硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水或沉積物中硝基呋喃類化合物的超高效液相色譜-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。該方法包括下述的步驟：衍生：取水樣，加入濃鹽酸和衍生試劑于30-45℃水浴振蕩；提?。赫{(diào)pH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取兩次；濃縮：45-55℃氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至1ml，濾膜過濾，上機(jī)測定。本發(fā)明的有益效果在于，采用本發(fā)明的方法對水或沉積物中硝基呋喃類化合物進(jìn)行檢測，靈敏度高，衍生反應(yīng)時(shí)間短，為國家制定相關(guān)的環(huán)境監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考和依據(jù)。
【專利說明】硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水或沉積物中硝基呋喃類藥物代謝物的超高效液相色譜-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測方法。
[0002]【背景技術(shù)】
隨著人民物質(zhì)生活水平提高，對食品安全關(guān)注也越來越多。然而，目前食品安全問題不容樂觀，特別是動(dòng)物源性食品安全問題，已成為全球性議題。獸藥的殘留是導(dǎo)致食品安全性下降的一個(gè)主要原因。獸藥(Veterinary Drugs)是指用于預(yù)防、治療和診斷禽畜等動(dòng)物疾病，有目的地調(diào)節(jié)其生理機(jī)能并規(guī)定作用、用途、用法、用量的物質(zhì)(含飼料藥物添加劑)，包括血清制品、疫苗、診斷制品、微生態(tài)制品、中藥材、中成藥、化學(xué)藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲劑、消毒劑等。獸藥在保障動(dòng)物健康、動(dòng)物疾病預(yù)防和治療以及促進(jìn)動(dòng)物生長等方面發(fā)揮著重要作用。養(yǎng)殖業(yè)中使用獸用藥物具有幾個(gè)方面的好處:保障動(dòng)物健康、提高動(dòng)物生產(chǎn)力；降低動(dòng)物的發(fā)病率和致死率；同時(shí)為人類提供了大量營養(yǎng)豐富的產(chǎn)品。因此，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，獸藥及其添加劑被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但是，獸藥的大量使用所帶來的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)成為了目前一項(xiàng)新型的研究課題。獸藥的種類眾多，除抗生素和抗寄生蟲藥物外，還有抗霉劑、抗氧化劑和抗病毒劑和激素等不同類型的化學(xué)藥物，如抗生素類，殺寄生蟲類，抗真菌類、抗水產(chǎn)病害類，激素類，生長劑類。
[0003]抗生素是世界上應(yīng)用范圍最廣、用量最大的一類獸用藥物，同時(shí)也是我國獸藥品種中極其重要并且用量較大的一類藥物。硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。該類藥物被廣泛用作飼料添加劑來預(yù)防和治療由沙門菌和埃希桿菌引起的豬、牛及家禽的胃腸道疾病。研究表明，呋喃唑酮可能導(dǎo)致基因變異而具有遺傳毒性；盡管呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的藥理毒性數(shù)據(jù)不如呋喃唑酮充分，但出于食品安全的考慮，歐盟從1997年I月I日起，禁止在動(dòng)物飼料中添加任何硝基呋喃類抗生素。我國也于2002年頒布了“食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單”，呋喃唑酮、呋喃它酮列在禁用清單上。由于有些農(nóng)戶片面追求經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，目前非法使用屢有發(fā)生，如2006年國內(nèi)影響較大的多寶魚、桂花魚中檢出硝基呋喃事件。
[0004]近年來，我國發(fā)生多起因硝基呋喃類藥物殘留超標(biāo)的出口貿(mào)易事件。2005年和2006年日本曾在我國出口的烤鰻魚中檢測出3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone, Α0Ζ)超標(biāo)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2010年5月24日，日本厚生勞動(dòng)省醫(yī)藥食品局食品安全部監(jiān)視安全課發(fā)布食安輸發(fā)0524第I號:加強(qiáng)對中國產(chǎn)蜆貝及其加工品中呋喃唑酮的監(jiān)控檢查。隨后，韓國食品醫(yī)藥安全廳稱，從出口到韓國的中國產(chǎn)冷凍蜆肉湯里檢出Α0Ζ，并決定在確定中國產(chǎn)冷凍蜆肉湯安全之前停止該產(chǎn)品進(jìn)口以及在韓國市場銷售。