本發(fā)明主要涉及可用作癌癥免疫療法標(biāo)靶的修飾多肽。所述修飾多肽可用作單克隆抗體(mab)療法的疫苗或標(biāo)靶。所述疫苗或mab可用于治療癌癥?？鼓[瘤免疫應(yīng)答的焦點(diǎn)主要集中在產(chǎn)生腫瘤特異性cd8應(yīng)答上，這部分是因?yàn)榇蠖鄶?shù)實(shí)體瘤缺乏mhcii類(lèi)表達(dá)。因此，這些腫瘤更適合作為cd8t細(xì)胞的標(biāo)靶，而不是cd4t細(xì)胞。但是，cd8t細(xì)胞參與的療法僅對(duì)患者表現(xiàn)出中等且短效的應(yīng)答。多年來(lái)已知cd4輔助細(xì)胞在抗體或cd8介導(dǎo)的表位特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中均起到關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)告，若在沒(méi)有cd4輔助的情況下誘導(dǎo)記憶cd8應(yīng)答，則該應(yīng)答被破壞[1、2]。最初以為這是因?yàn)閏d4輔助細(xì)胞分泌il-2[3]，但近來(lái)認(rèn)為還因?yàn)闃?shù)突細(xì)胞(dcs)的修飾/激活，從而激活了cd8細(xì)胞[4-7]。在大多數(shù)情況下，該輔助是由源自病原或插入疫苗中的外源cd4表位所提供的。但是，腫瘤位點(diǎn)處也需要腫瘤特異性cd4應(yīng)答來(lái)增強(qiáng)發(fā)炎，從而增強(qiáng)對(duì)cd8細(xì)胞、nk細(xì)胞和其他抗腫瘤免疫性炎性介質(zhì)的招募和滯留[8-11]。使用cd4或mhcii類(lèi)缺陷小鼠的研究中，腫瘤進(jìn)程接連發(fā)生，這進(jìn)一步證實(shí)了cd4輔助t細(xì)胞參與癌癥免疫，表明了cd4t細(xì)胞在根除腫瘤中的重要性。更新的文獻(xiàn)報(bào)告暗示了腫瘤反應(yīng)性cd4t細(xì)胞的重要性，它在體內(nèi)腫瘤根除和腫瘤特異性th17細(xì)胞介導(dǎo)的優(yōu)秀腫瘤破壞作用中的直接作用[12-15]。若細(xì)胞庫(kù)不受制于耐受性，則可產(chǎn)生對(duì)腫瘤特異性表位的高頻率和親抗原性的cd4應(yīng)答[16-18]。若細(xì)胞庫(kù)受制于自身耐受性，則對(duì)表位特異性cd4應(yīng)答的誘導(dǎo)會(huì)受到很大限制，且所得應(yīng)答頻率和親抗原性低。腫瘤中有若干種腫瘤表位可供標(biāo)靶，包括腫瘤特異性表位和腫瘤相關(guān)表位。前者因腫瘤的發(fā)生和發(fā)病機(jī)理中獲得的較大dna片段突變或重復(fù)或刪除而產(chǎn)生。點(diǎn)突變難以被免疫系統(tǒng)靶定，這是由于它們必須創(chuàng)造出新表位，創(chuàng)造出可與mhc相結(jié)合的新錨定殘基或與t細(xì)胞或b細(xì)胞受體(tcr或bcrs)反應(yīng)更強(qiáng)烈的新氨基酸。即使突變真的產(chǎn)生了新表位，也往往僅在少數(shù)個(gè)別合適的mhc單倍型中被識(shí)別?；蛑貜?fù)和刪除難以被靶定，因?yàn)樗麄兺ǔＪ莻€(gè)別癌癥中獨(dú)特存在的。相反，腫瘤相關(guān)表位是過(guò)度表達(dá)的正常表位。所述正常表位通常在胸腺中直接或通過(guò)aire酶表達(dá)，且能以高親和性識(shí)別這些表位的t細(xì)胞被刪除或被分化為天然t調(diào)節(jié)細(xì)胞。雖然已發(fā)現(xiàn)了對(duì)腫瘤相關(guān)表位的cd8應(yīng)答，對(duì)腫瘤相關(guān)表位的cd4應(yīng)答卻很鮮見(jiàn)，暗示著對(duì)這些表位的細(xì)胞庫(kù)中，cd4細(xì)胞受到比cd8細(xì)胞更重的調(diào)控。唯一被發(fā)現(xiàn)的cd4應(yīng)答是針對(duì)睪丸癌抗原，其在胚胎發(fā)生期間表達(dá)，但僅在成人的配子中保持活性，而可能不會(huì)受到胸腺耐受，但最新證據(jù)表明，aire也可以在胸腺中呈現(xiàn)這些表位。因此，困難在于找到能夠識(shí)別自體表位并攻擊腫瘤的t細(xì)胞庫(kù)。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了t細(xì)胞或b細(xì)胞表位經(jīng)某些修飾能得到與未修飾表位相比引發(fā)免疫應(yīng)答更強(qiáng)的表位。令人吃驚地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些修飾后表位與腫瘤相關(guān)，由此可用于產(chǎn)生針對(duì)所述腫瘤的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的第一方面中，提供了用于醫(yī)藥的刺激對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)表位，所述表位經(jīng)過(guò)選自如下的修飾：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色氨酸氧化、谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)。本發(fā)明還提供用于癌癥治療方法中的刺激對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)表位，和/或含有編碼所述表位的序列的核酸，所述表位經(jīng)過(guò)選自如下的修飾：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色氨酸氧化、谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)；所述表位，及所述表位和/或核酸在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種治療癌癥的方法，包括將本發(fā)明的表位或核酸向需要改治療的對(duì)象給藥。所述表位可以是t細(xì)胞或b細(xì)胞表位。本發(fā)明中的表位可單獨(dú)或組合使用。此外，它們還可以和其他治療劑共同使用，例如抗癌藥劑，包括但不限于檢查點(diǎn)阻斷藥物，如易普利姆瑪(ipilimumab)。優(yōu)選的修飾之一為精氨酸脫亞氨基反應(yīng)形成瓜氨酸。自由精氨酸可以通過(guò)真核細(xì)胞中的氧化亞氮合成酶或細(xì)菌中的精氨酸脫亞氨酶轉(zhuǎn)化為自由瓜氨酸。瓜氨酸是一種修飾后的氨基酸，但由于其不具有trna，無(wú)法直接添加入蛋白中，而是來(lái)自由肽?；彼崦搧啺坊?pad，存在于各種組織中的酶家族)作用的精氨酸翻譯后修飾。術(shù)語(yǔ)“瓜氨酸化(citrullination)”或“脫亞氨基(deimination)”指的是精氨酸到瓜氨酸的修飾，可以是由酶pad在多肽序列中進(jìn)行的翻譯后修飾。附圖中的圖1中展示了更多細(xì)節(jié)。在精氨酸到瓜氨酸的反應(yīng)中，精氨酸側(cè)鏈的末端氮原子之一被氧原子取代。該反應(yīng)使用了一個(gè)h2o分子，生成副產(chǎn)物氨。所述精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化可以對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響，因?yàn)榫彼嵩谥行詐h下帶正電，而瓜氨酸則不帶電荷。隨著蛋白疏水性的增加，蛋白折疊也可能發(fā)生變化。pad酶有5種，稱(chēng)為pad1、2、3、4和6。雖然它們高度同源，在氨基酸水平上具有5-60％的序列一致性，但卻具有不同的位點(diǎn)(pad1-表皮和子宮；pad2-大腦，女性生殖道，骨骼肌和造血細(xì)胞；pad3-毛囊和上皮；pad4-造血細(xì)胞，肺，食道，乳腺和卵巢癌；pad6-卵母細(xì)胞和植入前胚胎[19])。雖然與靶蛋白有些重疊，但每個(gè)家族成員還似乎能夠靶定獨(dú)有的一套細(xì)胞蛋白。這是由精氨酸的表面裸露和聚簇決定的，使它們成為良好標(biāo)靶和優(yōu)選的氨基酸側(cè)翼序列。對(duì)于pad4，位點(diǎn)-2和+2上優(yōu)選為非極性小氨基酸，且精氨酸側(cè)翼的脯氨酸防止瓜氨酸化[20,21]。因此，不是蛋白質(zhì)中的所有精氨酸都瓜氨酸化，不是所有精氨酸都在mhc抗原呈現(xiàn)以供t細(xì)胞識(shí)別。在本發(fā)明中，可用于刺激抗癌免疫的瓜氨酸化表位源自bip、ny-eso-1、mmp7、細(xì)胞角蛋白、muc1、cea.cam5、cd59、bcl2、β-連環(huán)蛋白、cxcl8、cxcl10、cxcl12、α烯醇酶、髓鞘堿性蛋白、組蛋白、核磷酸蛋白、b23、共活化劑復(fù)合體、抗凝血酶、aggregan、延長(zhǎng)因子1α、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白(cap1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、aldh2、軟骨中間層蛋白(clip)、醛縮酶、磷酸甘油酸激酶1(pgk1)、鈣網(wǎng)蛋白、hsp60、hsp90、遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1和2(fuse-bps)、無(wú)孢蛋白、組織蛋白酶d、肝素結(jié)合蛋白、β-肌動(dòng)蛋白、f-肌動(dòng)蛋白、加帽蛋白α-1亞單位(capzα-1)、白蛋白、組胺受體、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶er60前體、線(xiàn)粒體醛脫氫酶(aldh2)和糖原合成酶激酶3β(gsk3β)。所述蛋白的通用蛋白庫(kù)(uniprot)索引如附圖中的圖32所示。針對(duì)各種瓜氨酸化蛋白(包括絲聚合蛋白、膠原蛋白、α-烯醇酶、纖維蛋白原和波形蛋白)的抗體被發(fā)現(xiàn)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)病患中，并可用作診斷該疾病的特異性標(biāo)記[22-24]。最近，若干其他瓜氨酸化蛋白被描述為ra病患中的抗體標(biāo)靶，包括組蛋白、核磷酸蛋白、b23、共活化劑復(fù)合體、抗凝血?jiǎng)ggregan、延長(zhǎng)因子1α、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白(cap1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、aldh2、軟骨中間層蛋白(clip)、醛縮酶、磷酸甘油酸激酶1(pgk1)、鈣網(wǎng)蛋白、hsp60、hsp90、bip、遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1和2(fuse-bps)、無(wú)孢蛋白、組織蛋白酶d、肝素結(jié)合蛋白、β-肌動(dòng)蛋白、f-肌動(dòng)蛋白、加帽蛋白α-1亞單位(capzα-1)、白蛋白、組胺受體、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶er60前體、線(xiàn)粒體醛脫氫酶(aldh2)[49]。此外，據(jù)假定，瓜氨酸自身不足以生成變異反應(yīng)，而瓜氨酸周?chē)陌被釋?duì)確定表位的抗原性則是必要的[25-27]。除瓜氨酸化外，本發(fā)明中的數(shù)種其他翻譯后修飾也在mhc結(jié)合的多肽中觀(guān)察到，包括酪氨酸殘基的硝化[28]和色氨酸殘基的氧化[29]。巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的激活，包括生成氧化亞氮和其他活性氧類(lèi)。蛋白質(zhì)的裸露可以帶來(lái)酪氨酸的硝化和色氨酸的較低程度硝化。據(jù)顯示，cd4細(xì)胞在雞卵溶菌酶來(lái)源的表位上特異識(shí)別所述修飾[29]。但是，尚未確定硝化表位在任何疾病中的作用。前列腺腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中存在的高水平硝化酪氨酸，暗示著過(guò)氧亞硝基的本地生成。精氨酸代謝中的關(guān)鍵酶在惡性前列腺組織中高度表達(dá)但在正常前列腺中則否，抑制精氨酸酶和氧化亞氮合成酶活性，降低酪氨酸硝化和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的恢復(fù)[30]。谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基化可能是因?yàn)槔匣?，但該修飾的顯著部分是因酶機(jī)理而產(chǎn)生。脫氨基化形成了主要帶負(fù)電荷的側(cè)鏈(谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽)，并改變了谷氨酰胺和天冬酰胺形成氫鍵的能力。天冬酰胺可以通過(guò)n-聚糖酶轉(zhuǎn)化為天冬氨酸鹽，因此，該修飾與n-糖基化反應(yīng)緊密相連。谷氨酰胺殘基可以通過(guò)組織轉(zhuǎn)谷氨酸鹽酶來(lái)脫氨基。來(lái)自飲食小麥蛋白中的谷氨酰胺脫氨基化，是乳糜瀉疾病(一種與遺傳導(dǎo)致的個(gè)體谷蛋白不耐受相關(guān)的自免疫疾病)的核心。hla單倍型、dq2和dq8對(duì)脫氨基化的醇溶蛋白多肽具有強(qiáng)親和性，并刺激t細(xì)胞對(duì)胃腸道內(nèi)壁的應(yīng)答[31]。本發(fā)明的表位可以包括以下序列、由其組成或主要由其組成：iqklygkrs，優(yōu)選為sqddikgiqklygkrs(mmp7-247)，niltirltaa，優(yōu)選為pgvllkeftvsgniltirltaadhr(nyeso-1-119)，ltirltaa，優(yōu)選為pgvllkeftvsgniltirltaadhr(nyeso-1-119)，eirelqsq，優(yōu)選為eeeirelqsqisdtsvvls(cytokeratin8229-247)，akqdmarqlreyqel，優(yōu)選為akqdmarqlreyqelmnvkl(cytokeratin8:363-382)，akqdmarq，優(yōu)選為lqrakqdmarqlreyqelm(cytokeratin8:360-378)，issssfsrv，優(yōu)選為pgsrissssfsrvgss(cytokeratin8:29-44)，prafssrs，優(yōu)選為stsgprafssrsytsgpg(cytokeratin8:13-30)，eaalqrakq，優(yōu)選為eleaalqrakqdmarql(cytokeratin8:355-371)，levdpniqavrtqe，優(yōu)選為levdpniqavrtqekeqi(cytokeratin8:78-95)，和qkklklvrt，優(yōu)選為aqkklklvrtspeygmp(ing4158-174)，lklvrtspe，優(yōu)選為aqkklklvrtspeygmp(ing4158-174)，kklklvrts，優(yōu)選為aqkklklvrtspeygmp(ing4158-174)，ymssarsls，mssarslss或teymssars，優(yōu)選為klateymssarslsseek(ing444-58)，fdlfenrkk，優(yōu)選為rapfdlfenrkkknn(hsp90-346-360)，ylnfirgvv或firgvvdse，優(yōu)選為ipeylnfirgvvdse(hsp90-378-392)，lryytsasg，llryytsas或lsellryyt，優(yōu)選為rkklsellryytsasgdemvsl(hsp90-456-477)，rrrlsellryhtsqs(hsp90beta456-460)，vgvfkngrv或fkngrveii，優(yōu)選為yscvgvfkngrveii(bip39-53)，yfndaqrqa，優(yōu)選為vpayfndaqrqatkda(bip172-186)，vtfeidvng，優(yōu)選為evtfeidvngilrvt(bip497-511)，itndqnrlt，優(yōu)選為kititndqnrltpee(bip522-536)，lqivarlkn或varlknnnr，優(yōu)選為ncalqivarlknnnr(cxcl12-54-68)，veiiatmkk或rveiiatmk，優(yōu)選為cprveiiatmkkkge(cxcl1057-71)。其中，一個(gè)或多個(gè)r殘基被替代為瓜氨酸。在nyeso-1-119中，優(yōu)選地，第一個(gè)r殘基(位點(diǎn)136)被瓜氨酸取代。在細(xì)胞角蛋白8：360-378中，優(yōu)選地，第二個(gè)r殘基(位點(diǎn)369)被瓜氨酸取代。在細(xì)胞角蛋白8:29-44中，優(yōu)選地，第二個(gè)r殘基(位點(diǎn)40)被瓜氨酸取代。在hsp90、bip、ing4、cxcl10和cxcl12中，優(yōu)選地，序列中所有r殘基被瓜氨酸取代。本發(fā)明還在進(jìn)一步的方面中提供了所述表位。特別地，本發(fā)明提供了含有序列yvttstcittyslgsalcit或由該序列組成或主要由該序列組成，且可選地含有序列citsyvttstcittyslgsalcitpsts(vim28-49)或由該序列組成或主要由該序列組成的多肽，其中cit代表瓜氨酸。本發(fā)明的優(yōu)選表位之一源自波形蛋白，且瓜氨酸化。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，來(lái)自波形蛋白的瓜氨酸化表位可用作產(chǎn)生對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，包括但不限于，黑色素瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌。來(lái)自波形蛋白的優(yōu)選表位含有vttstrtyslgsalr(波形蛋白30-45)、由其組成或主要由其組成，其可以可選地瓜氨酸化。其中兩個(gè)精氨酸之一或兩者均可以瓜氨酸化。該表位可以包括rsyvttstrtyslgsalrpsts(波形蛋白28-49)、由其組成或主要由其組成，其可以可選地瓜氨酸化。其中三個(gè)精氨酸中的任一個(gè)、任兩個(gè)或所有三個(gè)可以瓜氨酸化。優(yōu)選地，所有三個(gè)r殘基皆為瓜氨酸化。第二個(gè)r殘基(位點(diǎn)36)可以被瓜氨酸取代。