本發(fā)明涉及熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芘類熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光光譜檢測技術(shù)由于無損檢測，靈敏度高，特異性強，響應(yīng)時間快等優(yōu)點越來越受人們的關(guān)注。熒光成像具有高的時空分辨率，操作簡便，成為實時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的重要手段。

CN^-，HSO₃^-，pH在工業(yè)過程，日常生活及生理過程中起著十分重要的作用。亞硫酸鹽廣泛應(yīng)用于我們的日常生活中，如在許多食品，飲料和醫(yī)藥產(chǎn)品作為防腐劑和添加劑。然而，當(dāng)亞硫酸鹽含量在人體內(nèi)異常時，很可能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，包括呼吸困難、喘息、蕁麻疹、胃腸道不適等。氰化物被廣泛應(yīng)用于許多工業(yè)中過程中，包括金礦的開采、電鍍、冶金、樹脂工業(yè)。但是氰化物具有強毒性，可以引起人嘔吐、抽搐、意識喪失甚至死亡，而且還造成環(huán)境的污染。細(xì)胞內(nèi)pH對于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)吞作用、酶活性、離子運輸?shù)冗^程起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞內(nèi)pH值的變化可能會導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙和嚴(yán)重的疾病。如異常的pH值會導(dǎo)致心肺功能和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷問題(如癌癥和阿爾茨海默癥)。因此，設(shè)計合成靈敏，選擇性高的熒光探針用于檢測CN^-，HSO₃^-，pH是十分必要的，這對于了解生理和病理進(jìn)程以及環(huán)境保護(hù)有著十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種芘類熒光探針及其制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速、定量檢測CN^-，HSO₃^-，pH的熒光檢測方法，而且這種探針具有良好的靈敏度、選擇性。

本發(fā)明提供的一種芘類熒光探針，是1-(芘-1-基)-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙烯酮,其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供的一種芘類熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

在容器中按摩爾比5:7加入乙酰芘的乙醇溶液和2,6-二氯吡啶-3-甲醛的乙醇溶液，再加入質(zhì)量濃度10％的氫氧化鈉水溶液，在常溫下利用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)完全后過濾，點板確定產(chǎn)物純凈后，自然晾干3h后放入真空干燥箱干燥2h，得到橙黃色產(chǎn)物。

其合成路線如下：

本發(fā)明提供了一種定量熒光檢測H⁺的方法，其特征在于，步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的芘類熒光探針儲備液；

(2)將2ml蒸餾水和30μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，460nm處的熒光強度逐漸減弱，420nm處的熒光增強；

(3)用蒸餾水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，將2ml蒸餾水和30μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行pH滴定實驗；以pH為橫坐標(biāo)，相對熒光強度I_420nm/I_460nm為縱坐標(biāo)繪制圖并進(jìn)行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝3.76；通過線性擬合得到最佳線性響應(yīng)范圍為pH 3.10-4.66，回歸方程為：I_420nm/I_460nm＝3.39-0.64*pH，線性系數(shù)為R²＝0.9819。

穩(wěn)定性實驗證明熒光探針對H⁺測定具有良好的光穩(wěn)定性。

經(jīng)實驗驗證，其它金屬陽離子不干擾體系對H⁺的測定。

本發(fā)明提供了一種定量熒光檢測OH^-的方法，其特征在于，步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的芘類熒光探針儲備液；

(2)將2ml蒸餾水和30μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱；

(3)用蒸餾水配制0.01M，0.1M，1M的OH^-溶液，將2ml蒸餾水和30μL熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行pH滴定實驗；以pH為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖并進(jìn)行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝9.65；通過線性擬合得到最佳線性響應(yīng)范圍為pH9.41-12.18，回歸方程為：F₀-F＝116.02*pH–529.13，線性系數(shù)為R²＝0.9955。

穩(wěn)定性實驗證明熒光探針對OH^-的測定具有良好的光穩(wěn)定性。

經(jīng)實驗驗證，其它金屬陽離子不干擾體系對OH^-的測定。

本發(fā)明提供了一種定量熒光檢測CN^-的方法，其特征在于，步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的芘類熒光探針儲備液；

(2)將2ml PBS緩沖液(pH＝10.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱；

(3)用蒸餾水配制的0.01M CN^-溶液，將2ml PBS緩沖液(pH＝10.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行滴定實驗；以CN^-濃度為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到CN^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：F₀-F＝12.40+132.60*c,c的單位為10^-6mol/L；通過線性擬合得到探針的最佳響應(yīng)范圍為：0–2.0μM，線性系數(shù)為R²＝0.9802。

