利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，包括以下步驟：(1)取家蠶血淋巴進(jìn)行提取，獲得供試樣品溶液；(2)測(cè)定阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)分析數(shù)據(jù)；(3)按步驟(2)方法，取步驟(1)中的供試樣品溶液注入超快速液相色譜儀，進(jìn)行分離分析，并用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)物質(zhì)信號(hào)，獲得供試樣品的分析數(shù)據(jù)；(4)將步驟(3)獲得的供試樣品的分析數(shù)據(jù)與阿苯達(dá)唑及其代謝物的色譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，即可對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行快速定性、定量測(cè)定。
【專利說(shuō)明】利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及阿苯達(dá)唑及其代謝物的含量的測(cè)定方法，尤其涉及一種利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國(guó)是蠶桑的原產(chǎn)地，具有5 000多年的歷史，素有“東方絲國(guó)”的美稱。蠶絲及其絲綢制品是我國(guó)主要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品，其產(chǎn)銷量約占世界總量的70%，是我國(guó)唯一可壟斷世界貿(mào)易市場(chǎng)的出口商品。
[0003]蠶種生產(chǎn)是蠶桑產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。家蠶微粒子病是對(duì)蠶種生產(chǎn)具毀滅性的傳染性疫病，因其具有胚種傳染能力成為了世界產(chǎn)絲國(guó)的檢疫對(duì)象。近二十余年來(lái)，家蠶微粒子病在我國(guó)呈全國(guó)流行趨勢(shì)，淘汰超毒蠶種量達(dá)數(shù)百萬(wàn)張，經(jīng)濟(jì)損失慘重。藥物治療是目前家蠶微粒子病的最有效的防治手段之一。在家蠶微粒子病的藥物治療方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)展了大量研究，其中在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的是我所研制的多菌靈粉。為了獲得更高效、低毒的家蠶微粒子病治療藥物材料，我們經(jīng)篩選獲得了治療效果理想的藥物材料阿苯達(dá)唑(也稱丙硫苯咪唑)。
[0004]阿苯達(dá)唑(albendazole, ABZ)是苯并咪唑類藥物中驅(qū)蟲(chóng)譜較廣，殺蟲(chóng)作用最強(qiáng)的一種驅(qū)蟲(chóng)高效低毒藥物，已被廣泛應(yīng)用于人體醫(yī)學(xué)、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域。其在體內(nèi)代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲(chóng)對(duì)葡萄糖的吸收，導(dǎo)致蟲(chóng)體糖原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統(tǒng)，阻礙ATP產(chǎn)生，使寄生蟲(chóng)無(wú)法存活和繁殖。阿苯達(dá)唑在體內(nèi)迅速代謝為阿苯達(dá)唑亞砜(albendazole sulphoxide, ABZSO),其為主要代謝產(chǎn)物，也是藥效的主要活性成分；進(jìn)而轉(zhuǎn)化為阿苯達(dá)唑砜(albendazole sulphone, ABZSO2),最終生成阿苯達(dá)唑_2_氨基諷(albendazole amino sulphone, ABZSO2-NH2)。早在 20 世紀(jì) 80 年代初，國(guó)外已有對(duì)不同生物材料中阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量測(cè)定方法的研究報(bào)道，Alvinerie和Galtier(1984)利用正向高效液相色譜實(shí)現(xiàn)了綿羊血漿中阿苯達(dá)唑及其兩種代謝物的同時(shí)測(cè)定，但其未能檢測(cè)到ABZSO2-NH2,且使用的UV檢測(cè)器靈敏度較低，僅達(dá)十萬(wàn)分之一級(jí)別。同樣利用高效液相色譜，Lanchote等(1998)僅對(duì)ABZSO及其對(duì)應(yīng)體和ABZSO2做了檢測(cè)，所采用地?zé)晒鈾z測(cè)器的靈敏度比前者高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。到了 21世紀(jì)初，國(guó)內(nèi)外在人體醫(yī)學(xué)、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多領(lǐng)域?qū)Ω鞣N生物組織材料中丙硫咪唑或苯并咪唑類物質(zhì)測(cè)定方法的研究報(bào)道也逐漸豐富起來(lái)。如免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、氣-質(zhì)聯(lián)用法，液-質(zhì)聯(lián)用法等。Prochazkova等(2000)利用非水性的毛細(xì)管電泳法和普通的HPLC兩種方法對(duì)比測(cè)定人體血液中的阿苯達(dá)唑含量，發(fā)現(xiàn)二者的檢測(cè)效果相當(dāng)。Kitzman等(2002)利用C18固相萃取柱對(duì)含阿苯達(dá)唑的人體血樣在HPLC上機(jī)前進(jìn)行萃取，能有效祛除雜質(zhì)、排除干擾。Mottier等(2003)也利用固相萃取柱、反向HPLC技術(shù)同時(shí)對(duì)綿羊、牛等絳蟲(chóng)寄主體內(nèi)的苯并咪唑類藥物含量進(jìn)行了測(cè)定。