本發(fā)明屬于熒光分析應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析方法。

背景技術(shù)：

高靈敏度高特異性的DNA檢測(cè)技術(shù)在疾病診斷、藥物開(kāi)發(fā)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面得到了廣泛的應(yīng)用，近年來(lái)，DNA檢測(cè)技術(shù)趨于微型化與簡(jiǎn)便化，靈敏度、特異性、檢測(cè)速率的提高，成本的降低以及更簡(jiǎn)便的過(guò)程控制是目前DNA檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。與早期的DNA檢測(cè)技術(shù)如比色法、凝膠電泳、紫外光譜等檢測(cè)方法相比，采用熒光法的DNA傳感器由于其高靈敏度、低成本及便攜性等特點(diǎn)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

文獻(xiàn)1(李宏業(yè)，范樹(shù)國(guó)、劉玉樂(lè)、陳剛、王寰宇，改良聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)DNA，細(xì)胞生物學(xué)雜志，1999,21,201-202。)利用改良的聚丙烯酰胺凝膠電泳法，用30％丙烯酰胺，10×TBE，TEMED，10％過(guò)硫酸銨配制成10mL的3.5％凝膠，灌膠后采用15V/cm的電壓梯度電泳，利用銀染法對(duì)擬南芥基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物及其克隆于pGEM7Z上的重組質(zhì)粒限制酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，DNA片段得到很好的分離，條帶顯示清晰。目前，這種聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)于DNA的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成熟，然而此法需要制膠、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，電泳、染色等一系列的過(guò)程，消耗時(shí)間長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，染料毒性大，銀染的DNA片段不能直接回收純化，且無(wú)法用于痕量及突變DNA的檢測(cè)，因此具有很大的局限性。

文獻(xiàn)2(Fernando Patolsky,Yossi Weizmann,Itamar Willner.Redox-Active Nucleic-Acid Replica for the Amplified Bioelectrocatalytic Detection of Viral DNA.JACS.2002,124,770-772.)將短鏈DNA探針固定于金電極表面，其與待測(cè)的環(huán)狀M13病毒DNA部分雜交，在聚合酶的作用下，以長(zhǎng)鏈上未雜交部分的DNA作為母鏈進(jìn)行DNA復(fù)制，復(fù)制原料中的dUTP標(biāo)記有電活性物質(zhì)羧酸二茂鐵，從而得到具有二茂鐵標(biāo)記的寡聚核苷酸修飾電極，在電極上引入電信號(hào)。為了獲得放大的檢測(cè)信號(hào)，用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化來(lái)加速電子傳遞。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定峰電流的變化，達(dá)到特異性的檢測(cè)M13病毒DNA的目的。目前，利用二茂鐵的電活性來(lái)對(duì)DNA進(jìn) 行檢測(cè)的方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，然而電化學(xué)法背景噪音大，重現(xiàn)性差，且難以用于單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，此法中所用的DNA雜交探針的雜交效率相對(duì)肽核酸、嗎啉寡核苷酸等探針較低，不適用于堿基錯(cuò)配的DNA檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了檢測(cè)痕量的DNA片段，包括完全互補(bǔ)、單堿基錯(cuò)配、三堿基錯(cuò)配和對(duì)照序列，提供了一種高靈敏度高選擇性DNA熒光分析方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析方法，包括如下步驟：

步驟一、將鏈霉親和素磁珠(SA-MB)懸浮在PBS緩沖液中，加入3’端修飾生物素的嗎啉寡核苷酸探針(MO)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，并用PBS緩沖液清洗多次；

步驟二、加入待測(cè)DNA片段溶液，雜交反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，并用Tris-HCl緩沖液清洗多次；

步驟三、加入ZrOCl₂溶液，配位反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，并用60wt％乙醇清洗多次；步驟四、加入1-芘丁酸(PBA)溶液，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，并用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)清洗多次；

步驟五、再加入金絲桃素(Hyp)溶液，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離,并用二甲基亞砜(DMSO)清洗多次，最后復(fù)懸在DMSO中測(cè)紫外和熒光光譜。

步驟一中，所述的鏈霉親和素磁珠的濃度為0.1～1.0mg/mL，嗎啉寡核苷酸的濃度為0.5～1.5μM，序列為5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’，反應(yīng)時(shí)間為40～80min。

步驟二中，所述的待測(cè)DNA片段溶液的溶劑為TE緩沖液，DNA濃度為1nM～100nM，DNA片段選用序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的完全互補(bǔ)的DNA片段，序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’的單堿基錯(cuò)配的DNA片段，序列為5’-TGA GGT ATT AGA TTG TGT GGT T-3’的三堿基錯(cuò)配的DNA片段或序列為5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’的對(duì)照DNA片段，反應(yīng)時(shí)間為40～80min。

步驟三中，所述的ZrOCl₂溶液的溶劑為60wt％乙醇，Zr⁴⁺的濃度為4mM，反應(yīng)時(shí)間 為20～40min。

步驟四中，所述的PBA溶液的溶劑為N,N-二甲基甲酰胺，PBA濃度為2mM，反應(yīng)時(shí)間為20～40min。

步驟五中，所述的Hyp溶液的溶劑為二甲基亞砜，Hyp濃度為0.1～0.3mM，反應(yīng)時(shí)間為10～80min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：

1、以磁性微球?yàn)檩d體并通過(guò)熒光光譜分析的方法能更有效地實(shí)現(xiàn)DNA高靈敏檢測(cè)，且背景噪聲小、成本低、方法簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短。

2、以嗎啉寡核苷酸作為捕獲探針，選擇性及特異性高，能有效區(qū)分目標(biāo)DNA與單堿基錯(cuò)配、三堿基錯(cuò)配及對(duì)照DNA片段。

