本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及基于抗體與質(zhì)譜技術(shù)用于對生物樣品中蛋白質(zhì)分析的試劑盒制備方法。
背景技術(shù)：
：不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用抗體和質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。免疫質(zhì)譜(IMS)的概念是利用磁珠等將血清樣本中的相關(guān)蛋白質(zhì)固定在磁珠表面的特異性抗體上，通過洗提液獲取目的蛋白質(zhì)并點(diǎn)樣于鋼芯片上，由蛋白指紋圖譜儀(質(zhì)譜儀)以圖譜形式讀取鋼芯片上的樣本所含蛋白信息(許洋，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(2)：134-142)。傳統(tǒng)用于蛋白質(zhì)檢測試劑盒及制備方法為ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)。ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測定法，因而無法直接鑒定抗原的變異。舉例講，β2微球蛋白的檢測試劑盒制備方法為先將抗β2微球蛋白抗體(第一個抗體)結(jié)合至固相表面(如玻璃)，然后將含β2微球蛋白的樣品(如血清)，加至這個已標(biāo)有抗β2微球蛋白抗體的容器中；這樣，β2微球蛋白就會結(jié)合至抗體上，然后洗脫未結(jié)合的物質(zhì)。再加上已標(biāo)有酶、放射性或化學(xué)發(fā)光性的抗β2微球蛋白抗體(第二個抗體)，這樣就可以檢測出β2微球蛋白的總含量。這種方法學(xué)的缺點(diǎn)是無法測出β2微球蛋白的變異(如β2微球蛋白的N或C端丟失了一個或數(shù)個氨基酸，β2微球蛋白被甲基，酰基等修飾，β2微球蛋白的異構(gòu)體)。即通常被用于傳統(tǒng)檢測β2微球蛋白試驗(yàn)是檢測所謂的總β2微球蛋白，而不是β2微球蛋白變異或β2微球蛋白亞單位等濃度。傳統(tǒng)β2微球蛋白檢測試劑盒無法同時檢測差別性的β2微球蛋白異構(gòu)體。目前在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時還缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、優(yōu)化的免疫質(zhì)譜試劑盒。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的變異的或修飾的蛋白質(zhì)無法被檢測出，這對于腫瘤患者的預(yù)后評估則缺乏有效的早期監(jiān)測手段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：科學(xué)上把含有6.02×1023個微粒的集體作為一個單位，叫摩爾或摩。摩爾是表示物質(zhì)的量(符號是n)的單位，簡稱為摩，單位符號是mole(mol)。1mol的碳原子含6.02×1023個碳原子，質(zhì)量為12g。1mol的硫原子含6.02×1023個硫原子，質(zhì)量為32g，同理，1摩任何原子的質(zhì)量都是以克為單位，數(shù)值上等于該種原子的相對原子質(zhì)量。同樣我們可以推算出，1摩任何物質(zhì)的質(zhì)量，都是以克為單位，數(shù)值上等于該種物質(zhì)的分子量。水的分子量是18，1mol的質(zhì)量為18g，含6.02×1023個水分子。通常把1mol物質(zhì)的質(zhì)量，叫做該物質(zhì)的摩爾質(zhì)量(符號是M)，摩爾質(zhì)量的單位是克/摩(符號是“g/mol”)例如，水的摩爾質(zhì)量為18g/mol，寫成M(H2O)＝18g/mol。等質(zhì)量(或重量)的不同的原子或分子，其摩任數(shù)不同；如12g的碳原子和12g的硫原子的摩任數(shù)不同。等摩任的不同的原子或分子，其數(shù)量相同；如1mol的碳原子和1mol的硫原子的原子數(shù)量相同，均為6.02×1023個原子。本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測七種、變異的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基標(biāo)志物)的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法，該試劑盒為腫瘤早期轉(zhuǎn)移檢測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明的免疫質(zhì)譜試劑盒(蛋白指紋法)采用磁珠-多種已知等摩爾抗體組(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的抗體)特異性結(jié)合血清中的、變異的疾病相關(guān)標(biāo)志物(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基)；用等摩爾抗體組(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的抗體)標(biāo)記的磁珠用比等重量或等量(如等μg)抗體組(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的抗體)標(biāo)記的磁珠更好。等摩爾抗體的結(jié)合蛋白質(zhì)或抗原的位點(diǎn)是一致的或相等的；而等重量(如等μg)抗體，由于每種或每個抗體的重量不同，故等重量抗體(如每種抗體糖基化的量不同、故重量不同)結(jié)合蛋白質(zhì)或抗原的位點(diǎn)數(shù)不一定相等的，造成結(jié)合力不均勻?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)標(biāo)志物的變異、修飾是常見腫瘤早期轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物(許洋，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(2)：134-142)。故本試劑盒適用于常見腫瘤轉(zhuǎn)移的早期輔助診斷、預(yù)測預(yù)后和追蹤腫瘤的復(fù)發(fā)。本發(fā)明提出的一種實(shí)時、痕量、修飾性標(biāo)志物的免疫質(zhì)譜試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：一小管含質(zhì)控品，含七種等摩爾、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，10～30μl；一小管含等摩爾標(biāo)記的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體的磁珠30～50μl；一小管粘合液300～500μl，該粘合液為50～100mMPBS，pH值為7.0～7.4；一小管清洗液10～50μl，該清洗液為dH2O溶液；一小管洗提液10～50μl，該洗提液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管穩(wěn)定劑(能量吸收分子飽和溶液)5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4～8℃冷藏盒中。