經(jīng)實驗驗證，其它陰離子不干擾體系對CN^-的測定。

本發(fā)明提供了一種定量熒光檢測HSO₃^-的方法，其特征在于，步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的芘類熒光探針儲備液；

(2)將2ml PBS緩沖液(pH＝6.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱；

(3)用蒸餾水配制的0.001M HSO₃^-溶液，將2ml PBS緩沖液(pH＝6.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行滴定實驗；以HSO₃^-濃度為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到HSO₃^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：F₀-F＝15.90+927.71c,c的單位為10^-6mol/L；通過線性擬合得到探針的最佳響應(yīng)范圍為：0-0.5μM，線性系數(shù)為R²＝0.9903。

經(jīng)實驗驗證，其它陰離子不干擾體系對HSO₃^-的測定。

本發(fā)明的探針具有很好的細(xì)胞膜滲透性，可用于細(xì)胞內(nèi)pH，HSO₃^-的檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明作為選擇性檢測pH，CN^-，HSO₃^-的熒光探針有如下優(yōu)點：1、本探針制備方法簡單、快速；2、本發(fā)明的四種熒光檢測方法，分別對H⁺，OH^-，CN^-，HSO₃^-顯示了高的靈敏度，選擇性；3、檢測手段簡單，只需借助熒光光譜儀；4、本發(fā)明熒光探針可用于細(xì)胞及大腸桿菌熒光成像。

附圖說明：

圖1實施例2芘類熒光探針的H⁺滴定熒光圖

圖2實施例3芘類熒光探針對H⁺響應(yīng)的的工作曲線

圖3實施例4芘類熒光探針對H⁺識別時其他金屬陽離子的熒光柱狀圖

圖4實施例5H⁺的細(xì)胞成像圖

圖5實施例6芘類熒光探針的OH^-滴定熒光圖

圖6實施例7芘類熒光探針對OH^-響應(yīng)的的工作曲線

圖7實施例8芘類熒光探針對OH^-識別時其他金屬陽離子的熒光柱狀圖

圖8實施例9OH^-的細(xì)菌成像圖

圖9實施例10芘類熒光探針的CN^-滴定熒光圖

圖10實施例11芘類熒光探針對CN^-響應(yīng)的的工作曲線

圖11實施例12芘類熒光探針對CN^-識別時其他陰離子的熒光柱狀圖

圖12實施例13芘類熒光探針的HSO₃^-滴定熒光圖

圖13實施例14芘類熒光探針對HSO₃^-響應(yīng)的的工作曲線

圖14實施例15芘類熒光探針對HSO₃^-識別時其他陰離子干擾的熒光柱狀圖

圖15實施例16HSO₃^-的細(xì)胞成像圖

具體實施方式

以下實施例中的芘類熒光探針儲備液即為用DMSO溶液體系配制的1mM的芘類熒光探針儲備液。

實施例1芘類熒光探針的制備，步驟如下：

取0.61g(2.5mmol)乙酰芘用60mL無水乙醇溶解在一個250mL的雙口燒瓶中(可適當(dāng)加熱加速溶解)，再加入用20mL無水乙醇溶解的0.63g(3.5mmol)的2,6-二氯吡啶-3-甲醛溶液，隨后加入3mL10％的氫氧化鈉水溶液，在常溫下用磁力攪拌器攪拌20h。反應(yīng)結(jié)束后過濾，點板確定產(chǎn)物純凈后，自然晾干3h后放入真空干燥箱干燥2h，得到橙黃色產(chǎn)物0.89g,產(chǎn)率88.6％。

熒光探針用NMR表征，結(jié)果如下：

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：8.803～8.788(d,1H,J＝9.0Hz),8.728～8.714(d,1H,J＝8.4Hz),8.636～8.623(d,1H,J＝7.8Hz),8.467～8.429(m,3H),8.396～8.380(d,2H,J＝9.6Hz),8.325～8.310(d,1H,J＝9.0Hz),8.201～8.176(t,1H,J＝7.5Hz),8.075～8.048(d,1H,J＝16.2Hz),7.874～8.848(d,1H,J＝16.2Hz),7.762～7.748(d,1H,J＝8.4Hz).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：193.44,150.47,149.82,140.88,136.96,133.97,132.50,132.07,131.14,130.51,130.20,130.07,129.53,129.15,127.95,127.74,127.40,127.19,126.81,124.88,124.83,124.49,123.92.