Batzias和Delis (2004)利用反向液相色譜，熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)了對(duì)綿羊血漿阿苯達(dá)唑代謝物含量準(zhǔn)確測(cè)定。高效液相色譜法雖然應(yīng)用較為廣泛，但也存在明顯不足，樣品處理過(guò)程比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，易受雜質(zhì)干擾。最近幾年，隨著現(xiàn)代色譜技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了利用超高效液相、質(zhì)譜以及超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等測(cè)定生物組織中農(nóng)藥殘留的研究，很大程度地使得該方法在生物材料農(nóng)藥含量的測(cè)定上發(fā)揮了其針對(duì)性強(qiáng)，靈敏度高和檢測(cè)速率快的優(yōu)越性。然而，相對(duì)于人或畜禽動(dòng)物而言，家蠶體積較小，血淋巴采樣相對(duì)困難，而且取樣量受限制、藥物濃度低，加上無(wú)機(jī)鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、自身代謝物等內(nèi)源性物質(zhì)干擾，對(duì)家蠶組織材料的檢測(cè)提出更高要求，以上方法均不適用于家蠶組織中藥物的檢測(cè)。目前，尚未見(jiàn)針對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物含量同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定性、定量研究的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，該方法可以對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行同時(shí)快速定性、定量測(cè)定。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，包括以下步驟:
(1)取家蠶血淋巴進(jìn)行提取，獲得供試樣品溶液；
(2)配制一系列不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入超快速液相色譜儀，進(jìn)行分離分析，并用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)物質(zhì)離子信號(hào)，獲得阿苯達(dá)唑及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)分析數(shù)據(jù)；
(3)按步驟(2)方法，取步驟(1)中的供試樣品溶液注入超快速液相色譜儀，進(jìn)行分離分析，并用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)物質(zhì)信號(hào)，獲得供試樣品的分析數(shù)據(jù)； (4)將步驟(3)獲得的供試樣品的分析數(shù)據(jù)與阿苯達(dá)唑及其代謝物的色譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，即可對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定性和定量。
[0007]所述步驟(1)的具體操作為:取家蠶血淋巴在提取前進(jìn)行渦旋振蕩處理，在渦旋振蕩處理后，以乙腈和乙酸乙酯的混合液為提取液，按家蠶血淋巴與提取液體積比為1:5^1: 8進(jìn)行混合，渦旋振蕩:TlO min，然后通過(guò)離心分離上清液，對(duì)殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液，離心、膜濾，獲得供試樣品溶液。
[0008]本發(fā)明所述步驟⑵和(3)中超快速液相色譜儀的色譜條件為:色譜柱=AgilentZORBAX C18 (4.6X100 mm，3.0 u m);柱溫 40°C ;流動(dòng)相:乙腈:0.005 mol/L 甲酸(V:V) =80%: 20%~90%: 10%，等梯度洗脫；進(jìn)樣量 10 ii L ;流速 0.1000~0.2 000 mL/min。
[0009]本發(fā)明所述步驟⑵和(3)中三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)條件為:電離方式:ESI( + );多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式(MRM);霧化氣(NEB):6.00^8.00 psi，氣簾氣(CUR)
23.00~26.00 psi，碰撞氣(CAD):3.00~6.00 psi，離子化溫度(TEM):500.00~600.00。。，噴霧電壓(IS):5000.00^6000.00 V，射入電壓(EP):8.0(Tl2.00 V，碰撞室射出電壓(CXP):
8.00~12.00 V。
[0010]作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述步驟(2)的一系列不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為阿苯達(dá)唑及其代謝物濃度為5 iig/L、62.5 ii g/L、125 y g/L、250U g/L>625 y g/L和I 250 U g/L的阿苯達(dá)唑及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0011]本發(fā)明所述的分析數(shù)據(jù)包括阿苯達(dá)唑及其代謝物的保留時(shí)間、峰面積以及離子碎片質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果等。在所述步驟(2)中，以獲得的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)來(lái)繪制阿苯達(dá)唑及其代謝物相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到阿苯達(dá)唑及其代謝物相應(yīng)的回歸方程:ABZ:PAR=3.7242X 106C+3.4938X 104，R2=0.9927 ;ABZS0:PAR= 6.4613X 105C —