本發(fā)明提出的上述試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：1)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的制備：將男性、女性等量的O型血清(漿)稀釋在緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，并將該稀釋的血清(漿)分裝成10～30μl小管中；加入等摩爾七種變異的蛋白質(zhì)：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基；2)制備含七種等摩爾標(biāo)記的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體的磁珠：將轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的FC-III雙環(huán)肽(DCAWHLGELVWCT)-磁珠30～50μl標(biāo)記上等摩爾的抗體；3)將購買的50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值為7.0～7.4緩沖液、1～5％三氟乙酸的洗脫液分別分裝成300～500μl小管和10～50μl小管；4)將能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成5～10μl小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4～8℃冷藏箱中。本發(fā)明還提出所述的試劑盒對實(shí)時、痕量、修飾性標(biāo)志物的免疫質(zhì)譜試劑盒的應(yīng)用。表二、所述的檢測試劑盒對常見腫瘤早期轉(zhuǎn)移的判斷為：標(biāo)志物峰值(m/z±Da)信噪比轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白13761±1＞10載脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10轉(zhuǎn)鐵蛋白75000±7＞10補(bǔ)體C3a8938±1＞10纖維蛋白肽A1465±1＞10載脂蛋白C亞基6600±1＞10注：上述100例含變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基升高的不同腫瘤類型、早期轉(zhuǎn)移的腫瘤患者的血清及尿液，信噪比＞10代表陽性。所述試劑盒依據(jù)上述幾個特征蛋白峰，雙盲測試含變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基(從上述分子量可以確認(rèn)為變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C)樣品的敏感性100％，特異性100％。本試劑盒檢測變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟包括：1.將生物樣品先用粘合液稀釋30～50倍，將樣品充分混勻；2.將上述標(biāo)本50～100μl加至已裝好磁珠-FC-III雙環(huán)肽-抗體(等摩爾轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基等抗體)的PCR管中，置磁性處理器上，15～25℃孵育20～40分鐘，除去液體；3.加10～50μl清洗液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育1～5分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次；4.加10μl洗提液1～5分鐘，洗提標(biāo)本至上清液；5.取5μl上清液移至另一個PCR管中，加入5μl穩(wěn)定劑充分混勻；6.取1μl混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片；7.將上述金屬片加入質(zhì)譜儀中，就會生成質(zhì)譜圖；8.外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性，所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實(shí)驗(yàn)誤差。上述的生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來檢測的，該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.001％，可以精確鑒定蛋白質(zhì)的一個氨基酸的變異范圍。本發(fā)明專利中，抗體提取物質(zhì)是新型的抗體純化物質(zhì)，F(xiàn)c-III雙環(huán)肽(氨基酸結(jié)構(gòu)為DCAWHLGELVWCT)，其創(chuàng)新點(diǎn)為Fc-III雙環(huán)肽在空間位置中的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)比ProteinA、ProteinG小，從而減少干擾、可以重新捕獲因ProteinA、ProteinG體積大而沒有被捕獲的目標(biāo)標(biāo)志物(即用ProteinA、ProteinG系統(tǒng)檢測陰性的免疫質(zhì)譜法實(shí)驗(yàn)，采用Fc-III雙環(huán)肽的系統(tǒng)，可能會檢測陽性，從而解決假陰性問題)；特異性與結(jié)合抗體的Fc位點(diǎn)的結(jié)合力比ProteinG高，親和常數(shù)可達(dá)nM級(ShanFeng，etal.，DevelopmentoftheFc-IIITaggedProteinExpressionSystemforProteinPurificationandDetection，PLoSONE2012；7(8)：e44208)。舉例說明，F(xiàn)c-III雙環(huán)肽，可選擇性或特異性結(jié)合抗體的Fc位點(diǎn)，洗去未吸附的抗體，可制作Fc-III雙環(huán)肽-抗體或抗體復(fù)合物。任何適宜的洗液均可使用。質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對等摩爾轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體捕獲分子檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的相對摩爾數(shù)量(由于質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清或血漿中加入等摩爾、七種、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基)；而七種物質(zhì)：變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的摩爾數(shù)是已知的；故可用質(zhì)譜相對信號的強(qiáng)度計算出樣本中變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基相對摩爾數(shù)量，并顯示飛行時間和確定被檢測的、變異的每個轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的分子量。