本發(fā)明涉及生化分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種聚肽的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：聚陰離子聚肽的鹽溶液(如鈉鹽、鉀鹽等)極性強(qiáng)、水溶性好，用傳統(tǒng)的C18色譜填料分離分析保留時(shí)間短，很難將其與雜蛋白或核酸等雜質(zhì)分開。電泳檢測(cè)只能定性，不能定量。高效快速地檢測(cè)發(fā)酵和純化過程中聚肽含量不僅能提高篩選聚肽高產(chǎn)菌株和純化的效率，并且對(duì)發(fā)酵和純化條件的優(yōu)化、工藝控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立有著非常重要的意義。目前常用于測(cè)定發(fā)酵或純化過程中聚肽含量的方法通常為水解法，將聚肽水解為對(duì)應(yīng)的單個(gè)氨基酸，測(cè)定水解前后對(duì)應(yīng)氨基酸含量之差，水解前后樣品中氨基酸的含量可通過生物傳感分析儀如L-谷氨酸氧化酶電極或HPLC等方法測(cè)定(施慶珊，等：一株不需谷氨酸的產(chǎn)聚γ-谷氨酸菌株的篩選與鑒定；孟杰，等：酶法快速檢測(cè)發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸濃度)，也有用凝膠色譜測(cè)定γ-PGA含量的(YaoJ，etal.RemovalofCr(III)，Ni(II)andCu(II)bypoly(γ-glutamicacid)fromBacillussubtilisNX-2[J].)。張慶慶等在《發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量快速測(cè)定方法研究》中用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液與γ-PGA反應(yīng)產(chǎn)生渾濁的特性，通過反應(yīng)體系的吸光度來反映其濁度，進(jìn)而通過濁度與γ-PGA濃度的線性關(guān)系，測(cè)定發(fā)酵液中γ-PGA?，F(xiàn)有技術(shù)中的水解法過程繁瑣、水解程度對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大；凝膠色譜法是根據(jù)分子量大小不同保留時(shí)間不同來檢測(cè)的，由于大分子相近分子量的物質(zhì)較多，凝膠色譜本身的分辨率有限，所以也存在較大的誤差；而CTAB法中的CTAB很容易與雜蛋白反應(yīng)產(chǎn)生渾濁，進(jìn)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，很有必要建立一種聚肽快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)上的不足，提供了一種聚肽的快速檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種聚肽的快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：(1)樣品溶液的配制：取發(fā)酵液或發(fā)酵菌體破碎液或純化中間過程溶液適量，過0.22μm濾膜；(2)樣品的測(cè)定：采用高效液相離子交換色譜法，以10-30mM的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液或K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液作為洗脫液A，調(diào)pH至7.5-8.5，以洗脫液A為溶劑配制1-3M的NaCl溶液或KCl鹽溶液為洗脫液B；所述離子交換色譜條件為：填料QSepharoseTMFF裝填于空管柱或使用預(yù)裝柱；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.1-2mL/min；洗脫方式：0-10min，100％A等度洗脫；10-25min，洗脫液A:洗脫液B為(85-95):(15-5)；25-45min，洗脫液A:洗脫液B為(75-85):(25-15)；45-60min，洗脫液A:洗脫液B為(60-75):(25-40)；60-80min，100％B等度洗脫，之后通過雙波長紫外檢測(cè)器檢測(cè)；(3)含量分析。本發(fā)明聚肽的快速檢測(cè)方法中含量分析為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行聚肽的含量計(jì)算；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為稱取聚肽標(biāo)準(zhǔn)品，溶于洗脫液A中，配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成一定濃度梯度的稀釋液，過0.22μm濾膜，分別進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x/mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明所述的離子交換空管柱或預(yù)裝柱內(nèi)徑為2-20mm，長度為20-100mm，總體積為1-25mL。本發(fā)明所述的雙波長檢測(cè)，其中一個(gè)檢測(cè)通道波長設(shè)置為205-230nm，用于檢測(cè)不含苯環(huán)的蛋白類物質(zhì)(包括聚肽)，另一個(gè)檢測(cè)通道波長設(shè)置為250-280nm，用于檢測(cè)核酸類和含苯環(huán)的蛋白類物質(zhì)。本發(fā)明所述的聚肽可為鹽型陰離子聚肽；所述鹽型陰離子聚肽包括α-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸以及由谷氨酸和天冬氨酸所形成的聚肽的鹽。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述聚肽為α-聚谷氨酸。