源自波形蛋白的可選表位包括至少一個(gè)以下序列、由其組成或主要由其組成：vrlrssvpg或rlrssvpgv，優(yōu)選為savrlrssvpgvr(vim65-77)，和fsslnlret，優(yōu)選為lpnfsslnlretnldslpl(vim415-433),其中一個(gè)或多個(gè)所述r殘基被瓜氨酸取代。在vim65-77中，優(yōu)選地，第二個(gè)r殘基(位點(diǎn)70)被瓜氨酸取代。源自波形蛋白的更多可選表位包括至少一個(gè)以下序列、由其組成或主要由其組成：rssvpgvrl，savrlrssv，atrssavrl，yatrssavrlrssvpgvrl(vim61-79)，rssvpgvrl，gvrllqdsv，rlrssvpgvrllqdsvdfs(vim69-87)，qlkgqgksr，ksrlgdlye，eqlkgqgksrlgdlyeeem(vim125-154)，elrrqvdql，emrelrrqv，dlyeeemrelrrqvdqltn(vim148-166)，qltndkarv，veverdnla，ltndkarve，vdqltndkarveverdnla(vim161-179)，everdnlae，ndkarveverdnlaedimr(vim166-184)，imrlreklq，dnlaedimrlreklqeeml(vim176-194)，qreeaentl，klqeemlqr，eklqeemlqreeaentlqs(vim187-205)，和/或frqdvdnas，entlqsfrq，eaentlqsfrqdvdnasla(vim198-216)，其中一個(gè)或多個(gè)所述r殘基可以被瓜氨酸取代。在上述序列中，優(yōu)選被瓜氨酸取代的r殘基以下劃線(xiàn)標(biāo)出。核心序列顯示在表位之前。本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了包含序列yvttstrtyslgsalr、由其組成或主要由其組成的表位，且可選地，包含序列rsyvttstrtyslgsalrpsts(vim28-49)，和/或編碼所述表位的核酸，以用于治療癌癥的方法中。本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含序列fsslnlret(優(yōu)選為lpnfsslnlretnldslpl(vim415-433))、由其組成或主要由其組成的表位，和/或編碼所述表位的核酸，以用于治療自免疫疾病的方法中。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該表位刺激能抑制整體免疫反應(yīng)的il10應(yīng)答。除非另有說(shuō)明，上述序列中下劃線(xiàn)的殘基指示的是核心序列。所述核心序列以外的氨基酸可以被其他氨基酸保守取代(優(yōu)選為以與被取代的原生氨基酸具有相似大小和/或電荷的氨基酸來(lái)取代)或可以被刪除。此外，或可選地，1、2、3、4、5或所有非核心氨基酸可以被取代或刪除。本發(fā)明中可用的表位可以具有供hlaii類(lèi)分子的cd4+t細(xì)胞識(shí)別的優(yōu)化長(zhǎng)度、疏水性和/或電荷。本發(fā)明的表位可以包括至少13、14、15、16或更多氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明中可用的其他表位可以使用如本文實(shí)施例10中所述的各種技術(shù)來(lái)鑒別。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，編碼全長(zhǎng)波形蛋白(人波形蛋白序列參見(jiàn)圖2?？梢园ɑ虿话╪端蛋氨酸殘基)的核酸(例如dna或rna)的給藥，會(huì)引起強(qiáng)免疫反應(yīng)，這構(gòu)成了本發(fā)明的又一實(shí)施例。波形蛋白(vim)在具有該基因克隆的物種之間高度保守(雞、鼠、狗、羊、牛、馬、豬和人)。相應(yīng)地，例如如上所述的波形蛋白和源自波形蛋白的表位，及其編碼核酸，可用于治療人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物的癌癥。申請(qǐng)人此前展示了，在抗體dna結(jié)構(gòu)中包含t細(xì)胞表位，能增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的頻率和親抗原性[32,33]。如下文實(shí)施例中將會(huì)詳細(xì)描述，在hla轉(zhuǎn)基因小鼠中，發(fā)明人向抗體dna結(jié)構(gòu)中克隆了各種外源和自體表位，并篩選t細(xì)胞應(yīng)答。所有外源表位都刺激了強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答，但刺激了顯著應(yīng)答的自體表位僅有波形蛋白28-49。即使是與原生小鼠表位僅有1個(gè)保守氨基酸變化差異的人gp100表位，也在小鼠中刺激了強(qiáng)應(yīng)答，而完全保守的小鼠表位未能在小鼠中刺激應(yīng)答。這暗示著對(duì)識(shí)別小鼠表位的t細(xì)胞的完全耐受/刪除，而對(duì)極為相似的人表位則沒(méi)有。這暗示著人表位不會(huì)在人體內(nèi)刺激t細(xì)胞響應(yīng)，而且，雖然小鼠表位可能可以，但t細(xì)胞卻無(wú)法識(shí)別腫瘤中天然加工的人表位。相反地，自體波形蛋白28-49表位能在正常供體或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)患者中刺激應(yīng)答[34]。相反地，發(fā)明人展示了癌癥患者可對(duì)vim28-49做出免疫應(yīng)答。這暗示著，該表位令人意外地不受制于自體耐受性，人和小鼠中均存在一個(gè)能夠識(shí)別該表位并作出應(yīng)答的t細(xì)胞庫(kù)。波形蛋白(gi/4507895)是發(fā)現(xiàn)于間葉細(xì)胞和其他非上皮細(xì)胞的中間纖絲(ifs)，尤其是iii類(lèi)ifs中的同源二聚體胞內(nèi)蛋白。ifs是高等真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架的主要成分，由數(shù)種不同結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白所組成。不同的if蛋白基因在不同的組織中表達(dá)。人和鼠波形蛋白基因的特性均得到了辨認(rèn)(參見(jiàn)例如[35,36])。波形蛋白以及其他if蛋白已被用于人類(lèi)腫瘤的組織學(xué)分類(lèi)(參見(jiàn)[37,38]的綜述)和數(shù)種腫瘤類(lèi)型去分化的標(biāo)記。文獻(xiàn)記載了多藥物抗藥性腫瘤病的波形蛋白指導(dǎo)診斷和治療(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20100260667)，以及與波形蛋白和其他ifs共定位腫瘤標(biāo)記(參見(jiàn)例如wo0127269)。后者描述了用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤的新型標(biāo)記(稱(chēng)為vip54)及其在作為腫瘤發(fā)展和進(jìn)程標(biāo)記的if檢測(cè)和細(xì)胞成像中的用途。數(shù)個(gè)其他已知實(shí)施例展示了不同人實(shí)體瘤和實(shí)體瘤細(xì)胞系種類(lèi)中波形蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞間分布[39,40]。但是，至今為止，還未發(fā)現(xiàn)對(duì)未修飾波形蛋白的t細(xì)胞應(yīng)答。人波形蛋白為57kda蛋白，包含466個(gè)氨基酸(參見(jiàn)圖2)，也是iii型if蛋白家族最廣泛表達(dá)且高度保守的蛋白之一。它不存在于細(xì)胞液中，但在細(xì)胞核中表達(dá)，并作為胞外蛋白表達(dá)。它參與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組織，在細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移和繁殖中具有重要功能。上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換(emt)；波形蛋白亦在各種上皮癌癥中過(guò)度表達(dá)，包括前列腺癌、胃腸道癌、乳腺癌肺癌、惡性黑色素瘤和中央神經(jīng)系統(tǒng)瘤。它還見(jiàn)于宮頸癌[41]、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌[42]、某些類(lèi)型的淋巴癌[43]、甲狀腺乳頭狀癌[44]和子宮內(nèi)膜癌[45]。它在癌癥中的過(guò)度表達(dá)與腫瘤加速生長(zhǎng)、侵襲和不良預(yù)后具有相關(guān)性。在胃癌中，波形蛋白表達(dá)最經(jīng)常與胃癌侵襲表型相關(guān)，且有證據(jù)暗示它在胃癌的轉(zhuǎn)移中具有重要作用，且可充當(dāng)預(yù)后指標(biāo)[46、47]。軟組織肉瘤和一些表現(xiàn)出上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(emt)表型的上皮癌癥中表達(dá)了波形蛋白。癌細(xì)胞通過(guò)emt從上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞狀轉(zhuǎn)化的表型，被看做是實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)步驟(參見(jiàn)圖3)。此外，所述癌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換與降低放射、化學(xué)療法和某些小分子靶向療法的抗腫瘤作用的癌癥抗性機(jī)制的獲得有關(guān)。雖然波形蛋白被當(dāng)做是emt的標(biāo)記，它在腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。研究最多的emt誘導(dǎo)物之一為tgfβ，它在多種腫瘤類(lèi)型中都有發(fā)現(xiàn)，與rtk-信號(hào)傳導(dǎo)通路或其他通路合作，驅(qū)使腫瘤細(xì)胞成為更接近間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性表現(xiàn)型。ivaska[48]展示了波形蛋白通過(guò)上調(diào)書(shū)中emt相連基因的表達(dá)來(lái)協(xié)助emt，尤其是促遷移受體酪氨酸激酶axl。若干研究支持波形蛋白功能是emt的積極調(diào)控子且其上調(diào)是emt誘導(dǎo)的前提的說(shuō)法[48、49]。上述所有癌癥以及卵巢癌和胃腸道癌均可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療，無(wú)論其表位為何。本發(fā)明還可以涉及但不限于治療前列腺癌、乳腺癌、肺癌、惡性黑色素瘤、中央神經(jīng)系統(tǒng)瘤、宮頸癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、淋巴瘤、甲狀腺乳頭狀癌和子宮內(nèi)膜癌。本發(fā)明的波形蛋白28-49及其他表位可以多肽形式進(jìn)行體內(nèi)遞送，可選地，以wo02/058728中所公開(kāi)的多肽形式。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中可用的表位以多肽形式給藥時(shí)，會(huì)引起強(qiáng)免疫應(yīng)答。所述表位可僅以表位的序列給藥，或以含有該表位的多肽給藥，或以甚至全長(zhǎng)蛋白給藥?？蛇x地，本發(fā)明的表位可以作為編碼該表位的核酸、編碼含有該表位的多肽的核酸，或甚至編碼該全長(zhǎng)蛋白的核酸來(lái)體內(nèi)給藥。所述核酸可以是小基因形式，即編碼前導(dǎo)序列和該表位，或編碼前導(dǎo)序列和全長(zhǎng)蛋白?？蛇x地，其可以是如wo2008/116937所公開(kāi)的核酸形式。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了含有至少一個(gè)編碼免疫球蛋白分子重組重鏈的序列的核酸，所述重鏈具有至少一個(gè)異源t細(xì)胞表位，其中所述t細(xì)胞表位是本發(fā)明第一方面中的表位，優(yōu)選為波形蛋白28-49。優(yōu)選地，該核酸還包括非特異性啟動(dòng)子，且可以是dna。所述免疫球蛋白分子可以是抗體。所述表位可以插入重鏈的cdr中，優(yōu)選為該重鏈的cdr3。本發(fā)明中可用表位的編碼核酸可以靶向抗原呈遞細(xì)胞和其他表達(dá)pad酶(優(yōu)選為pad4酶)的細(xì)胞。本發(fā)明的核酸的靶向，可以通過(guò)包括含有靶向劑的核酸，所述靶向劑例如為fc或靶向apcs上不同抗原的單克隆抗體，例如抗dec205mab，或通過(guò)皮內(nèi)注射法，因?yàn)槠つw中有大量apcs。此前的研究辨明，在位點(diǎn)28和36處瓜氨酸化的vim26-44、在位點(diǎn)36和45處瓜氨酸化的vim36-54和在位點(diǎn)424處瓜氨酸化的vim415-433，能刺激hla-dr4小鼠和/或ra患者中的t細(xì)胞應(yīng)答[34]。如實(shí)施例中的詳細(xì)記載，要測(cè)試dna結(jié)構(gòu)中的vim表位是否刺激對(duì)瓜氨酸化波形蛋白的免疫應(yīng)答，使小鼠對(duì)編碼波形蛋白表位的dna免疫接種，并篩選對(duì)未修飾表位和瓜氨酸化表位的應(yīng)答。以vim28-49dna或編碼全波形蛋白序列的dna所免疫接種的小鼠，對(duì)瓜氨酸化(cit)28-49表位的應(yīng)答強(qiáng)于野生型(wt)表位。這暗示著，dna翻譯后，vim表位瓜氨酸化，瓜氨酸化表位與mhc結(jié)合的親和性更高，或以未修飾波形蛋白表位刺激的t細(xì)胞識(shí)別瓜氨酸化表位的親抗原性更高。與vim28-49相反，vim415-433dna或編碼全波形蛋白序列的dna僅刺激了識(shí)別瓜氨酸化表位vim415-433的應(yīng)答，而非野生型vim415-433，證實(shí)了表位呈遞細(xì)胞(apcs)中的dna被翻譯成了被瓜氨酸化的多肽?；诖?，近期研究表明，樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)瓜氨酸化酶pad2和pad4[51]。另一有趣之處在于，編碼vim415-433的dna引起強(qiáng)th17應(yīng)答。編碼來(lái)自mmp7和ny-eso-1的表位的dna疫苗還刺激能夠識(shí)別瓜氨酸化和未修飾表位的t細(xì)胞。mmp-7應(yīng)答主要是th17，而nyeso-1應(yīng)答主要是th1。類(lèi)似地，癌癥患者表現(xiàn)出對(duì)mmp7和nyeso-1修飾多肽和未修飾多肽的應(yīng)答。有數(shù)篇報(bào)告表明，單核細(xì)胞表達(dá)pad酶[27,52,53]。近期來(lái)，發(fā)現(xiàn)骨髓性樹(shù)突細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞均表達(dá)pad2和pad4[51]。瓜氨酸化是發(fā)炎過(guò)程的一部分，對(duì)其研究剛剛開(kāi)始。刺激具有ifnγ和雙鏈rna的外周血單核細(xì)胞，使得趨化因子cxcl8和cxcl10瓜氨酸化，這對(duì)其受體使用、蛋白酶解加工和生物活性均有根本影響[54-56]。這可能意味著經(jīng)由toll受體、damp受體或熱休克蛋白的細(xì)胞應(yīng)激介質(zhì)可能允許pad酶在apcs和目標(biāo)細(xì)胞(例如感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)中的生理激活，從而能夠破壞對(duì)修飾字體表位的耐受，允許誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。樹(shù)突細(xì)胞中的瓜氨酸化似乎涉及自體吞噬[57]，但這僅在雞卵溶菌酶中發(fā)現(xiàn)過(guò)。本文的公開(kāi)中，編碼未修飾表位的dna可以刺激瓜氨酸化表位特異性t細(xì)胞應(yīng)答。這意味著，該dna必須在apcs中經(jīng)過(guò)翻譯和翻譯后瓜氨酸化，才能刺激瓜氨酸化表位特異性t細(xì)胞。這是對(duì)核酸疫苗刺激瓜氨酸化的首次展示。并無(wú)任何報(bào)告顯示腫瘤對(duì)mhc分子上呈現(xiàn)的任何表位進(jìn)行瓜氨酸化。除了顯示抗體dna中的編碼表位得到的應(yīng)答頻率較高、親抗原性更高外，發(fā)明人還在此展示了瓜氨酸化多肽可以刺激t細(xì)胞應(yīng)答。瓜氨酸化的vim28-49多肽主要刺激th1應(yīng)答，識(shí)別修飾后表位，但也與野生型多肽有一些交叉反應(yīng)。野生型vim28-49刺激針對(duì)野生型和修飾后表位的th1應(yīng)答。當(dāng)癌癥患者以?xún)煞N多肽中的任一種進(jìn)行刺激時(shí)，2/11對(duì)未修飾表位做出應(yīng)答，5/11對(duì)瓜氨酸化表位vim28-49做出了應(yīng)答。hilletal.[50]此前展示了修飾后的瓜氨酸化vim65-77表位，其中位點(diǎn)33處的a被l取代，所述表位與hla-dr4的結(jié)合比未修飾表位更強(qiáng)。但是，其為合成抗原，且據(jù)發(fā)現(xiàn)，dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中，即使是瓜氨酸化的天然vim65-77表位也不會(huì)引起免疫應(yīng)答[34]。相反，我們展示了，在hla-dr4小鼠中，瓜氨酸化vim28-49和vim65-77多肽刺激了主要識(shí)別修飾后表位的th1應(yīng)答，而野生型表位則是不良免疫原。進(jìn)一步的分析證實(shí)了所述應(yīng)答受到cd4t細(xì)胞的調(diào)控。瓜氨酸化vim65-77還刺激了hla-a2.dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)答。但是，進(jìn)一步分析也揭示了該應(yīng)答為cd8應(yīng)答，且特異性表位為rlcitssvpgv。這是對(duì)瓜氨酸化cd8表位的首次描述。我們展示了，出乎意料地，在癌癥病人中，4/9的病人對(duì)vim65-77做出應(yīng)答，4/9對(duì)瓜氨酸化vim65-77應(yīng)答，但僅其中2人對(duì)兩種多肽均有應(yīng)答。