實(shí)施例1中可以看到摩爾數(shù)量標(biāo)記的方法比用等重量標(biāo)記的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體來捕獲樣本中、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基分子更精確。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的信號強(qiáng)度、信噪比和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關(guān)的每個峰值的高度、信噪比，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。本發(fā)明中使用的、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基是等摩爾特異性抗體所捕獲。這些變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。利用C8及C18疏水基質(zhì)、WCX基質(zhì)、或IMAC磁珠(或芯片)及用血液(血清、血漿)、尿液樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。利用本發(fā)明的分析方法，通過臨床雙盲對比分析(371例正常人群、367例無轉(zhuǎn)移腫瘤患者、302例早期腫瘤轉(zhuǎn)移患者)，吻合率在91-95％，故上述蛋白質(zhì)標(biāo)志物的變異、修飾是常見腫瘤早期轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，可應(yīng)用于實(shí)時、痕量、修飾性標(biāo)志物的免疫質(zhì)譜檢測。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的試劑盒用于臨床質(zhì)譜的檢測方法?？梢詸z測多個蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及質(zhì)譜多肽蛋白圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(diǎn)：(1)精確質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便所用Fc-III雙環(huán)肽-抗體或抗體復(fù)合物的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。(3)準(zhǔn)確本發(fā)明采用了等摩爾抗體標(biāo)記-質(zhì)譜分析一次性、同時檢測差別性的七種、變異的蛋白質(zhì)的相對摩爾數(shù)量：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基；比等重量抗體標(biāo)記-質(zhì)譜分析更準(zhǔn)確。具體實(shí)施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1本發(fā)明提出的免疫質(zhì)譜試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：一小管含質(zhì)控品，含七種等摩爾、變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，10～30μl；一小管含等摩爾標(biāo)記的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體的磁珠30～50μl；一小管粘合液300～500μl，該緩沖液為50～100mMPBS，pH值為7.0～7.4；一小管清洗液10～50μl，該清洗液為dH2O溶液；一小管洗提液10～50μl，該洗提液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管穩(wěn)定劑(能量吸收分子飽和溶液)5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4～8℃冷藏盒中。本發(fā)明提出的上述試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：1)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的制備：將男性、女性等量的O型血清(漿)稀釋在緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，并將該稀釋的血清(漿)分裝成10～30μl小管中；加入等摩爾七種變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基；2)制備含七種等摩爾轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體的磁珠：將轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的FC-III雙環(huán)肽(DCAWHLGELVWCT)-磁珠30～50μl標(biāo)記上等摩爾的抗體；3)將購買的50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值為7.0～7.4緩沖液、1～5％三氟乙酸的洗脫液分別分裝成300～500μl小管和10～50μl小管；4)將能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成5～10μl小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4～8℃冷藏箱中。重復(fù)性表一、取樣本進(jìn)行重復(fù)檢測三次，檢測相關(guān)蛋白標(biāo)志物蛋白峰，結(jié)果一致：標(biāo)志物峰值(m/z±Da)信噪比轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白13761±1＞10載脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10轉(zhuǎn)鐵蛋白75000±7＞10補(bǔ)體C3a8938±1＞10纖維蛋白肽A1465±1＞10載脂蛋白C亞基6600±1＞10注：上述樣本為標(biāo)準(zhǔn)品血清及尿液：含七種變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C標(biāo)準(zhǔn)品；信噪比＞10代表陽性。所述試劑盒依據(jù)上述幾個特征蛋白峰，雙盲測試含變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基(從上述分子量可以確認(rèn)為變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C)樣品的敏感性100％，特異性100％。采用本發(fā)明方法制備的試劑盒的應(yīng)用及效果說明如下：一、材料1.標(biāo)本來源：A.100例正常人對照組的血清及尿液；B.100例含變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基升高的不同腫瘤類型、早期轉(zhuǎn)移的腫瘤患者的血清及尿液；C.