4.8495 X 103，R2 = 0.9905 ；ABZSO2:PAR=1.0269 X 106C+89.1365，R2=0.9972 ；ABZSO2-NH2:PAR=L 5396 X IO6C — 8.4586 X IO3, R2=0.9966。在所述步驟(4)中，比對(duì)供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和離子碎片質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定性，將阿苯達(dá)唑及其代謝物的峰面積數(shù)據(jù)代入各自相應(yīng)的回歸方程中以計(jì)算物質(zhì)含量，即可對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定量。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明采用超快速液相色譜分析樣品，8 min之內(nèi)即可完成一個(gè)供試品溶液分析；同時(shí)采用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜MRM監(jiān)測(cè)方式，選擇性好、靈敏度高，且能排除復(fù)雜本底中其它成分的干擾，避免了前處理帶來(lái)的誤差，兩者結(jié)合輕易實(shí)現(xiàn)了家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物的快速定性、定量檢測(cè)，且明顯優(yōu)于HPLC法及液相色譜-離子阱質(zhì)譜法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1-1是混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)中ABZ離子色譜圖；
圖1-2是2供試樣品(A')中ABZ離子色譜圖；
圖2-1是混合標(biāo)準(zhǔn)品(B)中ABZSO離子色譜圖；
圖2-2是供試樣品(B')中ABZSO離子色譜圖；
圖3-1是混合標(biāo)準(zhǔn)品 (C)中ABZSO2離子色譜圖；
圖3-2是供試樣品(C')中ABZSO2離子色譜圖；
圖4-1是混合標(biāo)準(zhǔn)品(D)中ABZSO2-NH2離子色譜圖；
圖4-2是供試樣品(D')中ABZSO2-NH2離子色譜圖；
圖5是混合標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)譜掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]材料和方法
1.1儀器和試劑
超快速液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UFLC-MS/MS)(日本島津、美國(guó)AB SCIEX公司)、超聲波清洗機(jī)(SB-5200 DT)，Mill1-Q超純水設(shè)備(美國(guó)Millipore公司)，Sigma 3k15離心機(jī)，電子分析天平，渦漩混合器(德國(guó)IKA公司)，0.22 Pm微孔PTFE濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，醫(yī)用一次性無(wú)菌注射器等。
[0015]ABZ (99.0%)和 ABZSO2 (98.3%)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自 Dr.Ehrenstorfer GmbH,Germany ;ABZSO (≤ 98%)和 ABZSO2-NH2 (98%)分別購(gòu)自 Sigma-Aldrich, USA 和 Alfa Aesar, USA。乙臆、甲醇等為色譜純，分別購(gòu)自Thermo Fisher Scientific和Oceanpak alexativechemical.，Ltd,其余試劑為分析純級(jí)別。
[0016]標(biāo)樣和供試樣品準(zhǔn)備1.2.1試驗(yàn)處理
試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)的試驗(yàn)區(qū)和I個(gè)空白區(qū)，每區(qū)250頭，五齡起蠶餉食喂食用2000 mg/L阿苯達(dá)唑溶液浸泡過(guò)的桑葉一次之后續(xù)以正常桑，空白區(qū)喂食正常桑。添食藥桑后2小時(shí)起，每次每區(qū)隨機(jī)取30頭蠶，從尾角處取血淋巴混合為一個(gè)供試樣品，共取樣5次，每次取樣后立即置于一 20 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0017]1.2.2樣品制備
供試樣品溶液制備:家蠶血淋巴樣品在提取之前渦旋振蕩I min，提取液采用乙腈:乙酸乙酯=5: I的混合液。取I mL家蠶血淋巴樣品,加入5 mL提取液,潤(rùn)旋振蕩10 min ；分離出殘?jiān)尤? mL提取液再重復(fù)提取一次；合并上清液，在10 000 r/min條件下高速離心5 min，濾液上機(jī)前過(guò)0.22 y m微孔PTFE濾膜，得到供試樣品溶液。
[0018]陰性樣品溶液的制備:將空白試驗(yàn)區(qū)家蠶取得的血淋巴按上述方法制備。
[0019]1.2.3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備
試驗(yàn)以外標(biāo)法進(jìn)行定性定量。精確稱取ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2標(biāo)準(zhǔn)品各0.01g，用乙腈避光振蕩溶解，制成20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4°C冰箱備用。測(cè)定時(shí)以不同濃度梯度的阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]條件參數(shù)
1.3.1液相色譜條件