對(duì)于dna免疫接種，以瓜氨酸化vim415-433多肽免疫接種的小鼠刺激了對(duì)修飾后表位的特異性應(yīng)答，而野生型表位未能刺激應(yīng)答。此外，瓜氨酸化vim415-433多肽刺激了非常強(qiáng)烈的il-17應(yīng)答。相反，在癌癥病人中，8/11對(duì)野生型表位應(yīng)答，而僅5/11對(duì)瓜氨酸化vim415-433做出應(yīng)答。這暗示著，未修飾表位和修飾表位均能刺激患者的t細(xì)胞應(yīng)答，且所述t細(xì)胞應(yīng)答并非總是交叉反應(yīng)。這也是癌癥病人能夠?qū)习彼峄砦蛔龀鰬?yīng)答的首次展示，此前人們以為該應(yīng)答僅限于ra病人。修飾后多肽和編碼所述多肽的dna能夠刺激對(duì)修飾后表位的免疫應(yīng)答，且所述修飾后表位由腫瘤靶細(xì)胞表達(dá)。瓜氨酸化波形蛋白存在于炎性巨噬細(xì)胞[58、59]中，且在鈣-離子載體誘導(dǎo)的人和鼠巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程中被觀(guān)察到。巨噬細(xì)胞在rna和蛋白水平上表達(dá)pad[60]，且瓜氨酸化波形蛋白可在離子載體誘導(dǎo)的ca2+輸入后于巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中體外表達(dá)[27,58]。但是，正常情況下，細(xì)胞溶質(zhì)ca2+濃度(約為10-7m)對(duì)pad酶活性而言過(guò)低。pad活性需要的最低ca2+濃度比正常細(xì)胞溶質(zhì)ca2+濃度高約100倍。由于所述離子載體和隨之而來(lái)的ca2+輸入引起細(xì)胞凋亡，這暗示著波形蛋白瓜氨酸化參與了細(xì)胞凋亡。的確，瓜氨酸在準(zhǔn)備用于凋亡過(guò)程中的降解的胞內(nèi)蛋白上具有重要作用。據(jù)發(fā)現(xiàn)，波形蛋白在凋亡中的巨噬細(xì)胞中被瓜氨酸化，而針對(duì)瓜氨酸化波形蛋白的抗體則在凋亡物質(zhì)處置不當(dāng)時(shí)產(chǎn)生[27]。該研究暗示，翻譯后修飾在調(diào)控波形蛋白功能時(shí)的重要作用，尤其是指定修飾有細(xì)胞和組織特異性時(shí)。但是，若pads僅在凋亡腫瘤細(xì)胞中激活，則瓜氨酸化蛋白便是不良標(biāo)靶，因?yàn)檫@些細(xì)胞已在死亡。但是，根據(jù)發(fā)明人展示，識(shí)別修飾后表位的t細(xì)胞做出強(qiáng)烈抗腫瘤應(yīng)答，暗示著如apcs等活性腫瘤細(xì)胞能夠在其局部釋放高胞內(nèi)鈣水平，導(dǎo)致靶蛋白的瓜氨酸化。此外，由瓜氨酸化vim415-433和vim28-49誘導(dǎo)的t細(xì)胞，能誘導(dǎo)cd4t細(xì)胞，在mhcii類(lèi)和表位表達(dá)的情況下識(shí)別和殺滅癌細(xì)胞，但在正常細(xì)胞中則不會(huì)。雖然據(jù)顯示，瓜氨酸化vim415-433能夠刺激t細(xì)胞應(yīng)答，而未修飾表位不會(huì)，這可能與人和鼠vim415-433的兩個(gè)氨基酸差異有關(guān)。因此，篩選小鼠對(duì)鼠表位的應(yīng)答。以瓜氨酸化人波形蛋白免疫接種的小鼠可識(shí)別波形蛋白。此外，與人表位相似地，其為th1/th17應(yīng)答。此前，據(jù)發(fā)現(xiàn)，th1或th17誘導(dǎo)應(yīng)答受到為適當(dāng)應(yīng)答建立正確細(xì)胞因子環(huán)境的免疫佐劑的極大影響。ifnγ和il-12觸發(fā)th1細(xì)胞分化。th1細(xì)胞產(chǎn)生ifnγ、il-2、tnf和gm-csf，并刺激例如cd8+t細(xì)胞的激活。相反，th2細(xì)胞因il-4分化。它們分泌il-4、il-5和il-13，并輔助b細(xì)胞進(jìn)行抗體生成，且下調(diào)th1細(xì)胞誘導(dǎo)的促炎性應(yīng)答。tgfβ、il-1、il-6、il-21和il-23觸發(fā)th17細(xì)胞的分化。它們分泌il-17和il-6。當(dāng)無(wú)促炎性細(xì)胞因子但存在高濃度tgfβ時(shí)，cd4+t細(xì)胞分化為itreg(參見(jiàn)圖4)。所述細(xì)胞分泌tgfβ和il-10，且特征在于具有轉(zhuǎn)錄因子叉頭框p3(foxp3)。它們控制并中和其他效應(yīng)子t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，且參與預(yù)防自免疫性[61]。瓜氨酸化vim415-433多肽因此以各種佐劑或無(wú)佐劑免疫接種。免疫刺激性佐劑，例如cpg/mpla和gmcsf，均能刺激th1/th17應(yīng)答，且是必需的，因?yàn)樵谌狈ψ魟┑那闆r下不發(fā)生應(yīng)答。惰性佐劑，例如明礬和弗氏不完全佐劑主要誘導(dǎo)il-10應(yīng)答，與誘導(dǎo)il-10應(yīng)答的野生型vim415-433多肽免疫接種相似，暗示著對(duì)itreg應(yīng)答的誘導(dǎo)。相反，瓜氨酸化vim415-433多肽與優(yōu)化佐劑的組合誘導(dǎo)ifnγ/il-17應(yīng)答，暗示著th17應(yīng)答。這是首次展示t細(xì)胞表位能確定t輔助細(xì)胞分化。由于小鼠對(duì)瓜氨酸化vim415-433多肽的單免疫接種做出了強(qiáng)th1/th17應(yīng)答，這可能反映了對(duì)天然treg應(yīng)答的促進(jìn)。但是，刪除天然tregs后，并未影響瓜氨酸化vim415-433免疫應(yīng)答的頻率或親抗原性，暗示著此原理不太可能?？赡苁窃怀尸F(xiàn)的野生型vim415-433表位刺激了itreg應(yīng)答，以il-10生成為特征。的確，以瓜氨酸化vim415-433免疫接種的小鼠做出了ifnγ、il-17和il-10應(yīng)答，而以未修飾表位免疫接種的小鼠僅刺激了il-10應(yīng)答。未修飾vim415-433多肽還刺激了癌癥病人的il-10應(yīng)答?？筩tla-4mabs能夠阻斷ctla-4與其同源受體cd80/86的相互作用，由此防止該配體誘導(dǎo)的t細(xì)胞抑制。在存在抗ctla-4mab的情況下，小鼠以瓜氨酸化vim415-433多肽免疫接種，顯著增加了t細(xì)胞應(yīng)答的親抗原性，從10-6m到10-8m。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供了一種用于醫(yī)藥用途的刺激對(duì)自體抗原的il-10免疫反應(yīng)的修飾后表位，和/或編碼所述表位的核酸，所述表位的修飾選自：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色氨酸氧化、谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供了一種調(diào)制t輔助細(xì)胞分化的方法，包括：令t輔助細(xì)胞與本文所述表位和/或核酸以及佐劑(可選)相接觸。本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供本文所述的表位和/或核酸，以及佐劑(可選)，用于調(diào)制t輔助細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供本文所述的表位和/或核酸以及佐劑(可選)在制備用于調(diào)制t輔助細(xì)胞分化的藥物中的用途。本發(fā)明所述方面中可用的表位可以是如本發(fā)明第一方面所述的表位，和/或可以是刺激對(duì)自體抗原的il-10免疫反應(yīng)的修飾后表位，所述表位的修飾選自：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色氨酸氧化、谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)。本發(fā)明中可用的表位和/或核酸可用于引導(dǎo)t輔助細(xì)胞分化，以刺激免疫應(yīng)答。如此一來(lái)，其可以與疫苗聯(lián)用，以提高所述疫苗的效力。如發(fā)明人所示，瓜氨酸化vim415-433多肽誘導(dǎo)了ifnγ/il-17應(yīng)答，暗示著th17應(yīng)答。這與使得t輔助細(xì)胞分化為itreg細(xì)胞的vim415-433和其他自體表位的正常應(yīng)答大為不同?？蛇x地，本發(fā)明中可用的表位和/或核酸可用于引導(dǎo)t輔助細(xì)胞分化以抑制免疫應(yīng)答。瓜氨酸化ing4產(chǎn)生il-10應(yīng)答，暗示著itreg應(yīng)答和免疫應(yīng)答受抑制。所述表位可用于治療需要免疫抑制的疾病，例如自體免疫性疾病和移植物抗宿主疾病(gvhd)。自體免疫疾病的例子包括：斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性?xún)?nèi)耳疾病、自身免疫性淋巴增生綜合征(alps)、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、白塞氏病(behcet’sdisease)、大皰性類(lèi)天皰瘡、心肌病、口炎性腹瀉-皮炎、慢性疲勞綜合征免疫缺陷綜合癥(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、瘢痕性類(lèi)天皰瘡、冷凝集素病、crest綜合癥、克羅恩病(crohn’sdisease)、惡性萎縮性丘疹病(dego’sdisease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盤(pán)狀紅斑狼瘡、原發(fā)性冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯病(grave’sdisease)、吉蘭-巴雷綜合征(guillain-barre)、橋本氏甲狀腺炎(hashimoto’sthyroiditis)、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、胰島素依賴(lài)性糖尿病(i型)、幼年型關(guān)節(jié)炎、狼瘡、美尼爾氏癥(meniere’sdisease)、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、polyglancular綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、雷諾氏現(xiàn)象(raynaud’sphenomenon)、賴(lài)特綜合征(reiter’ssyndrome)、風(fēng)濕熱、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征(sjogren’ssyndrome)、僵人綜合征(stiff-mansyndrome)、多發(fā)性大動(dòng)脈炎(takayasuarteritis)、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜風(fēng)和韋格納氏肉芽腫(wegener’sgranulomatosis)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供了一種預(yù)測(cè)結(jié)腸直腸癌生存期的方法，包括測(cè)定結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的肽?；彼崦搧啺坊?(pad4)水平。94％的腫瘤表達(dá)pad4。腫瘤細(xì)胞缺失pad4表達(dá)，表明預(yù)后不良，且暗示著降低的生存期。因此，若結(jié)腸直腸癌表現(xiàn)出的pad4表達(dá)極少或沒(méi)有，則患者具有不良預(yù)后。在不受理論約束的情況下，這可能與能被t細(xì)胞識(shí)別和殺滅的瓜氨酸化表位的缺失有關(guān)。因此，腫瘤逃避了免疫監(jiān)控。相反地，若腫瘤表達(dá)pad4，則目標(biāo)脫亞氨基化，腫瘤生長(zhǎng)受到免疫應(yīng)答的控制，患者的預(yù)后較好。pad4水平可以用抗體或測(cè)量細(xì)胞中的pad4蛋白的其他免疫分析來(lái)測(cè)定。可選地，pad4mrna水平可以用原位雜交來(lái)測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于測(cè)定mrna水平的適當(dāng)可選技術(shù)，以及測(cè)定蛋白水平的可選技術(shù)。90％的結(jié)腸直腸瘤表達(dá)了波形蛋白，其主要見(jiàn)于基質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)性細(xì)胞。15％的細(xì)胞中，也有些上皮細(xì)胞染色，且12％的腫瘤中，所有細(xì)胞中有超過(guò)75％被染色。結(jié)腸直腸瘤中僅6％未顯示出pad4特異性mab染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析顯示，pad4強(qiáng)度和存活之間具有相關(guān)性。在多變量模型中，tnm分期(p＝<0.0001)、血管入侵(p＝<0.0001)和pad4表達(dá)(p＝0.004)是患者生存期的獨(dú)立指標(biāo)，暗示著pad4能夠成為有用的結(jié)腸直腸癌預(yù)后指標(biāo)。pad4表達(dá)與bcl2(p＝0.01)、β-連環(huán)蛋白(p＝0.001)、cd8t細(xì)胞數(shù)量(p＝0.006),muc1(p＝0.000)、cea(p＝0.000)、cd59(p＝0.038)和波形蛋白(p＝0.000)均具有相關(guān)性，暗示著所有這些均可作為修飾后蛋白的標(biāo)靶。發(fā)明人所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，89％的卵巢瘤顯示出強(qiáng)烈的波形蛋白染色，而僅有4％未顯示抗pad4抗體染色。此外，82％還表達(dá)了瓜氨酸，暗示著該酶的活性。pad4的表達(dá)與應(yīng)激相關(guān)蛋白raet1e和ulbp1具有相關(guān)性，暗示著該酶在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下激活。其與波形蛋白之間也存在強(qiáng)烈相關(guān)性，暗示著瓜氨酸化波形蛋白是卵巢癌的良好標(biāo)靶。hmgb1在87％腫瘤中表達(dá)，且也與波形蛋白表達(dá)相關(guān)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，提供了一種預(yù)測(cè)卵巢癌生存期的方法，包括在卵巢癌細(xì)胞中測(cè)定肽?；彼崦搧啺坊?(pad2)和/或高遷移率族蛋白b1(hmgb1)的水平。91％的腫瘤表達(dá)pad2。腫瘤細(xì)胞缺失pad2表達(dá)，說(shuō)明預(yù)后不良，且暗示生存期下降。因此，若卵巢癌表現(xiàn)出極少或沒(méi)有pad2表達(dá)，則患者具有不良預(yù)后。在不受理論約束的情況下，這可能與缺乏能夠被t細(xì)胞識(shí)別和殺滅的瓜氨酸化表位有關(guān)。因此，腫瘤逃避了免疫監(jiān)控。相反地，若腫瘤表達(dá)pad2，則標(biāo)靶脫亞氨基化，腫瘤生長(zhǎng)受到免疫應(yīng)答的控制，則患者具有較好預(yù)后。發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，卵巢腫瘤中有16％表現(xiàn)出強(qiáng)烈的pad2染色。此外，91％仍表達(dá)瓜氨酸。pad2的表達(dá)與hmgb1表達(dá)相關(guān)，暗示著與自體吞噬相關(guān)；其也與mhc表達(dá)相關(guān)，暗示著與免疫應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。87％的腫瘤表達(dá)hmgb1。缺失hmgb1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞說(shuō)明預(yù)后較好，并暗示著生存期增加。hmgb1水平高的腫瘤具有強(qiáng)自體吞噬性，這是有力的存活機(jī)制，并與不良預(yù)后相關(guān)。因此，若卵巢癌表現(xiàn)出極少或無(wú)hmgb1表達(dá)，則說(shuō)明患者預(yù)后良好，低水平表達(dá)說(shuō)明預(yù)后較好，而高表達(dá)說(shuō)明預(yù)后不良。hmgb1水平可以使用抗體或其他免疫分析方法來(lái)測(cè)定，以測(cè)量細(xì)胞中的hmgb1蛋白?？蛇x地，hmgb1mrna水平可以通過(guò)原位雜交來(lái)測(cè)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于測(cè)定mrna水平的適當(dāng)可選技術(shù)，以及用于測(cè)定蛋白水平的可選技術(shù)。87％的卵巢腫瘤表達(dá)hmgb1，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)?？ㄆ仗m邁耶(kaplanmeier)存活分析表明，hmgb1水平與生存期之間存在相關(guān)性(p＝0.001)。在多變量模型中，tnm分期(p＝<0.0001)、腫瘤類(lèi)型(p＝0.031)、對(duì)化療的應(yīng)答(p＝<0.001)和hmgb1缺失(p＝0.002)是患者生存期的獨(dú)立制表，暗示著hmgb1可以是卵巢癌的有用預(yù)后指標(biāo)。在顯示出高h(yuǎn)mgb1和低pad2表達(dá)的患者中，310個(gè)患者中有219個(gè)(70％)具有最差中位生存期，即50個(gè)月，而具有低hmgb1和低pad2的患者的生存期較好，310個(gè)患者中有41個(gè)(13％)的中位生存期為101個(gè)月。在不受理論束縛的情況下，這可能與缺乏瓜氨酸化表位和缺乏自體吞噬性有關(guān)，腫瘤逃避了免疫監(jiān)控，具有不良存活能力。在哺乳動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)了5種pad同種型，各由不同基因編碼[60]。所有這些酶的活性均強(qiáng)烈依賴(lài)于ca2+的存在。pad的所有同種型均表現(xiàn)出廣泛的共有序列同源性。同種型之間最引人矚目的差異是它們的組織特異性表達(dá)。所有同種型均可在體外利用可利用的精氨酸將大多數(shù)蛋白瓜氨酸化[62]，雖然有些蛋白在個(gè)別pads作用下比其他蛋白瓜氨酸化更迅速[63]。