標(biāo)準(zhǔn)品血清及尿液：含七種變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C標(biāo)準(zhǔn)品。2.質(zhì)量控制：A.人標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控：每次測試前，用上述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。3.磁珠表面含已標(biāo)記的等摩爾抗體：抗轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基。將Fc-III雙環(huán)肽用Carbodiimide方法標(biāo)記在磁珠上(見GunnDL，etal.JImmunolMethods.1：381-389，1972)；具有吸附劑功能的Fc-III雙環(huán)肽與抗體置磁性處理器上，22℃孵育30分鐘，除去液體。加100μl緩沖液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。二、方法1.樣品的收集：全血采集后吸取血清及尿液，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清及尿液樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備：每個吸附劑支持物點(diǎn)需要血清及尿液1μl，將血清及尿液用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測：上樣，將上述標(biāo)本50～100μl加至已裝好磁珠-Fc-III雙環(huán)肽-抗體的PCR管中，置磁性處理器上，22℃孵育30分鐘，除去液體。加50～100μl緩沖液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體；加清洗液重復(fù)上述操作兩次。加10μl洗提液2分鐘，洗提標(biāo)本至上清液。取5μl上清液移至另一個PCR管中，加入5μl能量吸收分子飽和溶充分混勻，取1μl混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片。所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實(shí)驗(yàn)誤差。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會生成飛行時間質(zhì)譜圖。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性當(dāng)磁珠含已標(biāo)記的等摩爾抗體：抗轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基抗體，用統(tǒng)計學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，所述試劑盒依據(jù)上述幾個特征蛋白峰，雙盲測試含變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、或纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基樣品的敏感性100％，特異性100％。當(dāng)磁珠含已標(biāo)記的等重量抗體(如等量1-5μg)：抗-轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、抗-載脂蛋白A、抗-β2微球蛋白、抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗-補(bǔ)體C3a、抗-纖維蛋白肽A、抗-載脂蛋白C亞基時，分析血清蛋白指紋峰，所述試劑盒依據(jù)上述幾個特征蛋白峰，雙盲測試含變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基樣品的敏感性90％，特異性90％。故等摩爾抗體組(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的抗體)標(biāo)記的磁珠比等重量或等量(如等μg)抗體組(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基的抗體)標(biāo)記的磁珠更好。表二、所述的檢測試劑盒對常見腫瘤早期轉(zhuǎn)移的判斷為：標(biāo)志物峰值(m/z±Da)信噪比轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白13761±1＞10載脂蛋白A28078±3＞10β2微球蛋白11731±1＞10轉(zhuǎn)鐵蛋白75000±7＞10補(bǔ)體C3a8938±1＞10纖維蛋白肽A1465±1＞10載脂蛋白C亞基6600±1＞10注：上述100例含變異的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基升高的不同腫瘤類型、早期轉(zhuǎn)移的腫瘤患者的血清及尿液，信噪比＞10代表陽性。所述試劑盒依據(jù)上述幾個特征蛋白峰，雙盲測試含變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、纖維蛋白肽A、載脂蛋白C亞基(從上述分子量可以確認(rèn)為變異的、修飾的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、載脂蛋白A、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3a、或纖維蛋白肽A、載脂蛋白C)樣品的敏感性100％，特異性100％。靈敏度檢測150fmol的牛G型免疫球蛋白(IgG)，信噪比大于1000∶1。特異性表三、檢測100份陰性血清樣本，100％樣本結(jié)果符合下表要求：標(biāo)志物峰值(m/z±Da)信噪比轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白13761±1＜5載脂蛋白A28078±3＜5β2微球蛋白11731±1＜5轉(zhuǎn)鐵蛋白75000±7＜5補(bǔ)體C3a8938±1＜5纖維蛋白肽A1465±1＜5載脂蛋白C亞基6600±1＜5利用C8及C18疏水基質(zhì)、WCX基質(zhì)、或IMAC磁珠(或芯片)及用血液(血清、血漿)、尿液樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。利用本發(fā)明的分析方法，通過臨床雙盲對比分析(371例正常人群、367例無轉(zhuǎn)移腫瘤患者、302例早期腫瘤轉(zhuǎn)移患者)，吻合率在91-95％，故上述蛋白質(zhì)標(biāo)志物的變異、修飾是常見腫瘤早期轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，可應(yīng)用于實(shí)時、痕量、修飾性標(biāo)志物的免疫質(zhì)譜檢測。在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式應(yīng)當(dāng)同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3