液相色譜儀為島津 Prominence UFLC (ULTRA FAST LIQUID CHROMATOGRAPH)，色譜柱:Agilent ZORBAX C18 (4.6X100 mm，3.0 U m);柱溫 40°C ;流動(dòng)相:乙腈:0.005 mol/L 甲酸(V: V)= (85%: 15%)，等梯度洗脫；進(jìn)樣量 10 y L ;流速 0.2 000 mL/min。
[0021]質(zhì)譜條件
質(zhì)譜儀為API 4000 MS/MS (AB SCIEX，USA)，三重四極桿質(zhì)譜；電離方式:ESI ( + );多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式(MRM);霧化氣(NEB):7.00 psi，氣簾氣(CUR) 25.00 psi，碰撞氣(CAD):5.00 psi，離子化溫度(TEM):550.00 °C，噴霧電壓(IS):5500.00 V，射入電壓(EP):10.00 V，碰撞室射出電壓(CXP): 10.00 V。阿苯達(dá)唑及其代謝物在ESI ( + ) [M+H]+的MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。
表1阿苯達(dá)?及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)
II去簇電壓a撞能聚焦電壓
組分名稱.定量離子對(duì)HI++Z DP CE FP __幽紙___(V) (eV) (Y)
n—i I 266J00—191.10045
達(dá)唑 -266.100一234.100 13L00 - 190
266.100^234.1002S
丄丨~~~ii~^
阿苯達(dá)唑亞砜-2S2J00—2mJ00 128J0 - 170
2S2.200—20S—100____34__
~ZT~7~ 298J00^324A€038 185~
阿苯達(dá)唑砜 -298.200^159.100 14100--
298.200^159.10052230

'43~"
p j華[土 —土 -- 24ci200^133j00 1S0M0 -1M
諷240—200—WSJOO271.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
利用Analyst分析軟件對(duì)液質(zhì)譜信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、物質(zhì)峰面積的自動(dòng)積分、色譜質(zhì)譜圖的生成；利用Microsoft Office Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行物質(zhì)含量計(jì)算、線性回歸分析、標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)分析。
[0023]方法驗(yàn)證
2.1定性分析 125 u g/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、家蠶血淋巴供試樣品溶液分別進(jìn)樣10 u L，所得UFLC-MS/MS定量離子重構(gòu)離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1-1~圖4-2，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子掃描質(zhì)譜見(jiàn)圖5。在選定的色譜條件下，待測(cè)物ABZ、ABZS0、ABZS02、ABZS02_NH2的色譜峰保留時(shí)間分別為2.45、
2.01,2.02,2.27 min，供試樣品中的各待測(cè)物與混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致。峰形良好，周圍雜質(zhì)峰干擾可忽略。待測(cè)物的定性離子對(duì)的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比S/N > 3，定量離子對(duì)的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比S/N ^ 10 ;此外，各定性離子對(duì)的相對(duì)離子豐度值符合歐盟有關(guān)質(zhì)譜定性的要求(表2)(歐洲共同體委員會(huì)，2002)，至此可判斷供試樣品中含有阿苯達(dá)唑及其代謝物；反之，則樣品不含此化學(xué)物質(zhì)。
[0024]定量分析
對(duì)家蠶血淋巴供試樣品中含有的阿苯達(dá)唑及其代謝物，分別按其定量離子對(duì)(參見(jiàn)表1)的峰面積進(jìn)行含量計(jì)算。方法學(xué)研究如下:
2.2.1線性關(guān)系
將20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配置成濃度分別為5 iig/L、62.5 U g/LU25 u g/L、250 V- g/L>625 U g/L>I 250 U g/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，將所測(cè)得的峰面積(peak arearatio, PAR)和濃度(C，u g/L)進(jìn)行線性回歸分析，得到 ABZ、ABZSO、ABZSO2' ABZSO2-NH2標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程分別為-MZ:PAR=3.7242X 106C+3.4938 X IO4, R2=0.9927 ；ABZSO:PAR= 6.4613 X IO5C — 4.8495 X IO3, R2 = 0.9905 ；ABZS02:PAR=1.0269 X 106C+89.1365,R2=0.9972 ；ABZSO2-NH2:PAR=1.5396X IO6C — 8.4586X IO3, R2=0.9966，均呈良好的線性關(guān)系。
[0025]2.2.2檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)