對(duì)多肽的研究表明，精氨酸殘基側(cè)翼的某些氨基酸影響其對(duì)瓜氨酸化的敏感性[20]。所有這些酶的活性均強(qiáng)烈依賴(lài)ca2+的存在。pad的所有同種型均表現(xiàn)出廣泛的共有序列同源性。同種型之間最引人矚目的差異是它們的組織特異性表達(dá)。所有同種型均可在體外利用可用精氨酸將大多數(shù)蛋白瓜氨酸化[62]，雖然有些蛋白在個(gè)別pads作用下比其他蛋白瓜氨酸化更迅速[63]。對(duì)多肽的研究表明，精氨酸殘基側(cè)翼的某些氨基酸影響其對(duì)瓜氨酸化的敏感性[20]。最廣泛表達(dá)的pad同種型，pad2，存在于許多不同組織中，例如骨骼肌、大腦、脾腺和巨噬細(xì)胞。雖然其具有廣泛的表達(dá)模式，只有中央神經(jīng)系統(tǒng)中(其中生理性瓜氨酸化對(duì)延續(xù)髓鞘電絕緣性質(zhì)十分重要)的髓磷脂結(jié)合蛋白(mbp)，以及波形蛋白，被鑒定為天然基質(zhì)。在多發(fā)性硬化(一種cns的慢性炎性病癥)中，髓鞘被破壞，患者對(duì)瓜氨酸化的mbp產(chǎn)生自免疫應(yīng)答。在健康成人中，18％的mbp瓜氨酸化，而ms中，超過(guò)45％瓜氨酸化，導(dǎo)致去折疊和降解的增加。pad1主要在上皮和子宮中表達(dá)，而且，在角化細(xì)胞的成體終末分化中，角蛋白(k1和k10)和角蛋白相關(guān)蛋白絲聚合蛋白均瓜氨酸化。一般而言，瓜氨酸化降低蛋白質(zhì)上的電荷，導(dǎo)致心房去折疊，降低表皮彈性和角化。銀屑病是由pad1在銀屑病性表皮中的異常瓜氨酸化引起的。pad3被限制在毛發(fā)/毛絨的毛囊中，其天然基質(zhì)為毛透明蛋白，是毛囊內(nèi)根鞘的主要結(jié)構(gòu)蛋白。pad6由卵細(xì)胞和胚胎表達(dá)。炎性白血球包括滑膜t和b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，以及成纖維樣滑膜細(xì)胞，表達(dá)2種pad同種型，pad2和pad4[27,64]。不像其他pads都主要位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，pad4位于細(xì)胞核中。pad4的細(xì)胞核定位信號(hào)見(jiàn)于蛋白n端區(qū)域。pad4主要在外周血粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，還由許多腫瘤組織包括腺癌所表達(dá)[65]。免疫組織化學(xué)法還檢測(cè)出pad4和細(xì)胞角蛋白的共定位，免疫印跡法則在提取自腫瘤的細(xì)胞角蛋白中檢測(cè)到瓜氨酸信號(hào)。此外，體外瓜氨酸化的細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞角蛋白18、細(xì)胞角蛋白19抵抗半胱天冬酶的消化。這可能賦予腫瘤生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。外周白血球中檢測(cè)不到含瓜氨酸的蛋白，即使這些細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈的pad4表達(dá)。據(jù)推測(cè)，鈣濃度是激活pad4和后續(xù)瓜氨酸化的關(guān)鍵因素。此外，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)滑膜的瓜氨酸化主要發(fā)生在其胞外沉淀中，而瓜氨酸化蛋白則被定位于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。組蛋白的瓜氨酸化可以改變腫瘤中的基因表達(dá)，而ing4的瓜氨酸化抑制其與p53的結(jié)合，導(dǎo)致該有力腫瘤抑制基因的失活[66]。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括具有如上和/或如表3、8、9、10所列舉的氨基酸序列以及與其具有高度一致性(例如與其一致性為70％、80％、85％、80％、95％或99％)的序列的多肽，及其在醫(yī)藥中，尤其是在治療癌癥的方法中的用途。兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的一致性百分比通常由將序列以最優(yōu)化對(duì)照目的(例如，可以在第一序列中引入間隔來(lái)得到與第二序列的最佳比對(duì))進(jìn)行比對(duì)，并比較對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的氨基酸殘基或核苷酸。“最佳比對(duì)”是兩條序列之間獲得最高相似度的比對(duì)。一致性百分比的測(cè)定是通過(guò)比較序列中的相同氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)目來(lái)確定的(即，％一致性＝一致位點(diǎn)數(shù)目/位點(diǎn)總數(shù)目x100)。兩條序列之間的一致性百分比的測(cè)定，可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。用于比對(duì)兩條序列的數(shù)學(xué)算法的例子之一，為karlin和altschul改進(jìn)算法[67]。altschul,etal的nblast和xblast程序合并了所述算法[68]?？梢杂脁blast程序(score＝50,wordlength＝3)來(lái)執(zhí)行blast蛋白檢索，得到與本發(fā)明蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比對(duì)目的的空位比對(duì)，可以使用gappedblast，如[69]所述?？蛇x地，可以使用psi-blast來(lái)執(zhí)行重復(fù)檢索，以檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系。當(dāng)使用blast、gappedblast和psi-blast程序時(shí)，可以使用各程序(e.g.,xblastandnblast)的默認(rèn)參數(shù)。參見(jiàn)http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于序列比對(duì)的數(shù)學(xué)算法的另一例子為myers和miller的算法[70]。align程序(版本2.0)是gcg序列比對(duì)軟件包的一部分，合并了所述算法。本領(lǐng)域所知的用于序列分析的其他算法包括如[71]所述的advance和adam，以及如[72]所述的fasta。在fasta中，ktup是一個(gè)控制選項(xiàng)，用于設(shè)定搜索的敏感性和速度。本文中所稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“治療”包括能夠使人類(lèi)或非人類(lèi)的動(dòng)物受益的任何方案。所述多肽或核酸可與藥學(xué)可接受的一種或多種載體共同使用。所述載體可以包括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋葡萄糖、脂質(zhì)體、水、甘油、乙醇及其組合。本發(fā)明中可用的多肽可以是以fmoc化學(xué)法或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)合成?？梢灶A(yù)期，本發(fā)明的組合物的治療給藥的主要途徑是注射，但也可以使用導(dǎo)管或其他外殼用管來(lái)遞送。一些適當(dāng)?shù)慕o藥途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥。粉末制劑可以重構(gòu)為液體制劑后使用。對(duì)于靜脈內(nèi)注射或病痛部位注射，活性物質(zhì)將處于腸胃可接受的水溶液形式，其無(wú)熱原、ph適當(dāng)、等滲且保持穩(wěn)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用例如等滲賦形劑例如氯化鈉注射液、林格氏注射液(ringer’sinjection)或乳酸林格氏注射液(lactatedringer’sinjection)，熟練地制備適當(dāng)溶液。根據(jù)需要，可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其他添加劑?？诜o藥的藥用組合物可以是片劑、膠囊、粉劑或液體形式。片劑可以包括固體載體例如明膠，或佐藥。液體藥用組合物一般包括液體載體，例如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油、或合成油?？梢园ㄉ睇}溶液、右旋葡萄糖或其他糖類(lèi)溶液，或甘油例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)制劑為液體時(shí)，其可以是例如含有ph6.8-7.6的非磷酸緩沖液的生理鹽溶液，或凍干粉末。所述組合物可以在腫瘤部位或其他所需部位進(jìn)行局部給藥，或可以用靶向腫瘤或其他細(xì)胞的方式遞送給藥。所述組合物優(yōu)選為以“藥學(xué)有效劑量”對(duì)個(gè)體給藥，所述劑量足以令個(gè)體受益。給要得實(shí)際劑量、速率和時(shí)間進(jìn)程取決于治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，例如劑量的決策等，是全科醫(yī)生和其他醫(yī)生的職責(zé)范圍，且一般需要考慮到所知道的的病癥、患者的個(gè)別情況、遞送位點(diǎn)、給藥方法和醫(yī)師所知的其他因素。本發(fā)明的組合物尤其是涉及癌癥的治療，對(duì)所述病癥在初始治療或手術(shù)后的復(fù)發(fā)的預(yù)防。上述技術(shù)和方案的例子可以參見(jiàn)remington’spharmaceuticalsciences[73]。組合物可以單獨(dú)給藥或與其他治療一起給藥，其可以使同時(shí)給藥或相繼給藥，取決于所治療的病癥。其他癌癥治療包括本領(lǐng)域所知的其他單克隆抗體、其他化療藥劑、其他放療技術(shù)或其他免疫療法。本發(fā)明所述的組合物的一種具體應(yīng)用在于作為手術(shù)的輔助，即幫助降低腫瘤移除后再次復(fù)發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的組合物可以全部或部分通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。該化合物可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)液體法，或優(yōu)選地，固相多肽合成法，來(lái)便利地制備，所述方法的一般性描述隨處可得(例如參見(jiàn)solidphasepeptidesynthesis,2ndedition[74]、thepracticeofpeptidesynthesis[75]和appliedbiosystems430ausersmanual,abiinc.)；或者，其可以在溶液中通過(guò)液相法制備，或通過(guò)顧想法、液相法和溶液化學(xué)法的任意組合來(lái)制備，例如首先完成各個(gè)多肽部分，然后根據(jù)需要和是否適當(dāng)，在去除存在的任何保護(hù)性基團(tuán)后，通過(guò)各碳酸或磺酸或其反應(yīng)性衍生物的反應(yīng)來(lái)引入殘基x。另一種制備本發(fā)明組合物的便利方法在于，通過(guò)在表達(dá)體系中使用編碼所述組合物的核酸來(lái)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明組合物的核酸分離物。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了編碼如上所述的本發(fā)明組合物的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定仍提供本發(fā)明的組合物的所述核酸的取代、刪除和/或添加。所述核酸可以是dna、cdna或rna，例如通過(guò)克隆或化學(xué)合成產(chǎn)生的mrna。對(duì)于醫(yī)療用途，所述核酸形式優(yōu)選為能夠在治療對(duì)象中表達(dá)的形式。本發(fā)明中可用的多肽或本發(fā)明的核酸可以提供為分離物，處于分離和/或純化形式，或不含或基本不含其天然關(guān)聯(lián)的物質(zhì)。對(duì)于核酸而言，它可以不含或基本不含人類(lèi)基因組中的基因側(cè)翼核酸，但可能仍含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列。核酸可以全部或部分是合成的，且可以包括基因組dna、cdna或rna。當(dāng)本發(fā)明的核酸包含rna時(shí)，對(duì)所示序列的提及應(yīng)當(dāng)被理解為亦包含其等同rna(u被取代為t)。只要有了所述核酸序列和克隆，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很方便地制備編碼本發(fā)明中可用的多肽的核酸序列，例如使用本文所提供的信息和文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如參見(jiàn)[76,77])。所述技術(shù)包括(i)使用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)來(lái)擴(kuò)增所述核酸樣本，例如從基因組來(lái)源；(ii)化學(xué)合成；或(iii)制備cdna序列。編碼所述多肽的dna可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法來(lái)制備和使用，包括，取得編碼dna，在待表達(dá)部分兩端找到適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別位點(diǎn)，并從所述dna切取所述部分。該部分隨后可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)市售表達(dá)體系，可操作地連接在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子上，另一重組途徑是，以適當(dāng)pcr引物擴(kuò)增該dna的相關(guān)部分?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用定點(diǎn)突變來(lái)對(duì)所述序列進(jìn)行修飾，以獲得修飾后多肽的表達(dá)或考慮宿主細(xì)胞中用于表達(dá)所述核酸的優(yōu)選密碼子。本發(fā)明還提供含有至少一個(gè)上述核酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)組件形式的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供包括含有一個(gè)或多個(gè)上述結(jié)構(gòu)的重組宿主細(xì)胞。如上所述，編碼本發(fā)明組合物的核酸構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面；制備所述組合物的方法也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包括編碼核酸的表達(dá)。通過(guò)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)含有所述核酸的重組宿主細(xì)胞，能夠便利地使其表達(dá)。表達(dá)制備后，可以使用任何適當(dāng)技術(shù)來(lái)分離和/或純化組合物，并適當(dāng)使用。各種不同宿主細(xì)胞中的多肽克隆和表達(dá)體系是眾所周知的。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌、哺乳類(lèi)細(xì)胞、酵母和桿狀病毒體系。本領(lǐng)域可用于表達(dá)異源多肽的哺乳類(lèi)細(xì)胞系，包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、hela細(xì)胞、倉(cāng)鼠崽腎細(xì)胞、nso小鼠黑色素瘤細(xì)胞和許多其他細(xì)胞。常見(jiàn)的優(yōu)選細(xì)菌宿主為e.coli。抗體和抗體片段在原核細(xì)胞(如e.coli)中的表達(dá)為本領(lǐng)域所熟知。參見(jiàn)文獻(xiàn)[78]的綜述。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可選擇使用在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)，來(lái)生成特異性結(jié)合成分，參見(jiàn)例如文獻(xiàn)[79,80]中的近期綜述?？梢赃x擇或構(gòu)件含有適當(dāng)調(diào)控序列的適當(dāng)載體，所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子序列、終止序列、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其他適當(dāng)序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒(如噬菌體)或噬菌粒，視需要而定。更多詳情參見(jiàn)例如molecularcloning:alaboratorymanual[76]。shortprotocolsinmolecularbiology[77]中詳細(xì)記載了許多核酸操作的已知技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方案，例如核酸結(jié)構(gòu)的制備、誘變、測(cè)序、dna引入細(xì)胞和基因表達(dá)、蛋白分析。因此，本發(fā)明的又一方面中，提供一種含有本文所公開(kāi)的核酸的宿主細(xì)胞，其可以被分離。在又一個(gè)方面中，提供一種方法，包括將所述核酸引入宿主細(xì)胞。