2011年3月22日我國出口韓國的炭燒雞肉串中檢出5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)，含量為2.3 μ g/kg。2011年3月和4月日本連續(xù)兩次從我國某省出口的養(yǎng)殖活鰻魚和蒲燒鰻魚中檢出呋喃唑酮。2011年8月I日，日本厚生勞動(dòng)省發(fā)布的食安輸發(fā)0801第I號通知，厚生省在監(jiān)控監(jiān)控檢查出中國產(chǎn)養(yǎng)殖活雜色鮑中含有呋喃唑酮。2011年9月14日歐盟從我國的冷凍對蝦中檢出硝基呋喃，含量為1.62 μ g/kg。由此可見，在食用性動(dòng)物中使用硝基呋喃類藥物的現(xiàn)象仍然存在，我國對其的監(jiān)督和管理力度需進(jìn)一步加強(qiáng)。
[0005]目前還沒有相對完善的硝基呋喃類藥物在水和沉積物中的檢測分析方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。全球?qū)λ鼈兾廴緺顩r調(diào)查研究工作也剛剛展開，而我國在這方面的工作基礎(chǔ)更加薄弱，起步也更晚，因此更加急需通過建立高靈敏度的檢測技術(shù)，大規(guī)模開展其在不同流域中的污染水平調(diào)查，研究其在環(huán)境中的污染水平，進(jìn)行環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評估，更好地服務(wù)于我國環(huán)境管理工作。鑒于此，本文研究了硝基呋喃類藥物的檢測方法，為國家制定相關(guān)的環(huán)境監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考和依據(jù)。
硝基呋喃類抗生素在動(dòng)物體內(nèi)代謝快，半衰期短。血漿、尿不能用于呋喃類代謝物檢測，一般選用禽肉、雞蛋、肝臟等動(dòng)物性食品為檢測對象，原藥代謝后以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康目煞譃橄趸秽x物總量和結(jié)合態(tài)代謝物檢測。ConneelyA等測定結(jié)合態(tài)呋喃唑酮代謝物時(shí)樣品先用甲醇、水、乙醇、乙醚洗滌，以除去游離態(tài)代謝物。結(jié)合態(tài)代謝物只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下才能釋放出來，硝基呋喃檢測中常用稀鹽酸溶液解離結(jié)合態(tài)代謝物。4種硝基呋喃代謝物分子質(zhì)量均在75g/ mol?201g/mol，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定時(shí)必須進(jìn)行衍生化，衍生化是為了增加分子質(zhì)量，使化合物不在高噪音背景下，增加特征碎片離子的選擇性提高質(zhì)譜響應(yīng)。常采用22硝基苯甲醛(22NBA)衍生化氨基增加代謝物的離子化效率，水解后生成硝基苯衍生物，衍生化一般在37 °C過夜進(jìn)行，親核基團(tuán)R2NH2酸性催化環(huán)境很快游離出來與22NBA碳?；l(fā)生化學(xué)作用。Mottier P等在雞肉中添加5 μ g/ kg硝基呋喃代謝物進(jìn)行衍生化時(shí)發(fā)現(xiàn)12氨基222內(nèi)酰腺(AHD)和氨基脲(SEM)最穩(wěn)定，而32氨基222唑烷基酮(AOZ)和52甲基嗎啉232氨基222唑烷基酮(AMOZ)損失40%。Leitner A等等采用不同衍生化試劑對代謝物衍生化效率及穩(wěn)定性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，22NBA是呋喃類代謝物最有效的衍生化試劑，衍生化效率大于70%。李耀平等建立在親核加成反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上，采用新衍生劑22氯苯甲醛衍生硝基呋喃代謝物，提高了靈敏度，縮短了衍生反應(yīng)時(shí)間。
[0006]呋喃類液液萃取一般是在pH6?7水溶液與乙酸乙酯進(jìn)行兩相分配，在液液萃取操作過程中，樣品溶液的PH對萃取效率有很大的影響，丁濤等試驗(yàn)不同pH對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)pH為7?7.5時(shí)，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高，分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。液液萃取易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，特別對含高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品，需要加入冗長的去乳步驟，延長了試驗(yàn)操作時(shí)間。