實施例2芘類熒光探針的H⁺滴定熒光圖

在2ml蒸餾水中加入30μL芘類熒光探針儲備液進(jìn)行H⁺熒光滴定實驗，在熒光分光光度儀上檢測。隨著待測樣的加入，460nm處的熒光強度減弱，420nm處的熒光逐漸增強。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為:λ_ex為365nm和最大熒光發(fā)射波長為:λ_em為460nm。

實施例3芘類熒光探針對H⁺響應(yīng)的的工作曲線

用蒸餾水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，將2ml蒸餾水和30μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行滴定實驗(pH變化范圍7.30-1.95)；以pH為橫坐標(biāo)，相對熒光強度I_420nm/I_460nm為縱坐標(biāo)繪制圖并進(jìn)行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝3.76；通過線性擬合得到最佳線性響應(yīng)范圍為pH 3.10-4.66，回歸方程為：I_420nm/I_460nm＝3.39-0.64*pH，線性系數(shù)為R²＝0.9819。

實施例4芘類熒光探針對H⁺識別時其他金屬陽離子的熒光柱狀圖

在pH 7.30和pH 3.00的蒸餾水中加入30μL芘類熒光探針儲備液，再加入其它的金屬陽離子分別測其熒光光譜，繪制不同金屬陽離子對應(yīng)的相對熒光強度I_420nm/I_460nm的柱狀圖，見圖3。圖3中物質(zhì)的順序和濃度分別為：1.空白；2.K⁺(25mM)；3.Na⁺(25mM)；4.Ca²⁺(2mM)；5.Zn²⁺(2mM)；6.Mg²⁺(2mM)；7.Al³⁺(0.2mM)；8.Co²⁺(0.2mM)；9.Cr³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.1mM)；11.Ni²⁺(0.1mM)；12.Cu²⁺(0.1mM)；13.Hg²⁺(0.1mM)；14.Mn²⁺(0.1mM)；15.Bi³⁺(0.1mM)；16.Fe²⁺(0.1mM)；17.Fe³⁺(0.1mM)。

經(jīng)實驗證明，其它金屬陽離子不干擾體系對H⁺的檢測。

實施例5H⁺細(xì)胞成像圖

分別在pH＝7.40,5.00,3.00條件下取30μL芘類熒光探針儲備液加入含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于37℃的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育15min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)輕輕清洗三次，以除去培養(yǎng)基中過量的未進(jìn)入細(xì)胞的探針儲備液。將細(xì)胞固定后在ZEISS LSM-880激光共聚焦顯微鏡下，通過線性掃描進(jìn)行熒光成像。用波長為405nm的激光激發(fā)，收集發(fā)射波段為400-440nm的藍(lán)色熒光和450-550nm的綠色熒光。如圖4，探針在共聚焦熒光成像儀下顯示強的綠色熒光，隨著pH的減弱，綠色熒光逐漸減弱，藍(lán)色熒光逐漸增強。

實施例6芘類熒光探針的OH^-滴定熒光圖

在2ml蒸餾水中加入30μL芘類熒光探針儲備液進(jìn)行OH^-熒光滴定實驗，在熒光分光光度儀上檢測。隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為:λ_ex為365nm和最大熒光發(fā)射波長為:λ_em為463nm。

實施例7芘類熒光探針對OH^-響應(yīng)的的工作曲線

用蒸餾水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，將2ml蒸餾水和30μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，進(jìn)行滴定實驗(pH變化范圍7.30–12.79)；以pH為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖并進(jìn)行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝9.65；通過線性擬合得到最佳線性響應(yīng)范圍為pH 9.41-12.18，回歸方程為：F₀-F＝116.02*pH–529.13，線性系數(shù)為R²＝0.9955。

實施例8芘類熒光探針對OH^-識別時其他金屬陽離子的熒光柱狀圖

在pH 7.30和pH 8.00的蒸餾水中加入30μL芘類熒光探針儲備液，再加入其它的金屬陽離子分別測其熒光光譜，繪制不同金屬陽離子對應(yīng)463nm的熒光強度的柱狀圖，見圖7。圖7中物質(zhì)的順序和濃度分別為：1.空白；2.K⁺(25mM)；3.Na⁺(25mM)；4.Ca²⁺(2mM)；5.Zn²⁺(2mM)；6.Mg²⁺(2mM)；7.Al³⁺(0.2mM)；8.Co²⁺(0.2mM)；9.Cr³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.1mM)；11.Ni²⁺(0.1mM)；12.Cu²⁺(0.1mM)；13.Hg²⁺(0.1mM)；14.Mn²⁺(0.1mM)；15.Bi³⁺(0.1mM)；16.Fe²⁺(0.1mM)；17.Fe³⁺(0.1mM)。