所述引入可以使用任何可用技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，適當(dāng)?shù)募夹g(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、deae-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，和使用反轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒(例如牛痘，或?qū)ハx(chóng)細(xì)胞而言，桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，適當(dāng)?shù)募夹g(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該引入的后續(xù)可以是引發(fā)或允許該核酸的表達(dá)，例如通過(guò)在該基因的表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸被整合入宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)包含促進(jìn)與該基因組重組的序列來(lái)促進(jìn)整合。本發(fā)明還提供了一種方法，包括在表達(dá)體系中使用上述結(jié)構(gòu)以表達(dá)如上所述的多肽。本發(fā)明的每個(gè)方面中的優(yōu)選特征，可在必要的細(xì)節(jié)變更基礎(chǔ)上用于其他方面。本文中提到的現(xiàn)有技術(shù)文件在法律允許的最大范圍內(nèi)并入本文。實(shí)施例下面將引用以下實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步描述本發(fā)明。圖1：蛋白質(zhì)中的精氨酸向瓜氨酸的酶促轉(zhuǎn)化由pad催化。圖2：人波形蛋白的氨基酸序列。圖3：限定上皮向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(emt)及其相反過(guò)程(間葉細(xì)胞向上皮轉(zhuǎn)化)的相關(guān)表型變化。本圖引自[81]。圖4：cd4+t細(xì)胞亞種群。cd4+t細(xì)胞的主要種群為th1、th2和th17，以及itregs。treg控制免疫效應(yīng)器細(xì)胞的應(yīng)答。本圖引自kaufmann[81]。圖5：cd4t細(xì)胞對(duì)抗體dna中編碼的輔助表位的應(yīng)答。用基因槍以cdrl1或cdrh3中含有輔助表位的抗體dna結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr4或hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。所有小鼠均在第0、7、14天時(shí)免疫接種三次。第20天時(shí)，采用ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)分析對(duì)所述輔助表位對(duì)相關(guān)輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的特異性應(yīng)答進(jìn)行間接體內(nèi)分析。應(yīng)答測(cè)量為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖6：對(duì)插入huigg1抗體dna雙表達(dá)載體cdrh3位點(diǎn)的波形蛋白28-49輔助表位進(jìn)行體內(nèi)加工、瓜氨酸化和呈遞。連續(xù)3周每周一次用基因槍以抗體dna結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。第19天時(shí)，通過(guò)(i)ifnγ(ii)il-17和(iii)il-2酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法以濃度為5μm的波形蛋白28-49野生型和瓜氨酸化(cit)多肽對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析圖7：對(duì)插入huigg1抗體dna雙表達(dá)載體cdrh3位點(diǎn)的波形蛋白415-433輔助表位進(jìn)行體內(nèi)加工、瓜氨酸化和呈遞。連續(xù)3周每周一次用基因槍以抗體dna結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。第19天時(shí)，通過(guò)(i)ifnγ(ii)il-17和(iii)il-2酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法以濃度為5μm的波形蛋白415-433野生型和瓜氨酸化多肽對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析。圖8：以編碼mmp-7輔助表位的抗體dna結(jié)構(gòu)免疫接種誘導(dǎo)dr1小鼠的cd4應(yīng)答。用基因槍以含有mmp-7247輔助表位的抗體dnahuigg1結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。所有小鼠均在第0、7、14天時(shí)免疫接種三次。第20天時(shí)，通過(guò)(i)ifnγ(n＝14)和(ii)il-17(n＝14)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法對(duì)輔助表位對(duì)mmp7人247野生型和瓜氨酸化多肽的特異性應(yīng)答進(jìn)行體外分析。應(yīng)答測(cè)量為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖9：抗體dna中編碼的nyeso1119-143cd4表位刺激cd4應(yīng)答，伴隨著抗腫瘤應(yīng)答。第0天時(shí)以2.5x104b16hhdiinyeso-1細(xì)胞注入hhdii/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠在第3、10和17天時(shí)用基因槍以在cdrl1位點(diǎn)上含有輔助表位nyeso-1119-143的抗體dnahuigg1dna免疫接種。(i)第20天時(shí)，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法對(duì)輔助表位對(duì)野生型、瓜氨酸化nyeso-1119-143輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的特異性應(yīng)答進(jìn)行體外分析。應(yīng)答測(cè)量為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。(ii)以nyeso-1抗體dna單獨(dú)免疫接種或與homspera佐劑免疫接種或以homspera佐劑單獨(dú)免疫接種的動(dòng)物存活。圖10：來(lái)自全抗原dna結(jié)構(gòu)的波形蛋白28-49和415-433表位進(jìn)行體內(nèi)加工、瓜氨酸化和呈遞。連續(xù)3周每周1次通過(guò)基因槍以編碼鼠波形蛋白的dna結(jié)構(gòu)或通過(guò)皮下注射以cpg/mpla中的vim28-49和415-433瓜氨酸化多肽，來(lái)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。第19天，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以濃度為5μm的28-49和415-433野生型和瓜氨酸化多肽對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析。圖11：對(duì)比以人野生型和瓜氨酸化波形蛋白28-49多肽免疫接種獲得的hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠的cd4應(yīng)答。第0天以25μg波形蛋白28-49人野生型或瓜氨酸化多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第14天時(shí)，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析，對(duì)(a)濃度為5μm的波形蛋白28-49和415-433野生型和瓜氨酸化多肽，通過(guò)(i)ifnγ(ii)il-17(iii)il-2(iv)il-10的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析；(b)瓜氨酸化表位特異性應(yīng)答的親抗原性，通過(guò)ifnγ和il-17的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)量對(duì)遞增多肽濃度的應(yīng)答進(jìn)行分析；(c)5μm的波形蛋白28-49三聚、二聚和單體瓜氨酸化多肽，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖12:vim28-49、415-433、瓜氨酸化vim28-49、瓜氨酸化415-433多肽與hla-dr0401在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的結(jié)合度。將多肽與源自流行性感冒(ha306-318)的預(yù)定濃度的生物素化多肽混合，然后分析與純化hla-dr0401的結(jié)合度。使用未標(biāo)記的ha306-318多肽作為陽(yáng)性對(duì)照。圖13：對(duì)比以人野生型和瓜氨酸化波形蛋白415多肽免疫接種獲得的hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠的cd4應(yīng)答。第0天以25μg波形蛋白人野生型或瓜氨酸化415多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第14天時(shí)，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析，對(duì)(a)濃度為5μm的波形蛋白415野生型和瓜氨酸化多肽，通過(guò)(i)ifnγ(ii)il-17(iii)il-2(iv)il-10的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析；(b)瓜氨酸化表位特異性應(yīng)答的親抗原性，通過(guò)ifnγ和il-17的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)量對(duì)遞增多肽濃度的應(yīng)答進(jìn)行分析。應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖14：hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠的以人瓜氨酸化波形蛋白415多肽免疫接種獲得的cd4應(yīng)答以及與等同的鼠瓜氨酸化多肽的交叉反應(yīng)性。第0天以25μg波形蛋白人瓜氨酸化415-433多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第14天時(shí)，通過(guò)(i)ifnγ(ii)il-17的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，對(duì)濃度為5μm的人和鼠瓜氨酸化波形蛋白415對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析。應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖15：驗(yàn)證hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中以(a)人瓜氨酸化波形蛋白415多肽和(b)瓜氨酸化波形蛋白28多肽免疫接種獲得的t細(xì)胞應(yīng)答是cd4應(yīng)答。第0天以25μg波形蛋白人瓜氨酸化415-433多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第14天時(shí)，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，在存在或不存在l243hla-dr阻斷抗體的情況下，以濃度為5μm的人瓜氨酸化波形蛋白415或28多肽對(duì)全脾細(xì)胞或清空cd4的脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析。應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖16：hla-dr4和hla-a2/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中以瓜氨酸化波形蛋白65多肽免疫接種獲得的cd4應(yīng)答。第0天以25μg波形蛋白65瓜氨酸化多肽對(duì)(a)hla-dr4或(b)hla-a2/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第14天時(shí)，通過(guò)ifnγ、il-17或il-10的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以濃度為5μm的波形蛋白65野生型和瓜氨酸化多肽，對(duì)全脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析；(c)第14天時(shí)，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，在存在或不存在l243hla-dr阻斷抗體的情況下，以濃度為5μm的人波形蛋白瓜氨酸化65多肽對(duì)全脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析；應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。(d)對(duì)脾細(xì)胞中cd8、ifnγ和tnfα的免疫熒光染色和facs分析。(e)第14天，以人瓜氨酸化波形蛋白65多肽脈沖lps沖擊來(lái)對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激。刺激后6天，以鉻釋放試驗(yàn)來(lái)評(píng)估ctl系溶解以瓜氨酸化人波形蛋白65多肽和t2細(xì)胞或單獨(dú)以b16hhd沖擊的t2或b16hhd腫瘤細(xì)胞的能力。應(yīng)答測(cè)定為％細(xì)胞毒性。圖中所示的p值是針對(duì)目標(biāo)：效應(yīng)器比例100:1顯示的)通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以最低預(yù)測(cè)值的野生型和瓜氨酸化hla-a2結(jié)合短多肽波形蛋白68和65以及濃度為5μm的野生型和瓜氨酸化波形蛋白65多肽，對(duì)來(lái)自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析；應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。(g)通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，分析免疫接種小鼠的脾細(xì)胞對(duì)瓜氨酸化和野生型vim65和vim68多肽以及el4hhd和b16腫瘤靶細(xì)胞的應(yīng)答。圖17：在存在或不存在天然t調(diào)控細(xì)胞的存在下，生成的對(duì)鼠波形蛋白415-433瓜氨酸化多肽的輔助應(yīng)答。第0天以25μg鼠形蛋白415-433瓜氨酸化多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。免疫接種3天前，使用抗cd25單克隆抗體(pc61)耗盡t調(diào)控細(xì)胞。第14天，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以瓜氨酸化鼠波形蛋白415多肽滴定濃度來(lái)分析脾細(xì)胞。圖18：佐劑影響對(duì)瓜氨酸化波形蛋白415和28多肽的應(yīng)答中的th1/th17平衡。以alum、ifa、gmcsf、mpla和cpg或tmx201為佐劑的人瓜氨酸化波形蛋白415-433和28-49多肽(25μg)進(jìn)行皮下給藥。免疫接種14天后，通過(guò)i)ifnγ、(ii)il-17和(iii)il-10酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，以野生型多肽和瓜氨酸化多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照，來(lái)分析脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖19：抗ctla-4mab提高對(duì)瓜氨酸化波形蛋白415多肽的應(yīng)答的親抗原性。第0、7、14天時(shí)，以25μg人瓜氨酸化波形蛋白415多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。半數(shù)小鼠還在第0、7、14天時(shí)接受了抗ctla-4mab。第21天，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外分析，(i)用5μm瓜氨酸化波形蛋白415進(jìn)行ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)；(ii)在ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定對(duì)遞增多肽濃度的表位特異性應(yīng)答的親抗原性。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖20：從患者分離的外周血單核細(xì)胞(pbmc’s)對(duì)野生型和瓜氨酸化多肽的增殖應(yīng)答。以10μg/ml的(i)野生型和瓜氨酸化人波形蛋白415-433多肽、(ii)野生型和瓜氨酸化人波形蛋白28-49多肽、(iii)野生型和瓜氨酸化人波形蛋白65-77多肽和(iv)瓜氨酸化nyeso-1119-143多肽，培養(yǎng)患者的pbmc’s4、7和11天。添加3[h]–胸腺嘧啶核苷以分析淋巴細(xì)胞增殖。增殖應(yīng)答測(cè)定為刺激指數(shù)(si)。si計(jì)算為受刺激多肽cpm平均值與未受刺激培養(yǎng)物cpm平均值之比值。圖21：a)腫瘤表達(dá)pad2的卵巢癌患者的卡普蘭邁耶存活曲線(xiàn)。