[0007]為了更有效地凈化動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類代謝物，常采用陰離子交換混合機(jī)理柱(MAX)、聚苯乙烯2 二乙烯苯柱(LiChrolut EN)和親水2親脂平衡料固相萃取柱(HLB)凈化樣品，利用pH7時(shí)分子間π 2π作用力保留硝基芳香化合物，有機(jī)溶劑如乙酸乙酯或甲醇破壞這種作用力而洗脫被測物，ConneelyA等分別試驗(yàn)了溶液pH為3、6和10時(shí)HLB小柱凈化時(shí)的回收率，數(shù)據(jù)表明pH6時(shí)HLB柱回收率最高。林黎明等評價(jià)了 MAX與HLB串聯(lián)柱、LiChrolut EN柱、HLB柱凈化時(shí)的回收率，最后得出HLB柱與EN柱獲得相同的回收率。
[0008]呋喃類結(jié)構(gòu)化合物紫外吸收不明顯，因此在紫外檢測時(shí)靈敏度很低，不能滿足代謝物0.5 μ g/ kg限量要求；同時(shí)毛細(xì)管電泳和薄層色譜因其靈敏度低，在呋喃類代謝物檢測中應(yīng)用很少，其代謝物殘留檢測常用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法。
[0009]液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)利用了液相色譜較強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜檢測器豐富的結(jié)構(gòu)信息，為目標(biāo)化合物提供了可靠的定性和定量結(jié)果。由于硝基呋喃類藥物代謝物具有較低的離子化效率并缺少特征離子，22NBA衍生物增加了相對分子質(zhì)量，提高了離子化效率。歐盟EEC/ 657/ 2002指令規(guī)定對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)。在串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)，檢測I個(gè)母離子和2個(gè)子離子能達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求。液質(zhì)聯(lián)用測定呋喃類代謝物液相分離時(shí)流動(dòng)相中常用有機(jī)溶劑(甲醇，乙腈)與弱酸(甲酸，乙酸，甲酸銨，乙酸銨)的混合液。正離子時(shí)加入酸能促使目標(biāo)物的離子化，增強(qiáng)檢測靈敏度。目前液相色譜2串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用已用于測定動(dòng)物組織、牛奶、鯰魚等動(dòng)物性食品基質(zhì)中硝基呋喃類代謝物殘留量，檢出限在0.1 μ g/ kg?2yg/ kg ο
[0010]酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的技術(shù)，常作為篩選方法用于殘留分析中。該方法能快速、簡單地測定I種硝基呋喃代謝物殘留，靈敏度取決于制備抗體的選擇性。Vass M等采用ELISA快速測定雞蛋中呋喃西林代謝物，樣品經(jīng)酸衍生化后酶聯(lián)免疫反應(yīng)，方法 EEC/ 657/ 2002 驗(yàn)證，檢出限(CCa)0.13 μ g/ kg,定量限(CC β ) 0.3 μ g/kg,回收率在77.8%?110%，陽性測定結(jié)果與液質(zhì)比較，表明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確；ChangC等采用ELISA測定可食性動(dòng)物組織呋喃唑酮代謝物時(shí)以苯甲醛作為衍生化試劑，生成苯AOZ的衍生物進(jìn)行檢測，回收率55.8%?99.6%。PimpitakU等采用ELISA測定蝦中ΑΜ0Ζ，檢出限為0.16 μ g/ kg ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水或沉積物中硝基呋喃類化合物的超高效液相色譜-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。
[0012]本發(fā)明水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法是通過下述的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，包括下述的步驟:
當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于水中時(shí)，其步驟如下:
衍生:取水樣，加入濃鹽酸和衍生試劑于30-45°C水浴振蕩；
提取:調(diào)PH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取兩次；
濃縮:45-55°C氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至1ml，濾膜過濾，上機(jī)測定；
當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于沉積物時(shí)，其步驟如下:
稱取樣品于離心管中，加鹽酸和衍生試劑，30-45°C水浴振蕩；
提取:調(diào)PH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取兩次；
濃縮:45-55°C氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至1ml，濾膜過濾，上機(jī)測定。
[0013]上述的衍生試劑為鄰苯二甲醛二甲亞砜溶液。