經(jīng)實驗證明，其它金屬陽離子不干擾體系對OH^-的檢測。

實施例9OH^-細(xì)菌成像圖

將接種好的大腸桿菌(E.coli)與30μL芘類熒光探針儲備液分別在pH 7.30,pH 9.00,pH11.0，pH 12.00的條件下于搖床中共同孵育2h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。固定激發(fā)波長為405nm,收集發(fā)射波段為450-550nm的綠色熒光。隨著pH的增強，綠色熒光逐漸減弱。

實施例10芘類熒光探針的CN^-滴定熒光圖

在2ml PBS緩沖液(pH＝10.0)中加入20μL芘類熒光探針儲備液進(jìn)行CN^-熒光滴定實驗，在熒光分光光度儀上檢測。隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為:λ_ex為365nm和最大熒光發(fā)射波長為:λ_em為463nm。

實施例11芘類熒光探針對CN^-響應(yīng)的的工作曲線

用蒸餾水配制0.01M的CN^-溶液，將2ml PBS緩沖液(pH＝10.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，逐次加入CN^-進(jìn)行熒光滴定實驗，共加入199μM；以CN^-濃度為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到CN^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：F₀-F＝12.40+132.60*c，c的單位為10^-6mol/L；通過線性擬合得到探針的最佳響應(yīng)范圍為：0–2.0μM，線性系數(shù)為R²＝0.9802。

實施例12芘類熒光探針對CN^-識別時其他陰離子的熒光柱狀圖

在比色皿中加入2ml PBS緩沖液(pH＝10.0)和20μL芘類熒光探針儲備液，再加入其它的陰離子(F^-，Br^-，Cl^-，I^-，NO₃^-，SO₄^2-，SCN^-，CO₃^2-，HCO₃^-，HS^-，SO₃^2-，ACO^-，HSO₃^-，S^2-)使其最終濃度為0.1mM，再加入CN^-，使其最終濃度為25μM，分別測其熒光光譜，繪制不同陰離子對應(yīng)463nm的熒光強度柱狀圖。

經(jīng)實驗證明，其它陰離子不干擾體系對CN^-的檢測。

實施例13芘類熒光探針的HSO₃^-滴定熒光圖

在2ml PBS緩沖液(pH＝6.0)中加入20μL芘類熒光探針儲備液進(jìn)行HSO₃^-熒光滴定實驗，在熒光分光光度儀上檢測。隨著待測樣的加入，463nm處的熒光強度逐漸減弱。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為:λ_ex為365nm和最大熒光發(fā)射波長為:λ_em為463nm。

實施例14芘類熒光探針對HSO₃^-響應(yīng)的的工作曲線

用蒸餾水配制0.001M的HSO₃^-溶液，將2ml PBS緩沖液(pH＝6.0)和20μL芘類熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，逐次加入HSO₃^-進(jìn)行熒光滴定實驗，共加入40μM。以HSO₃^-濃度為橫坐標(biāo)，相對熒光強度F₀-F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到HSO₃^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：F₀-F＝15.90+927.71*c,c的單位為10^-6mol/L；通過線性擬合得到探針的最佳響應(yīng)范圍為：0-0.5μM，線性系數(shù)為R²＝0.9903。

實施例15芘類熒光探針對HSO₃^-識別時其他陰離子的熒光柱狀圖

在比色皿中加入2ml PBS緩沖液(pH＝6.00)和20μL芘類熒光探針儲備液，再加入HSO₃^-，使其最終濃度為2μM，然后加入其它的陰離子(F^-，Br^-，Cl^-，I^-，NO₃^-，SO₄^2-，SCN^-，CO₃^2-，HCO₃^-，HS^-，SO₃^2-，ACO^-，CN^-，S^2-)使其最終濃度為0.1mM，分別測其熒光光譜，繪制不同陰離子對應(yīng)463nm的熒光強度柱狀圖。

經(jīng)實驗證明，其它陰離子不干擾體系對HSO₃^-的檢測。

實施例16HSO₃^-細(xì)胞成像圖

在pH＝6.00條件下取30μL芘類熒光探針儲備液加入含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于37℃的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育15min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.40)輕輕清洗三次，以除去培養(yǎng)基中過量的未進(jìn)入細(xì)胞的探針儲備液。將細(xì)胞固定后在ZEISS LSM-880激光共聚焦顯微鏡下，通過線性掃描進(jìn)行熒光成像。用波長為405nm的激光激發(fā)，收集發(fā)射波段為450-550nm的綠色熒光。如圖15，探針在共聚焦熒光成像儀下顯示強的綠色熒光，隨即加入10μM的HSO₃^-，綠色熒光減弱。