b)腫瘤表達(dá)hmgb1的卵巢癌患者的卡普蘭邁耶存活曲線(xiàn)。c)腫瘤表達(dá)pad2和hmgb1的卵巢癌患者的卡普蘭邁耶存活曲線(xiàn)。d)腫瘤表達(dá)pad4的結(jié)腸直腸癌患者的卡普蘭邁耶存活曲線(xiàn)。圖22：第0、7、14天以cpg和mpla為佐劑的瓜氨酸化人波形蛋白415-433多肽(b)或瓜氨酸化vim28-48多肽(c)或兩者(a,d&e)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。a：第14天，通過(guò)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，在存在或不存在3-ma或ci-脒的情況下，以5μm的人瓜氨酸化或未瓜氨酸化波形蛋白415和28多肽，以及通過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)自體吞噬的b16dr4腫瘤細(xì)胞，分析脾細(xì)胞。b-e：通過(guò)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，分析間接體內(nèi)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的上清液中存在的顆粒酶b。圖23：腫瘤細(xì)胞的體外殺滅。(ai)第0、7、14天以cpg和mpla為佐劑的瓜氨酸化人波形蛋白415-433多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。第19天，以人瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽脈沖沖擊來(lái)體外刺激脾細(xì)胞。刺激后6天，使用鉻釋放試驗(yàn)來(lái)評(píng)估ctl系對(duì)以瓜氨酸化人波形蛋白415-433多肽脈沖的dr4脾細(xì)胞、以瓜氨酸化人波形蛋白415-433多肽脈沖的t2dr4腫瘤細(xì)胞、單獨(dú)的t2dr4細(xì)胞的溶解能力。應(yīng)答測(cè)定為％細(xì)胞毒性。圖中所示p值針對(duì)的是靶細(xì)胞：效應(yīng)器細(xì)胞比例10:1。對(duì)20:1和40:1的p值也高度顯著p<0.0001。(aii)第0、7和14天用以cpg和mpla為佐劑的瓜氨酸化人波形蛋白28-49多肽對(duì)hhd/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。第19天，以人瓜氨酸化波形蛋白28-49多肽脈沖沖擊對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激。刺激后6天，使用鉻釋放試驗(yàn)來(lái)評(píng)估ctl系對(duì)以瓜氨酸化人波形蛋白28-49多肽脈沖的t2dr1腫瘤細(xì)胞、單獨(dú)的t2dr1細(xì)胞、單獨(dú)的t2細(xì)胞的溶解能力。應(yīng)答測(cè)定為％細(xì)胞毒性。圖中所示p值針對(duì)的是靶細(xì)胞：效應(yīng)器細(xì)胞比例12.5:1且p值顯著。對(duì)25:1(t2dr1p＝0.0017,t2dr1+vim28citp<0.0001)和50:1(t2dr1p＝0.0008,t2dr1+vim28citp＝0.0005)的p值均高度顯著。圖24：瓜氨酸化波形蛋白415-433和波形蛋白28-49cd4應(yīng)答影響抗腫瘤免疫應(yīng)答。第0天，向hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠注射2.5x104b16f1-dr4細(xì)胞。(a)第4、11和18天，用對(duì)照抗體dna，或在cdrh3編碼hla-dr4限制性vim415輔助表位的抗體dna疫苗，或以mpla和cpg為佐劑的鼠瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25μg)，使用基因槍對(duì)小鼠皮下給藥免疫接種。(i)(b)第4、11和18天，用對(duì)照抗體dna，或在cdrh3編碼hla-dr4限制性vim28輔助表位的抗體dna疫苗，或以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化或野生型波形蛋白28-49多肽(25μg)，使用基因槍對(duì)小鼠皮下給藥免疫接種。(c)用以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25μg)或波形蛋白28-49或兩者(25μg)，對(duì)小鼠皮下給藥免疫接種。(d)用以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25μg)聯(lián)合抗cd4抗體(克隆gk1.5)，對(duì)小鼠皮下給藥免疫接種。(e)用以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白28-49多肽(25μg)聯(lián)合抗cd4抗體(克隆gk1.5)，對(duì)小鼠皮下給藥免疫接種。圖25：瓜氨酸化波形蛋白415-433和波形蛋白28-49的抗腫瘤免疫應(yīng)答部分由ifnγ和il-17介導(dǎo)。第0天，向hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠注射2.5x104b16f1-dr4細(xì)胞。用以mpla和cpg為佐劑的(a和c)瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25μg)或(b和d)波形蛋白28-49多肽(25μg)；在存在或不存在ifnγ中和單克隆抗體(a和b)或il-17中和抗體(c和d)的情況下，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫接種。圖26：瓜氨酸化波形蛋白415-433抗腫瘤免疫應(yīng)答，而非波形蛋白28-49抗腫瘤免疫應(yīng)答，部分受到腫瘤細(xì)胞上的hla-dr0401的直接識(shí)別的介導(dǎo)。第0天以(a)2.5x104b16f1細(xì)胞或(b)b16f1-dr4細(xì)胞注射hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠。以(a)以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25μg)或波形蛋白28-49多肽(25μg)或兩者；(b)以mpla和cpg為佐劑的波形蛋白415-433多肽(25μg)，在存在或不存在hla-dr0401中和單克隆抗體的情況下，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫接種。圖27：不同物種間的波形蛋白同源性。圖28：篩選波形蛋白中刺激t細(xì)胞應(yīng)答的新型表位。用以mpla和cpg為佐劑的人瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白多肽(3x10μg)皮下給藥。a)hla-a2/dr1和b)c57/blmice小鼠免疫接種14天后，通過(guò)對(duì)輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的(i)ifnγ和(ii)il-17酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。c)用以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化vim14多肽皮下給藥。免疫接種14天后，通過(guò)對(duì)輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖29：篩選細(xì)胞角蛋白8中刺激t細(xì)胞應(yīng)答的新型表位。用以mpla和cpg為佐劑的人瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白多肽(3x10μg)皮下給藥。a)hla-a2/dr1和b)c57/blmice小鼠免疫接種14天后，通過(guò)對(duì)輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的(i)ifnγ和(ii)il-17酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖30：野生型波形蛋白刺激分泌il-10的itreg細(xì)胞應(yīng)答。用以mpla和cpg為佐劑的人415波形蛋白多肽(25μg)皮下給藥。hla-dr4小鼠免疫接種14天后，通過(guò)對(duì)輔助多肽和無(wú)關(guān)對(duì)照的(i)ifnγ,(ii)il-17和(iii)il-10酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖31：瓜氨酸化ing4刺激cd4應(yīng)答。第0、7、14天，用以mpla和cpg為佐劑的瓜氨酸化ing4多肽158-174多肽(25μg)皮下給藥。對(duì)hla-a2/dr1最后一次免疫接種后7天，在存在或不存在hla-dr阻斷單克隆抗體的情況下，用對(duì)輔助多肽的ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)試hla-a2/dr1小鼠脾細(xì)胞對(duì)輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖32：本發(fā)明中可用表位的蛋白質(zhì)在通用蛋白質(zhì)庫(kù)中的來(lái)源索引。圖33：全抗原波形蛋白dna誘導(dǎo)瓜氨酸化波形蛋白特異性t細(xì)胞應(yīng)答。在第0、7、14天，通過(guò)基因槍以1μg編碼全鼠波形蛋白序列的dna對(duì)(a)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠或(b)hla-a2/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。第20天，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，分析脾細(xì)胞對(duì)一組跨全蛋白的瓜氨酸化波形蛋白多肽的ifnγ應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。圖34：預(yù)測(cè)多肽的瓜氨酸特異性免疫應(yīng)答的篩選。第0、7、14天用以cpg和mpla佐劑的源自bip,hsp90和ing4的預(yù)測(cè)瓜氨酸化多肽(25ug)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行皮下給藥。第14天或20天，通過(guò)ifng酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，分析脾細(xì)胞對(duì)相關(guān)瓜氨酸化和未修飾多肽(5um)和背景對(duì)照的免疫應(yīng)答。應(yīng)答測(cè)定為平均斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞。方法2.1.市售mabs從abcam購(gòu)入一級(jí)兔抗人波形蛋白(克隆epr3776)、兔抗人pad2(克隆pab0197)、兔抗人瓜氨酸(克隆ab6464)。從covalab購(gòu)得一次兔抗人pad-4(克隆pab0199)并從ebioscience購(gòu)得抗人hla-drpe-cy7標(biāo)記抗體(克隆l243)。從bioxcell購(gòu)得抗-cd25抗體(克隆pc61)、抗ifnγ抗體(克隆xmg1.2)、抗il-17(克隆17f3)抗體和抗cd4(克隆gk1.5)抗體。通過(guò)瓊脂糖蛋白g親和層析法從hb304雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(atcc,usa)中純化抗ctla4抗體。通過(guò)瓊脂糖蛋白g親和層析法從hb-55雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(atcc,usa)中純化抗hla-dr抗體。從cellsignalingtechnology公司購(gòu)入兔mab抗hmgb1(克隆d3e5)。2.2.細(xì)胞系t細(xì)胞/b細(xì)胞雜交細(xì)胞系t2[80]以功能ii型dr4(drb1*0401；t2dr4)或dr1(drb1*0101；t2dr1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在文獻(xiàn)中已有記述[82,83]，并由janiceblum博士和lawrencestern教授友情提供。小鼠黑色素瘤b16f1和b16f10細(xì)胞系來(lái)自atcc。除非另有說(shuō)明，否則所有細(xì)胞系均在補(bǔ)充了10％fcs、l-谷氨酰胺(2mm)和碳酸氫鈉緩沖液的rpmi培養(yǎng)基1640(gibco/brl)中培養(yǎng)。hb304雜交瘤細(xì)胞在雜交瘤sfm(invitrogen,uk)中進(jìn)行培養(yǎng)。為了生成呈遞瓜氨酸化表位的腫瘤標(biāo)靶用于體外分析，4℃下以含1％bsa的0.1m檸檬酸(ph3.0)處理細(xì)胞2分鐘，然后以培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并37℃無(wú)血清培養(yǎng)20小時(shí)。該20小時(shí)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)中，添加了自噬和pad抑制劑，即終濃度分別為10nm和50μg/ml的3-甲基腺嘌呤(sigma)和ci-脒(calbiochem)。2.3.免疫原2.3.1多肽通過(guò)多肽合成材料(fareham,uk)合成大于90％純度的多肽。-80℃凍干貯藏在0.2mg小份中。使用時(shí)，以10％二甲基甲酰胺重建適當(dāng)濃度。2.4.質(zhì)粒其他文獻(xiàn)已詳細(xì)敘述了抗體dna結(jié)構(gòu)的生成[84]。簡(jiǎn)單而言，為了生成抗體dna結(jié)構(gòu)，使用標(biāo)準(zhǔn)分析生物學(xué)技術(shù)將表位并入抗體的輕鏈可變域和重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)中。將來(lái)自表位酪氨酸酶448-462(dysylqdsdpdsfqd)、鼠和人hla-dr4gp10044-59表位(wnrqlypewtevqgsn/wnrqlypewteaqrld)和來(lái)自hepb核蛋白128-140(tppayrppnapil)的i-ab限制性表位限制性輔助cd4表位插入取代κ鏈的cdrl1。相似地，來(lái)自表位mmp7247-262(sqddikgqklygkrs)、ssx233-48(keewekmkasekify)、nyeso-187-111(llefylampfatpmeaelarrslaq)和119-143(pgvllkeftvsgniltirltaadhr)的hla-dr1限制性輔助cd4表位并入cdrl1，而來(lái)自表位磷酸丙糖異構(gòu)酶23-37(geligilnaakvpad)的修飾后表位被插入取代κ鏈的cdrl3。hla-dr4限制性cd4波形蛋白415-433(lpnfsslnlretnldslpl)和hla–dr128-49(rsyvttstrtyslgsalrpsts)限制性表位均被并入cdrh3。dr1cd4nyeso-187-111(llefylampfatpmeaelarrslaq)也被編碼在克隆入抗體dna雙表達(dá)載體中的擴(kuò)展序列83-111中。還生成了含有全部3種波形蛋白表位的人igg1和鼠igg2a免疫體載體。hla–dr128-49(rsyvttstrtyslgsalrpsts)、65-77(savrlrssvpgvr)和hla-dr4限制性人cd4波形蛋白415-433(lpnfsslnlretnldslpl)表位分別并入cdrh1、cdrh2和cdrh3。將來(lái)自從b16f1細(xì)胞系分離得到的mrna的全長(zhǎng)序列作為模版cdna，通過(guò)擴(kuò)增生成質(zhì)粒pvaxi鼠全長(zhǎng)波形蛋白。所用的正反向引物分別設(shè)計(jì)為并入hindiii和bamhi位點(diǎn)。通過(guò)野生型序列的擴(kuò)增和確認(rèn)，將全長(zhǎng)鼠波形蛋白并入哺乳類(lèi)表達(dá)載體pvaxi(invitrogen)的多克隆位點(diǎn)的hindiii/bamhi位點(diǎn)。為了生成質(zhì)粒pvitro2，從轉(zhuǎn)基因hla-dr4小鼠的脾細(xì)胞中分離得到mrna，并以此生成嵌合hla-dr4cdna。將其用作模版，以分別含有fspi/ecori和bamhi/sali位點(diǎn)的正向和反向引物來(lái)分別擴(kuò)增嵌合α鏈和β鏈。在序列確認(rèn)中，由鼠h2-ea和hla-draα1域組成的人全長(zhǎng)嵌合α鏈結(jié)合在載體pvitro2-hygro-mcs(invivogen)的fspi/ecorimcs2位點(diǎn)中。由鼠h2-eb和人drb1*0401β1域組成的β鏈隨后與嵌合α鏈一同插入載體的bamhi/salimcs1位點(diǎn)。為了生成hhd質(zhì)粒，從el4-hhd細(xì)胞分離全rna并以此合成cdna。將其用作模版以利用正向和反向引物擴(kuò)增hhd，并亞克隆入pcr2.1中。隨后將hhd鏈插入購(gòu)自invitrogen的哺乳類(lèi)表達(dá)載體pcdna3.1的ecorv/hindiii位點(diǎn)，所述hhd鏈包括人hla-a2前導(dǎo)，和通過(guò)甘氨酸絲氨酸連接子共價(jià)連接至人hla-0201mhc1類(lèi)分子的α1和2域及小鼠h-2db1類(lèi)分子的α3跨膜和胞漿區(qū)的人b2微球蛋白分子。為了構(gòu)建編碼鼠tap2和nyeso-1全長(zhǎng)鏈的哺乳類(lèi)雙表達(dá)質(zhì)粒，用從geneservice公司購(gòu)得的image克隆40146393以分別包含bamh1/xhoi位點(diǎn)的正向和反向引物擴(kuò)增nyeso-1。在序列確認(rèn)中，將全長(zhǎng)nyeso-1連接到抗體dna雙表達(dá)載體的bamhi/xho1多克隆位點(diǎn)上，取代輕鏈。用從編碼序列移除了hindiii位點(diǎn)并將其插入在起始密碼子前的映像克隆6530488來(lái)擴(kuò)增鼠tap2，并使用hindiii/ecorv將其克隆入表達(dá)載體porighib。