當(dāng)進(jìn)樣量為 10 u L, S/N=3 時(shí)，ABZ、ABZS0、ABZSO2、ABZSO2-NH2 的 LOD 分別為 0.39 ng/mL、5.00 ng/mL、0.23 ng/mLU.78 ng/mL ;當(dāng)進(jìn)樣量為 10 y L, S/N= 10 時(shí)，LOQ 分別為 1.32ng/mL>16.67 ng/mL、0.76 ng/mL、5.94 ng/mL。
[0026]2.2.3重復(fù)性-精密度試驗(yàn)
將125 iig/L、625 ug/LU 250 U g/L三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品各重復(fù)進(jìn)樣6次，各自保留時(shí)間和峰面積的RSDs見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有良好的重現(xiàn)性。
【權(quán)利要求】
1.一種利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取家蠶血淋巴進(jìn)行提取，獲得供試樣品溶液； (2)配制一系列不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入超快速液相色譜儀，進(jìn)行分離分析，并用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)物質(zhì)離子信號(hào)，獲得阿苯達(dá)唑及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)分析數(shù)據(jù)； (3)按步驟(2)方法，取步驟(1)中的供試樣品溶液注入超快速液相色譜儀，進(jìn)行分離分析，并用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)物質(zhì)信號(hào)，獲得供試樣品的分析數(shù)據(jù)； (4)將步驟(3)獲得的供試樣品的分析數(shù)據(jù)與阿苯達(dá)唑及代謝物的色譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，即可對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定性和定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體操作為:取家蠶血淋巴在提取前進(jìn)行渦旋振蕩處理，在渦旋振蕩處理后，以乙腈和乙酸乙酯的混合液為提取液，按家蠶血淋巴與提取液體積比為1: 5~1: 8進(jìn)行混合，渦旋振蕩:TlO min，然后通過(guò)離心分離上清液，采用上述方法對(duì)殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液，離心、過(guò)濾，獲得供試樣品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)中超快速液相色譜儀的色譜條件為:色譜柱:Agilent ZORBAX C18，4.6X100 mm, 3.0 y m ;柱溫40°C ;流動(dòng)相:乙腈:0.005 mol/L甲酸=80%: 20%~90%: 10%，等梯度洗脫；進(jìn)樣量10 y L ;流速0.1000~0.2 000 mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)中三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測(cè)條件為:電離方式:ESI ( + );多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式；霧化氣:6.0(T8.00 psi，氣簾氣23.00^26.00 psi，碰撞氣:3.00~6.00 psi，離子化溫度:500.00~600.00°C，噴霧電壓:5000.00~6000.00 V，射入電壓:8.00~12.00 V，碰撞室射出電壓:8.00~12.00 V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)的一系列不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為阿苯達(dá)唑及其代謝物濃度為5 u g/L、62.5 u g/L、125 iig/L、250 iig/L、625 y g/L和I 250 U g/L的阿苯達(dá)唑及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用超快速液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及代謝物的含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中的分析數(shù)據(jù)包括阿苯達(dá)唑及其代謝物的保留時(shí)間、峰面積以及離子碎片質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；在所述步驟(2)中，以獲得的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)來(lái)制作阿苯達(dá)唑及其代謝物相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到阿苯達(dá)唑及其代謝物相應(yīng)的回歸方程；在所述步驟(4)中，比對(duì)供試樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和離子碎片質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定性，將阿苯達(dá)唑及其代謝物的峰面積數(shù)據(jù)代入各自相應(yīng)的回歸方程中以計(jì)算物質(zhì)含量，對(duì)家蠶血淋巴中阿苯達(dá)唑及其代謝物進(jìn)行定量。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103487539SQ201310317195
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】李麗, 楊瓊, 邢東旭, 李慶榮, 肖陽(yáng), 葉明強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所