5μM)的熒光強(qiáng)度的影響，其中：a.探針，b.汞離子，c.鋁離子，d.銅離子，e.鎂離子，f.鉀離子，h.鋅離子，i.鎳離子，j.鈉離子，k.亞硝酸根離子，l.碳酸氫根離子，m.硫酸根離子，n.碳酸根離子，o.氯離子，p.硝酸根離子，q.氟離子。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明提供了本發(fā)明方法所使用的快速高選擇性汞離子熒光探針的合成路線、方法及其光譜性能。

本發(fā)明方法所使用的汞離子比色熒光探針是一類熒光素類化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)通式

上式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆和R₇為氫原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆和R₇可以相同或不同。

該類汞離子比色熒光熒光探針的合成路線和方法如下：

具體地，本發(fā)明的比色熒光探針可以通過如下方法制備，將一定摩爾比(例1:1.5-1:3)的熒光素類化合物(例如羅丹明B雜化的熒光素)與硫代氯甲酸苯酯于二氯甲烷中，二者的摩爾比為(1:2)然后常溫?cái)嚢枰欢螘r間(例如6h)，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，旋干后加入少量二氯甲烷將其溶解，過柱后得到產(chǎn)物，如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其用二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。

因此，本發(fā)明還提供了硫代氯甲酸苯酯在制備用于檢測汞離子的比色熒光探針中的用途。

本發(fā)明還提供了熒光素類化合物(例如羅丹明B雜化的熒光素)在制備用于檢測汞離子的比色熒光探針中的用途。

本發(fā)明的快速高選擇性高靈敏識別汞離子比色熒光探針的顯著特征是能夠快速高選擇性靈敏識別汞離子以及在其他離子的存在下能夠準(zhǔn)確對汞離子進(jìn)行定量分析。

下面將通過借助以下實(shí)施例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1

(方案1)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入337mg(2mmol)硫代氯甲酸苯酯常溫?cái)嚢?h，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，得到粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其在二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)中進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅色純凈產(chǎn)品364mg，產(chǎn)率為64％。

(方案2)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加入252.7mg(1.5mmol)硫代氯甲酸苯酯常溫?cái)嚢?h，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，得到粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其在二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)中進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅色純凈產(chǎn)品297mg，產(chǎn)率為52％。

(方案3)將387mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于15mL二氯甲烷中，再加421.3mg(2.5mmol)硫代氯甲酸苯酯常溫?cái)嚢?h，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，得到粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其在二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)中進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅色純凈產(chǎn)品483mg，產(chǎn)率為85％。

(方案4)將500mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素溶于20mL二氯甲烷中，再加入505.5mg(3mmol)硫代氯甲酸苯酯常溫?cái)嚢?h，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，得到粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其在二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)中進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅色純凈產(chǎn)品503mg，產(chǎn)率為89％。

(方案5)將500mg(1mmol)羅丹明B雜化的熒光素和173mg(1mmol)溶于15mL二氯甲烷中，再加入421.3mg(2.5mmol)硫代氯甲酸苯酯常溫?cái)嚢?0h，然后利用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸，得到粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將其在二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v,1:5)中進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅色純凈產(chǎn)品497mg，產(chǎn)率為88％。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(*10^-6):1.20(t,J＝6Hz,6H),3.36-3.45(m,4H),6.39-6.49(m,2H),6.59-6.62(m,1H),6.86-6.91(m,2H),7.22-7.29(m,3H),7.32-7.38(m,1H),7.49(t,J＝8Hz,2H),7.63-7.73(m,3H),8.05(d,J＝8Hz,1H).

實(shí)施例2

圖1是探針(5μM)加入Hg²⁺(10μM)前后的熒光光譜。由圖可以清晰地看到，汞離子的加入導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

實(shí)施例3

圖2a是不同濃度Hg²⁺(0-0.8μM)對探針(5μM)熒光光譜的影響；圖2b是不同濃度Hg²⁺(0-10μM)對探針(10μM)紫外吸收光譜的影響。

由圖2a可以看出，伴隨著探針溶液中Hg²⁺濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在(0-0.8μM)Hg²⁺濃度范圍內(nèi)，Hg²⁺的濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。這證明借助于該熒光探針能夠?qū)g²⁺進(jìn)行定量分析，且具有較高的靈敏度。我國飲用水標(biāo)準(zhǔn)中Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)限值為0.001mg/L因此，本發(fā)明的探針能較精確地確定待測樣本中Hg²⁺的含量。此外，隨著Hg²⁺濃度的增加，吸收光譜也隨之逐漸增強(qiáng)，這表明利用該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對汞離子的比色法測定。

實(shí)施例4

圖3是Hg²⁺(5μM)和其它不同離子分析物(50μM)對探針(5μM)的熒光強(qiáng)度的影響。分析物包括：濃度均為50μM鋁離子、銅離子、鎂離子、鉀離子、鋅離子、鎳離子、鈉離子、亞硝酸根離子、碳酸氫根離子、硫酸根離子、碳酸根離子、氯離子、硝酸根離子、氟離子，以及濃度為5μM的汞離子。所有測試條件是在純水中完成，所使用的探針是實(shí)施例1中所制備的探針，且所有光譜都是在25℃下分析物加入后測得的。具體地，移取50μL的1mM探針儲備液放進(jìn)10mL比色管中，然后加入5mL純水和0.5mL的pH＝7.4的PBS緩沖溶液,用純水定容至10mL，再移取50μL上述10mM分析物儲備液加入比色管內(nèi)，搖勻，30min后測定。結(jié)果如圖3所示。

從圖3a可以看出，生物體內(nèi)存在的其它常見離子不會對探針有明顯的響應(yīng)；從圖3b可以看出，生物體內(nèi)存在的其它常見離子不會明顯干擾探針對汞離子的測定，因此探針具有良好的選擇性。

雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。