然后，使用hindiii/avrii將鼠tap2與全長(zhǎng)nyeso-1一道轉(zhuǎn)移至雙表達(dá)載體中，取代重鏈。為了降低鼠b2微球蛋白和鼠mhcii類(lèi)在細(xì)胞系b16f10中的表達(dá)，使用了rna干擾。將靶定鼠b2微球蛋白的序列266和鼠mhcii類(lèi)序列159的互補(bǔ)寡核苷酸退火并分別插入pcdna6.2gwmir(invitrogen)中。使用bamhi/xhoi切離含有mirna266的mirna前體表達(dá)組件，并連接到pcdna6.2gwmir159的xhoi/bglii位點(diǎn)上，以將兩條mirna鏈連接在一起，并在相同載體中的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中表達(dá)。使用qiagen無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(endofreeqiagenmaxiprepkit，qiagen,crawley)生成不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒dna。2.5.轉(zhuǎn)染使用質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染劑以編碼全長(zhǎng)ny-eso-1和鼠tap2、hhdii和sirna的表達(dá)載體，相繼轉(zhuǎn)染b16f10細(xì)胞，以降低鼠mhcii類(lèi)和鼠β2微球蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別在博來(lái)霉素(300μg/ml)、g418(500μg/ml)和殺稻瘟菌素(4μg/ml)的存在下進(jìn)行生長(zhǎng)選擇。通過(guò)有限稀釋法克隆細(xì)胞系，并通過(guò)流式細(xì)胞儀確認(rèn)表達(dá)。根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明，使用質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染劑(invitrogen)以4μg編碼全長(zhǎng)嵌合α和β鏈的質(zhì)粒pvitro2嵌合hla-dr401來(lái)轉(zhuǎn)染b16f1細(xì)胞。在潮霉素b(200μg/ml)的存在下選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)有限稀釋法克隆細(xì)胞系，并使用購(gòu)自ebioscience的hla-drpe-cy7標(biāo)記抗體(克隆l243)抗人通過(guò)流式細(xì)胞儀確認(rèn)表達(dá)。2.6hladr0401結(jié)合實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單而言，將濃度遞增的實(shí)驗(yàn)多肽與預(yù)定濃度的生物素化ha306-318對(duì)照多肽混合，并添加到固定在板上的hladr0401中。與hladr0401結(jié)合的生物素化對(duì)照多肽的量，使用鏈霉親和素標(biāo)記酶步驟和隨后的顯色底物檢測(cè)來(lái)進(jìn)行量化。將生物素化ha306-318多肽單獨(dú)達(dá)到的數(shù)值看作最大結(jié)合度。作為陽(yáng)性對(duì)照，未標(biāo)記ha306-318多肽用于與生物素化ha306-318多肽競(jìng)爭(zhēng)。2.7.免疫接種2.7.1免疫接種方案使用了8-12周齡的c57bl/6小鼠(charlesriver,uk)、hla-dr4小鼠(taconic,usa)、hhdii小鼠(pasteurinstitute,france)和hhdii/dr1小鼠(pasteurinstitute,france)，由諾丁漢倫特大學(xué)(nottinghamtrentuniversity)的員工照顧。所有工作均由英國(guó)內(nèi)政部項(xiàng)目許可證授權(quán)。將多肽在10％二甲基甲酰胺中制為1mg/ml溶液并以不同佐劑進(jìn)行乳化(系列稀釋)：cpg和mpla各為6μg/小鼠(invivogen,uk)、弗氏不完全佐劑50μl/小鼠(sigma,uk)，以及gmcsf10μg/小鼠(peprotech,uk)。在尾根處皮下注射多肽(25μg/小鼠)。根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明將dna(1μg/小鼠)涂布在1.0μm金顆粒(biorad,hemelhempstead,uk)上，并以基因槍(biorad)皮內(nèi)給藥。使用基因槍皮下注射地免疫接種homspera(10nm/小鼠)(peptidesynthetics,uk)。小鼠在第0天免疫接種多肽，或在第0、7、14天進(jìn)行多肽和基因槍免疫接種。除非另有說(shuō)明，否則第14天摘除脾臟并分析多肽，第20天則摘除分析多肽或基因槍接種。免疫接種前3天，以含400μg抗cd25抗體(pc61)的鹽水腹腔注射(i.p.)給藥。免疫接種第7和第14天，用基因槍或多肽免疫接種以含200μg抗ctla-4抗體(uc10-4f10-11)的鹽水腹腔注射(i.p.)給藥。對(duì)于腫瘤激發(fā)實(shí)驗(yàn)，在基礎(chǔ)免疫3天前，以2.5x104b16hhdiinyeso/tap2siβ2m1f10細(xì)胞或b16dr42e7細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行右側(cè)皮下給藥，然后如上所述地進(jìn)行免疫。腫瘤植入后第2、7、11和14天，以含抗ifnγ抗體(300μg/劑)、抗il-17抗體(200μg/劑)和抗hla-dr抗體(300μg/劑)的鹽水進(jìn)行腹腔注射給藥。在腫瘤植入后的第2和8天以含抗cd4抗體(500μg/劑)的鹽水進(jìn)行腹腔注射給藥。以3-4天為間隔時(shí)間監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)，一旦腫瘤直徑達(dá)到≥10mm，即將小鼠安樂(lè)死。2.8.免疫應(yīng)答分析2.8.1間接體內(nèi)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法分析根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明(mabtech,sweden)，使用ifnγ、il-17和il-10捕獲和檢測(cè)試劑進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析(elispot)。簡(jiǎn)單而言，將抗ifnγ、il-17和il-10抗體涂布在96孔immobilin-p板的孔上。將合成多肽(各種濃度)和每孔5x105的脾細(xì)胞加入所述板孔中，一式三聯(lián)。將癌癥靶細(xì)胞按5x104/孔一式三聯(lián)地加入相關(guān)位點(diǎn)，將板在37℃下培養(yǎng)40小時(shí)。培養(yǎng)后，以生物素化抗ifnγ、il-17和il-10抗體來(lái)檢測(cè)捕獲的ifnγ、il-2、il-17和il-10，并以鏈霉親和素堿性磷酸酶和顯色底物進(jìn)行顯影。使用自動(dòng)分析儀(cellulartechnologiesltd)來(lái)分析和計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。使用效應(yīng)器功能對(duì)多肽濃度作圖，將功能性親抗原性計(jì)算為調(diào)控50％最大效應(yīng)器功能時(shí)的濃度。2.8.2來(lái)自脾細(xì)胞培養(yǎng)物的cd8和cd4細(xì)胞的間接體內(nèi)清空根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明，使用抗體涂覆磁珠(miltenyibiotech)令脾細(xì)胞完全隔離于cd4或cd8細(xì)胞。對(duì)于mhcii類(lèi)阻斷實(shí)驗(yàn)，向酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中加入20μg/ml抗hla-dr(克隆l243)抗體。2.8.3顆粒酶b的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定脾細(xì)胞的間接體內(nèi)ifnγ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，40小時(shí)后取上清液，并根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明進(jìn)行顆粒酶b的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(r&dsystems公司)。2.8.4luminex多重分析使用三步間接過(guò)程進(jìn)行igg抗體對(duì)il-10、il-17、ifnу、tnfα、il-2和il-4的多重luminex分析(invitrogen)。取標(biāo)樣、對(duì)照和未知血清，以50％分析稀釋液(invitrogen)和50％無(wú)血清rpmi進(jìn)行1:2稀釋。每一實(shí)驗(yàn)中均包括系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋。取每一標(biāo)樣、對(duì)照和未知血清稀釋溶液，與一組偶聯(lián)luminex微球在96孔濾板(milliporemultiscreen；milliporecorporation,bedford,mass.)中混合，并在室溫下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。真空過(guò)濾收集微球，并以pbst洗滌。向每孔中加入生物素化檢測(cè)抗體，室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。培養(yǎng)30分鐘并洗滌后，將微球重懸在pbst中，并以配備xy平臺(tái)的bioradbioplexluminex分析儀進(jìn)行分析。以luminex軟件(bioplexsystems)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。2.8.5增殖實(shí)驗(yàn)用ficol-hypaque(sigma)梯度離心從新鮮抽取的肝素化血液中分離外周單核細(xì)胞(pbmc)。在含有5％合并自體人血清、2mm谷氨酰胺、20mmhepes和青霉素-鏈霉素(1％)且終體積為2ml的rpmi培養(yǎng)基中，以單肽(終濃度為10μg/ml)刺激pbmc(1.5×106細(xì)胞/孔)。純化蛋白衍生物ppd(終濃度10μg/ml)的刺激作為pbmc增殖能力的陽(yáng)性對(duì)照。作為陰性對(duì)照，將pbmc與培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)。將pbmc在37℃下、5％co2的空氣中培養(yǎng)4、7、11天。為了檢測(cè)所述時(shí)間點(diǎn)上的增殖，從每一培養(yǎng)物中一式三份地取100μl，移入96孔板的圓底孔中，并添加3h-胸腺嘧啶核苷(0.0185mbq/孔)，再在37℃下培養(yǎng)8小時(shí)。將培養(yǎng)物收獲到unifilter板上，并以β-閃光計(jì)數(shù)測(cè)定3h-胸腺嘧啶核苷的結(jié)合。分析結(jié)果，計(jì)算刺激指數(shù)(si)為受刺激表位每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)平均值與未受刺激培養(yǎng)物之間的比值。當(dāng)si>2.5時(shí)，增殖實(shí)驗(yàn)認(rèn)為是陽(yáng)性。2.8.651cr-釋放試驗(yàn)在存在或不存在10μg/ml肽的情況下，以1.85mbq絡(luò)酸鈉(51cr)(amersham,essex,uk)標(biāo)記靶細(xì)胞1小時(shí)。培養(yǎng)后，以rpmi洗滌3次。建立5x103/孔的96孔尖底板，并與不同密度的效應(yīng)器細(xì)胞共培養(yǎng)，rpmi終體積為200μl，含10％fcs(sigma)、20mmhepes緩沖液、2mm左旋谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。37℃下培養(yǎng)20小時(shí)后，從每孔取50μl上清液，移入lumaplate(packard,rigaweg,thenetherlands)中。以topcount微孔板閃爍記數(shù)器(packard)。特異性溶解百分比以下述公式計(jì)算：特異性溶解＝100x[(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/最大釋放–自發(fā)釋放]。2.9免疫組織化學(xué)分析組織陣列切片首先以二甲苯脫蠟，通過(guò)梯度酒精再水化，并浸沒(méi)在含0.3％雙氧水的甲醇中20分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性。為了獲得抗原性，將切片浸沒(méi)在500ml的ph6.0檸檬酸鹽緩沖劑中，微波爐設(shè)定第六感加熱20分鐘。使用親和素/生物素阻斷試劑盒(vectorlabs)阻斷內(nèi)源性親和素/生物素的結(jié)合。為了阻斷一級(jí)抗體的非特異性結(jié)合，所有切片隨后以100μl的1/5正常馬血清(nhs)pbs溶液處理15分鐘。以100μl一級(jí)抗體pbs稀釋溶液22℃下處理測(cè)試切片1小時(shí)，或4℃下過(guò)夜處理。陽(yáng)性對(duì)照組織包括以1/1000pbs(dako)稀釋的β2-微球蛋白染色的結(jié)腸直腸癌組織的全切片，所有切片均用100μl生物素化羊抗鼠/兔免疫球蛋白(dako)的1:100nhs稀釋液培養(yǎng)30分鐘。在此用pbs洗滌切片，并以100μl預(yù)成型鏈霉親和素-生物素/hrp復(fù)合物(dako)室溫(rt)培養(yǎng)60分鐘。隨后，使用dab對(duì)表位表達(dá)進(jìn)行可視化。最后，以蘇木精(dako)對(duì)切片輕微對(duì)比染色，以酒精脫水，用二甲苯澄清(gentamedica,york,uk)并以聯(lián)苯乙烯、塑化劑和二甲苯(dpx；bdh)裝片。染色評(píng)估：為了允許玻片的永久保存，使用nanozoomer2.0玻片成像系統(tǒng)(hamamatsu,higashi-ku,japan)對(duì)其進(jìn)行x20成像。使用nanozoomer數(shù)字病理性虛擬玻片查看器(nanozoomerdigitalpathologyvirtualslideviewer)中的圖像分析組織上的標(biāo)記表達(dá)(hamamatsu)。兩名具有評(píng)分經(jīng)驗(yàn)的研究人員在不知道臨床資料的情況下同時(shí)對(duì)標(biāo)記表達(dá)進(jìn)行篩選。對(duì)于h評(píng)分(hscore)，簡(jiǎn)要分析芯樣，將陰性、弱、中、強(qiáng)芯樣用作全組織微陣列(tma)的參考。對(duì)于染色強(qiáng)度，估計(jì)了陽(yáng)性染色的腫瘤細(xì)胞百分比。然后，合并兩種評(píng)分來(lái)形成h評(píng)分，其中h＝染色細(xì)胞百分比x強(qiáng)度(范圍＝0-300)。使用nanozoomer查看器，測(cè)量腫瘤和基質(zhì)的面積，以及每個(gè)區(qū)域中技術(shù)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。然后，計(jì)算每mm2中的陽(yáng)性細(xì)胞值。2.9.1.結(jié)腸直腸腫瘤tma在胃癌tma上篩選抗血清的腫瘤結(jié)合。患者研究和設(shè)計(jì)：研究人群包括一系列在英國(guó)諾丁漢的大學(xué)醫(yī)院選擇性手術(shù)切除了組織學(xué)證實(shí)的散發(fā)性原發(fā)性結(jié)腸直腸癌的462位連貫病人(表1)。這些病人在1994年1月1日至2000年12月31日間接受治療；該時(shí)間段允許對(duì)本研究的預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行有意義的評(píng)估。在此時(shí)間段中治療的病人認(rèn)為是有資格參與研究。若腫瘤體積50％以上由粘液組成，則腫瘤被分類(lèi)為粘液瘤。表1：結(jié)腸直腸tma病人群體(n＝462)的臨床病理變量臨床病理學(xué)：僅相關(guān)病理材料不可用的病例被排除在本研究以外。跟進(jìn)期自切除原始腫瘤時(shí)起算，在數(shù)據(jù)分析中，2003年12月31日的所有仍存活病例被截去，產(chǎn)生的所有病例跟進(jìn)期中位值為37個(gè)月(范圍：0-116)，存活病例的跟進(jìn)期中位值為75個(gè)月(范圍：36-116)。使用前瞻性維護(hù)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)記錄相關(guān)臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)來(lái)自英國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局(ukofficefornationalstatistics)；超過(guò)99％的病例中存在可用數(shù)據(jù)。所采集的信息通過(guò)已故病人的病例筆記來(lái)獨(dú)立驗(yàn)證。使用疾病特異性存活來(lái)作為主要研究終點(diǎn)；但是，也采集了各種其他相關(guān)臨床和組織病理學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)，總結(jié)在表2.3中。對(duì)油陽(yáng)性淋巴結(jié)的病患保留了由folfox組成的佐劑化療，但手術(shù)和佐劑治療由主治醫(yī)生決定。諾丁漢地方研究與倫理委員會(huì)(nottinghamlocalresearchandethicscommittee)對(duì)本研究進(jìn)行了前置倫理審查，并批準(zhǔn)了本研究。陣列模塊的構(gòu)建包含了一系列選擇性切除的結(jié)腸直腸瘤，并被認(rèn)為是對(duì)英國(guó)的結(jié)腸直腸癌人群具有廣泛代表性。