3、利用過(guò)渡金屬離子的配位作用及芳香環(huán)之間的π-π堆積作用引入熒光探針，方法簡(jiǎn)便，熒光探針結(jié)合效果好。

4、檢測(cè)靈敏度高，對(duì)于目標(biāo)DNA(tDNA)濃度在1nM～100nM的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度具有很好的線性響應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析過(guò)程示意圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中的紫外和熒光光譜表征圖(其中，a為紫外可見(jiàn)光譜，b為熒光光譜)。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中Hyp與PBA之間π-π堆積作用時(shí)間優(yōu)化圖(其中，a為熒光光譜的變化，b為峰值的變化)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中含水量對(duì)π-π堆積作用的影響結(jié)果圖(其中，a為熒光光譜的比較，b為峰值的比較)。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例4中的對(duì)不同濃度tDNA片段的檢測(cè)特性圖(其中，a為熒光光譜的比較，b為峰值的比較)。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例5中的對(duì)不同序列DNA片段的檢測(cè)特性圖(其中，a為熒光光譜的比較，b為峰值的比較)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，其目的是為更好理解本發(fā)明的內(nèi) 容，但所舉的實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍：

實(shí)施例1：通過(guò)鋯離子的配位作用及Hyp與PBA之間的π-π堆積作用在SA-MB表面引入熒光探針的紫外和熒光光譜表征。

采用本發(fā)明所述的基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析，將0.5mg/mL的SA-MB懸浮在PBS緩沖液中，加入1μM的3’端修飾生物素的MO，序列為5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’，反應(yīng)60min后進(jìn)行磁分離并用PBS緩沖液清洗多次，再加入100nM的tDNA(溶于TE緩沖液)，序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’，雜交60min后進(jìn)行磁分離并用Tris-HCl緩沖液清洗多次，再加入4mM的ZrOCl₂·8H₂O溶液(溶于60％乙醇)，配位反應(yīng)30min后進(jìn)行磁分離并用60％乙醇清洗多次，再加入2mM的PBA溶液(溶于N,N-二甲基甲酰胺，DMF)，反應(yīng)30min后進(jìn)行磁分離并用DMF清洗多次，再加入0.2mM的Hyp溶液(溶于二甲基亞砜，DMSO)，反應(yīng)90min后進(jìn)行磁分離并用DMSO清洗多次，最后復(fù)懸在DMSO中測(cè)紫外和熒光光譜。熒光激光波長(zhǎng)為554nm。紫外和熒光光譜的結(jié)果如附圖2所示，其中，a是紫外可見(jiàn)光譜，b是554nm激發(fā)下的發(fā)射光譜及604nm發(fā)射波長(zhǎng)下的激發(fā)光譜，由圖可見(jiàn)，Hyp成功連接到DNA骨架上，且該熒光分析方法具有可行性及高效性。

實(shí)施例2：Hyp與PBA之間π-π堆積作用的時(shí)間優(yōu)化。

采用本發(fā)明所述的基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析，操作步驟如同上述實(shí)施例1。其中，選用100nM序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的tDNA片段作為目標(biāo)分析物，改變?chǔ)?π堆積作用時(shí)間依次為10、20、30、40、50、60、70、80min，分析反應(yīng)時(shí)間對(duì)本發(fā)明DNA熒光分析結(jié)果的影響，其分析結(jié)果如附圖3所示，其中，a為熒光光譜的變化，b為峰值的變化，由圖可知，π-π堆積作用時(shí)間為10、20、30、40、50min時(shí)，隨著時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而在反應(yīng)50min之后，隨著時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度維持穩(wěn)定，因此在之后的檢測(cè)過(guò)程中，選用50min作為適宜的π-π堆積作用時(shí)間。

實(shí)施例3：含水量對(duì)π-π堆積作用的影響。

采用本發(fā)明所述的基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析，操作步驟如同上述實(shí)施例1。其中，選用100nM序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’ 的tDNA片段作為目標(biāo)分析物，改變?chǔ)?π堆積反應(yīng)中水的含量依次為0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，分析含水量對(duì)π-π堆積作用的影響，其分析結(jié)果如附圖4所示，其中，a為熒光光譜的比較，b為峰值的比較，由圖可知，隨著含水量的增加，熒光強(qiáng)度顯著降低，含水量超過(guò)80％后，熒光強(qiáng)度幾乎降為零，因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，需保持π-π堆積反應(yīng)在無(wú)水環(huán)境下。

實(shí)施例4：基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析對(duì)不用濃度tDNA片段的熒光響應(yīng)特性。

采用本發(fā)明所述的基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析，操作步驟如同上述實(shí)施例1。其中，選用序列為5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的tDNA片段作為目標(biāo)分析物，濃度分別為1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100nM，分析對(duì)不同濃度tDNA片段的熒光響應(yīng)特性，分析結(jié)果如附圖5所示，由圖可知，在該檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨著tDNA濃度的增加而增加，具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)極限為2.2nM，熒光響應(yīng)特性較好且靈敏度較高。

實(shí)施例5：基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析對(duì)不用序列DNA片段的熒光響應(yīng)特性。

采用本發(fā)明所述的基于Hyp與PBA之間π-π堆積作用的DNA熒光分析，操作步驟如同上述實(shí)施例1。其中，以完全互補(bǔ)(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)、單堿基錯(cuò)配(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’)、三堿基錯(cuò)配(5’-TGA GGT ATT AGATTG TGT GGT T-3’)、對(duì)照(5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’)的DNA片段作為目標(biāo)分析物，對(duì)不同序列DNA片段進(jìn)行熒光分析，分析結(jié)果如附圖6所示，由圖可知，本發(fā)明的DNA熒光分析方法可以有效區(qū)分單核苷酸多態(tài)性，具有高特異性和選擇性。