本發(fā)明采用離子交換色譜檢測(cè)聚肽類物質(zhì)，并將其應(yīng)用于HPLC檢測(cè)平臺(tái)，不但使聚肽能與其他雜蛋白和大部分核酸等雜質(zhì)很好地分離，而且采用雙波長可以同時(shí)檢測(cè)聚肽和核酸，將核酸的影響去除，樣品用量少，只需5-20μL，具有較好的線性范圍、重復(fù)性和加樣回收率，較低的檢測(cè)限。本發(fā)明操作簡單，靈敏度高，能快速檢測(cè)樣品中的聚肽。附圖說明圖1是峰面積-質(zhì)量濃度曲線；圖2是α-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜；圖3是α-聚谷氨酸發(fā)酵菌體破碎液離子交換檢測(cè)色譜圖；圖4是α-聚谷氨酸的MALDI-TOF-MS圖譜；圖5是α-聚谷氨酸初步純化離子交換檢測(cè)色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，實(shí)施例不能理解為是對(duì)技術(shù)解決方案的限制。實(shí)施例1:標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.1色譜檢測(cè)條件儀器：島津高效液相色譜儀色譜柱：4.6*50mm，QSepharoseTMFF陰離子交換填料檢測(cè)波長：210nm，260nm洗脫液A：20mMNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH為8.0洗脫液B：2MNaCl溶液(用20mMNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液作為溶劑配制)流速：0.3mL/min進(jìn)樣量：10μL柱溫：25℃洗脫程序如表1所示：表1洗脫程序1.2線性范圍精密稱取α-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg于50mL容量瓶中，加水溶解并定容配制成儲(chǔ)備液，精密量取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，配制成濃度梯度為0.0243mg/mL，0.0729mg/mL，0.2187mg/mL，0.6561mg/mL，1.3122mg/mL，1.9683mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x/mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得α-聚谷氨酸回歸方程為y＝(4E+07)x+21643，R＝0.9998，說明α-聚谷氨酸在0.0243-1.9683mg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，如圖1所示。1.3重復(fù)性試驗(yàn)精密吸取同一供試溶液如線性關(guān)系考察中濃度為0.6561mg/mL的溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7％，表明重復(fù)性良好，具體數(shù)值如表2所示。表2重復(fù)性試驗(yàn)序號(hào)峰面積125091631224958976324781012424764583524897895625198588RSD(％)0.71.4加樣回收率試驗(yàn)取已知α-聚谷氨酸含量的發(fā)酵菌體破碎液樣品6份，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.50mL，搖勻，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，在1.1所述的色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜圖。計(jì)算α-聚谷氨酸的回收率，回收率如表3所示。表3α-聚谷氨酸的回收率1.5檢出限考察精密量取1.1542mg/mL的α-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加水稀釋成0.11542mg/mL，0.011542mg/mL，0.005771mg/mL的樣品溶液，各精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，其進(jìn)樣量和信噪比如表4所示。表4進(jìn)樣量和信噪比進(jìn)樣量(μg)信噪比(S/N)1.154275.30.01154211.80.057712.7結(jié)果表明：當(dāng)進(jìn)樣量為0.05771μg時(shí)，信噪比為2.7，故檢測(cè)限為0.05771.實(shí)施例2：發(fā)酵菌體破碎液中α-聚谷氨酸的含量測(cè)定取發(fā)酵菌體破碎液適量，0.22μm濾膜過濾，精密量取10μL，按實(shí)施例1中1.1所述的色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣3次，用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算α-聚谷氨酸的含量，并在檢測(cè)過程收集α-聚谷氨酸所對(duì)應(yīng)的峰，富集的樣品做MALDI-TOF-MS測(cè)試，如圖4，顯示分子均一性好，純度高，其含量具體值如表5所示。表5發(fā)酵菌體破碎液中α-聚谷氨酸的含量測(cè)定實(shí)施例3：初步純化樣品中α-聚谷氨酸的含量測(cè)定取初步純化樣品適量0.22μm濾膜過濾，精密量取10μL，按實(shí)施例1中的色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣3次，用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算α-聚谷氨酸的含量，如圖5所示，其含量具體值如表6所示。表6初步純化樣品中α-聚谷氨酸的含量測(cè)定以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干修飾和改進(jìn)，這些修飾和改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3