[0014]水或沉積物中硝基呋喃類化合物的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，
當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于水中時(shí)，其具體步驟如下:衍生:30ml水樣，加入0.8ml濃鹽酸和1.0ml衍生試劑37°C水浴振蕩16小時(shí)；提取:調(diào)ρΗ7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取兩次；
濃縮:50°C氮吹至干,用初始流動(dòng)相定容至Iml,過0.22um膜,上機(jī)測定。
[0015]水或沉積物中硝基呋喃類化合物的超高效液相色譜-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于沉積物時(shí)，其具體步驟如下:
稱取樣品1.0于離心管中，加 30ml 0.125mol/ml鹽酸和1.0ml衍生試劑，37°C水浴振蕩16小時(shí)；
提取:調(diào)PH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取兩次；
濃縮:50°C氮吹至干,用初始流動(dòng)相定容至Iml,過0.22um膜,上機(jī)測定。
[0016]上機(jī)測定的儀器條件如下:
HPLC 測定條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18 柱(L7um，2.1mmX 50mm; Waters)；柱溫:30°C，流動(dòng)相:硝基呋喃類藥物分析使用甲醇(A)和0.1%甲酸/水(V/V) (B)，流速0.4mL/min ;測定時(shí)采用的流動(dòng)相梯度如下表:
【權(quán)利要求】
1.水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，包括下述的步驟: 當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于水中時(shí)，其步驟如下: 衍生:取水樣，加入濃鹽酸和衍生試劑于30-45°C水浴振蕩； 提取:調(diào)PH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取兩次； 濃縮:45-55°C氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至1ml，濾膜過濾，上機(jī)測定； 當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于沉積物時(shí)，其步驟如下: 稱取樣品于離心管中，加鹽酸和衍生試劑，30-45°C水浴振蕩； 提取:調(diào)PH7.0-7.5，加乙酸乙酯萃取兩次； 濃縮:45-55°C氮吹至干，用初始流動(dòng)相定容至1ml，濾膜過濾，上機(jī)測定。
2.如權(quán)利要求1所述的水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，其特征在于:所述的衍生試劑為鄰苯二甲醛二甲亞砜溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，其特征在于， 當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于水中時(shí)，其具體步驟如下: 衍生:30ml水樣，加入0.8ml濃鹽酸和1.0ml衍生試劑37°C水浴振蕩16小時(shí)；提取:調(diào)ρΗ7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取兩次； 濃縮:50°C氮吹至干,用初始流動(dòng)相定容至Iml,過0.22um膜,上機(jī)測定。
4.如權(quán)利要求1所述的水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，其特征在于， 當(dāng)所檢測的硝基呋喃類化合物來源于沉積物時(shí)，其具體步驟如下: 稱取樣品1.0于離心管中，加 30ml 0.125mol/ml鹽酸和1.0ml衍生試劑，37°C水浴振蕩16小時(shí)； 提取:調(diào)PH7.0-7.5，加40ml乙酸乙酯萃取兩次； 濃縮:50°C氮吹至干,用初始流動(dòng)相定容至Iml,過0.22um膜,上機(jī)測定。
5.如權(quán)利要求1所述的水或沉積物中硝基呋喃類代謝物的超高效液相-三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，上機(jī)測定的儀器條件如下: HPLC 測定條件:色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18 柱(1.7um, 2.1mmX5Omm ; Waters)；柱溫:30°C，流動(dòng)相:硝基呋喃類藥物分析使用甲醇(A)和0.1%甲酸/水(V/V) (B)，流速.0.4mL/min ;測定時(shí)采用的流動(dòng)相梯度如下表:
【文檔編號】G01N30/02GK103698435SQ201310742726
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】趙永剛 申請人:江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心