266(58％)位病人為男性，196(42％)為女性。手術(shù)時(shí)的年齡中位值為72歲，與英國(guó)結(jié)腸直腸癌診斷年齡中位值70-74歲相一致。陣列中69(15％)個(gè)腫瘤為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tnm)第1分期的腫瘤，174(38％)為第2分期，155(34％)為第3分期，54(11％)為第4分期；有3例為原位疾病。這些數(shù)字分別與診斷為第1-4分期的全國(guó)數(shù)據(jù)，11、35、26、29％分別一致[85]。大多數(shù)腫瘤(392,85％)為腺癌，且最頻繁為中度組織學(xué)分級(jí)(353,77％)。注意到128(28％)個(gè)腫瘤有壁外血管入侵的組織學(xué)跡象，224(48％)個(gè)無(wú)血管入侵跡象，且在110(24％)個(gè)病例無(wú)該信息。對(duì)數(shù)據(jù)分析進(jìn)行截尾時(shí)，228(49％)個(gè)病人已因病去世，64(14％)因其他原因去世，169(37％)例存活。該人群的5年疾病特異性中位生存期為58個(gè)月，與英國(guó)結(jié)腸直腸癌[86]的約45％的全國(guó)平均5年存活相仿。2.9.2.子宮癌tma在抗血清中篩選與卵巢癌tma的腫瘤結(jié)合。卵巢癌tma代表了362位患有原發(fā)性卵巢癌并于2000-2007年間在諾丁漢大學(xué)醫(yī)院接受治療的病人人群。使用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(internationalfederationofobstetricsandgynaecology)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)對(duì)癌癥進(jìn)行分期。本研究中包含的所有病例均根據(jù)當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)化療方案進(jìn)行治療，其中65位病人(41.4％)采用單一藥劑卡鉑，89位病人(56.7％)進(jìn)行基于鉑類(lèi)的聯(lián)合化療，另有3位病人拒絕化療。若病人在一線(xiàn)鉑類(lèi)化療治療期間，病情發(fā)展，或在治療后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，則定義為對(duì)鉑類(lèi)具有抗性。所有病人均經(jīng)過(guò)手術(shù)；超過(guò)44％的病例(n＝69)被認(rèn)定為是首次手術(shù)后亞最佳減積(剩余腫瘤1cm)。隨后，對(duì)病人跟進(jìn)，進(jìn)行體檢、計(jì)算機(jī)斷層掃描和ca-125水平。這些病人的腫瘤的蘇木精-伊紅染色切片由一位不知曉臨床數(shù)據(jù)和病理診斷的婦科病理學(xué)家查看。對(duì)每一腫瘤，還以sd查看其類(lèi)型和分化。從病人的病歷或通過(guò)醫(yī)院的電子記錄(notis)采集并記錄每一病例相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)包括：病人診斷時(shí)的年齡、figo分期、手術(shù)細(xì)胞減滅程度和化療的類(lèi)型、持續(xù)時(shí)間和應(yīng)答。記錄所有病人的佐劑治療的詳情、疾病特異性生存期(dss)和總生存期。生存期的計(jì)算自手術(shù)日期起算，到2008年5月30日止，并截去所有剩余的生存者的數(shù)據(jù)。跟進(jìn)期中位值為36個(gè)月。采集研究樣本和相關(guān)數(shù)據(jù)的倫理批準(zhǔn)由諾丁漢郡地方研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(nottinghamshirelocalresearchethicscommittee)。2.9.3.正常組織tma正常組織tma含有38個(gè)正常器官的59個(gè)代表性芯樣。根據(jù)樣本來(lái)源對(duì)每個(gè)芯樣進(jìn)行分類(lèi)；來(lái)自非癌癥患者的正常組織、來(lái)自癌癥涉及其他器官的癌癥患者的正常組織、癌癥附近的正常組織。組織類(lèi)型和分類(lèi)詳情如表2所示。表2：正常組織tma和組織類(lèi)型詳情實(shí)施例1：野生型小鼠對(duì)自體和外源表位的cd4應(yīng)答對(duì)腫瘤相關(guān)表位的t細(xì)胞應(yīng)答通常微弱或不存在，這是由于胸腺中的耐受性和t細(xì)胞刪減。盡管如此，我們?nèi)院Y選了各種自體和外源cd4表位的刺激輔助應(yīng)答的能力。由于此前的研究已表明，抗體dna結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答最強(qiáng)[84]，因此在各結(jié)構(gòu)中并入了各種cd4外源和自體表位，并在野生型小鼠中進(jìn)行篩選。表3列出了所有表位及其適當(dāng)?shù)男∈笸次锏男蛄?。?：cd4表位精氨酸殘基以下劃線(xiàn)表示非同源殘基以斜體表示圖5展示了對(duì)大多數(shù)外源cd4表位的良好cd4應(yīng)答，但對(duì)自體表位則不然。乙肝核蛋白128-140、cd4i-ab輔助表位在c57b1小鼠的elispot檢測(cè)中表現(xiàn)出50-1,000/百萬(wàn)脾細(xì)胞(平均值為382/百萬(wàn)脾細(xì)胞)的應(yīng)答。小鼠睪丸癌表位nyeso-1和ssx2為外源表位，dr1表位nyeso-1(87-111)和ssx2(34-48)在hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激了良好應(yīng)答：nyeso-1(87-111)為250-900/百萬(wàn)脾細(xì)胞(平均值567/百萬(wàn)脾細(xì)胞)，ssx2(34-48)為500-1200/百萬(wàn)脾細(xì)胞(平均值765/百萬(wàn)脾細(xì)胞)。hla-dr1突變tpi表位與野生型的不同僅在于一個(gè)氨基酸，表現(xiàn)出300-1300/百萬(wàn)脾細(xì)胞的應(yīng)答。人gp100hla-dr4酪氨酸酶表位44-59與同源小鼠表位相比具有1個(gè)氨基酸改變，并具有263-1521/百萬(wàn)脾細(xì)胞(中位值為745/百萬(wàn)脾細(xì)胞)的應(yīng)答。相反，同源鼠自體表位未能在hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激應(yīng)答。人hla-dr4酪氨酸酶表位與同源小鼠表位相比具有6個(gè)氨基酸改變，并具有405-832/百萬(wàn)脾細(xì)胞(中位值為555/百萬(wàn)脾細(xì)胞)的應(yīng)答。人和小鼠之間的hla-dr1mmp7247-262表位具有4個(gè)氨基酸變化，其中一個(gè)據(jù)預(yù)測(cè)位于核心mhc結(jié)合/tcr識(shí)別區(qū)域(表3)。該表位未能刺激hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中高于背景水平的應(yīng)答。hla-dr4波形蛋白415-433表位在人與小樹(shù)之間有2個(gè)氨基酸差異，但據(jù)預(yù)測(cè)并不位于核心mhc結(jié)合/tcr識(shí)別區(qū)域(表3)。它未能在野生型hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激應(yīng)答。相反，波形蛋白28-49在人和小鼠中為同源，且是真實(shí)自體表位，能在hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激200-500/百萬(wàn)脾細(xì)胞(平均值390/百萬(wàn)脾細(xì)胞)的應(yīng)答。該應(yīng)答非常吸引人，并使得我們?cè)噲D解釋是否存在對(duì)該表位的刪減/耐受。實(shí)施例2：dna免疫接種導(dǎo)致對(duì)瓜氨酸化的vim28、vim415、mmp7、ny-eso-1的應(yīng)答。ra病人表現(xiàn)出對(duì)瓜氨酸化波形蛋白表位的t細(xì)胞應(yīng)答。由于apcs能夠結(jié)構(gòu)性地瓜氨酸化表位，因此可能抗體dna結(jié)構(gòu)正在經(jīng)歷瓜氨酸化，并刺激應(yīng)答。因此，以編碼自體vim28表位的抗體dna結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種。在所述小鼠中刺激所得的t細(xì)胞進(jìn)行對(duì)瓜氨酸化和未瓜氨酸化vim28多肽的ifnγ、il-17、il-2的應(yīng)答的體外篩選。圖6顯示，雖然在elispot實(shí)驗(yàn)中，小鼠對(duì)野生型多肽做出了應(yīng)答，產(chǎn)生了全部三種細(xì)胞因子(平均值：ifnγ400/百萬(wàn)脾細(xì)胞、il-17120/百萬(wàn)脾細(xì)胞和il-2150/百萬(wàn)脾細(xì)胞)，對(duì)瓜氨酸化多肽的ifnγ和il-17應(yīng)答顯著較高(平均值：ifnγ1250/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0046,il-17250/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0392)，但il-2則不然(250/百萬(wàn)脾細(xì)胞)。為了確定對(duì)vim415表位抗體是否產(chǎn)生相似應(yīng)答，使用dna結(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)小鼠免疫接種(圖7)。與vim28-49相反，且與我們的最初觀(guān)察相一致，對(duì)野生型vim415-433無(wú)應(yīng)答，但對(duì)瓜氨酸化多肽強(qiáng)應(yīng)答，且對(duì)il-17的應(yīng)答與對(duì)ifnγ的應(yīng)答同樣強(qiáng)(平均：ifnγ400/百萬(wàn)脾細(xì)胞，p＝0.0067；il-17350/百萬(wàn)脾細(xì)胞，p＝0.002；和il-2250/百萬(wàn)脾細(xì)胞，p＝0.0056)。這證實(shí)了抗體dna翻譯后被瓜氨酸化。相反，mmp7247-262并入dna疫苗(圖8)后，未發(fā)現(xiàn)對(duì)野生型或瓜氨酸化多肽的ifnγ應(yīng)答，但卻發(fā)現(xiàn)了對(duì)兩種野生型(平均：312/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0061)和瓜氨酸化(平均：309/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0267)多肽的顯著il-17應(yīng)答。以b16hhdiinyeso-1腫瘤細(xì)胞注射小鼠后，然后以附加或不附加homspera佐劑的含nyeso-1119抗體-dna疫苗(圖9)免疫接種，僅在發(fā)現(xiàn)了對(duì)瓜氨酸化多肽的ifnγ應(yīng)答，而野生型多肽中則不然，且該應(yīng)答伴隨著抗腫瘤應(yīng)答。由于抗原呈遞細(xì)胞能夠結(jié)構(gòu)性地瓜氨酸化表位，我們想要發(fā)現(xiàn)，瓜氨酸化自體表位特異性應(yīng)答能夠由以dna疫苗形式遞送的全長(zhǎng)抗原來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)。因此，以編碼全鼠波形蛋白抗原的dna結(jié)構(gòu)對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。在這些小鼠中刺激得到的t細(xì)胞中，篩選對(duì)瓜氨酸化和未瓜氨酸化vim415-433和vim28-49多肽的ifnγ應(yīng)答。圖10顯示，以dna結(jié)構(gòu)免疫接種的小鼠對(duì)兩種瓜氨酸化多肽均作出ifnγ應(yīng)答，但對(duì)野生型則不然。這證實(shí)了dna翻譯后被瓜氨酸化。這些結(jié)果暗示，來(lái)自抗體-dna結(jié)構(gòu)的表位被瓜氨酸化，且識(shí)別所述修飾后多肽的t細(xì)胞并未耗盡/失去對(duì)抗原的反應(yīng)性。實(shí)施例3.多肽免疫接種引起對(duì)瓜氨酸化vim28、vim415、vim65的應(yīng)答。為了確定這是否僅限于dna疫苗，或瓜氨酸化多肽是否還能刺激該細(xì)胞庫(kù)，以野生型和瓜氨酸化vim28-49和瓜氨酸化vim415-433多肽聯(lián)合cpg和mpla佐劑，對(duì)小鼠免疫接種。圖11展示了瓜氨酸化vim28-49刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的強(qiáng)烈ifnγ應(yīng)答(平均600/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0037)和對(duì)野生型多肽的弱應(yīng)答(平均250/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0175)。野生型多肽刺激的對(duì)未瓜氨酸化多肽(平均700/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.003)和瓜氨酸化多肽(平均1100/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0182)的ifnγ應(yīng)答相似，以及弱il-17和il-2細(xì)胞。未觀(guān)察到顯著il-10應(yīng)答。對(duì)ifnγ和il-17的應(yīng)答親抗原性為10-6m。對(duì)小鼠中的vim28-49的應(yīng)答是對(duì)自體的應(yīng)答，因?yàn)榘被嵝蛄性谛∈蠛腿酥惺且粯拥?，暗示著?duì)該表位的t細(xì)胞庫(kù)未被刪除。對(duì)瓜氨酸化vim28-49的應(yīng)答是對(duì)修飾自體的應(yīng)答，但小鼠也可以識(shí)別野生型多肽。此前的研究表明，在位點(diǎn)36和45處瓜氨酸化的多肽30-40能夠在hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激t細(xì)胞應(yīng)答。我們注意到，位點(diǎn)28處還存在又一個(gè)精氨酸，因此，我們延長(zhǎng)了該多肽，以提供28-49和瓜氨酸化位點(diǎn)28、36、45(圖11c)。三瓜氨酸化vim28-49多肽比位點(diǎn)36、45處瓜氨酸化的vim28-49多肽表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的應(yīng)答(分別有p＝0.02和p＝0.0007)。僅在位點(diǎn)28瓜氨酸化的vim28-49，對(duì)三瓜氨酸化多肽和vim45瓜氨酸化多肽均產(chǎn)生應(yīng)答。vim28和vim36瓜氨酸化多肽也對(duì)該三瓜氨酸化多肽做出應(yīng)答。該數(shù)據(jù)表明，瓜氨酸位點(diǎn)對(duì)該序列產(chǎn)生的免疫應(yīng)答程度有影響，并暗示著位點(diǎn)28最為重要。但是，所述三瓜氨酸化多肽誘導(dǎo)了對(duì)其他瓜氨酸化版本交叉反應(yīng)性更高的應(yīng)答。與野生型版本相比，三瓜氨酸化vim28-49多肽對(duì)hla-dr0401表現(xiàn)出的結(jié)合性更好，這一點(diǎn)可從hla-dr0401結(jié)合實(shí)驗(yàn)中其與ha306-318標(biāo)記蛋白競(jìng)合更好而看出(圖12)。圖13表明，瓜氨酸化vim415刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的強(qiáng)ifnγ應(yīng)答(平均1000/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝<0.0001)，而對(duì)野生型多肽無(wú)應(yīng)答。它還刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的強(qiáng)烈il-17應(yīng)答(平均530/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝<0.0001)和對(duì)野生型多肽的弱應(yīng)答(平均140/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.04)。ifnγ和il-17應(yīng)答的親抗原性均為10-6m。對(duì)瓜氨酸化表位的il-2應(yīng)答更具有可變性(平均350/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.046)但對(duì)野生型多肽無(wú)應(yīng)答。野生型vim415-433多肽刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的弱il-2應(yīng)答。未觀(guān)察到顯著il-10應(yīng)答。人vim415-433表位與同源小鼠表位有2個(gè)氨基酸不同，該2個(gè)氨基酸未預(yù)測(cè)處于核心mhc結(jié)合/tcr識(shí)別區(qū)域。為了測(cè)試這一假設(shè)，以瓜氨酸化人vim415多肽對(duì)小鼠免疫接種，然后篩選瓜氨酸化小鼠vim415。t細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)兩種多肽的相等應(yīng)答(圖14)。在間接體內(nèi)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)之前清空cd4細(xì)胞，或向酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中添加mhcii類(lèi)阻斷抗體，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化vim415-433和vim28-49應(yīng)答由cd4介導(dǎo)(圖15)。使用瓜氨酸化vim28和vim415對(duì)c57bl小鼠和hhd1/dr1小鼠免疫接種，但其均未產(chǎn)生應(yīng)答，暗示著該表位在i-ab或hla-dr0401上均不存在。圖16a顯示，在hla-dr4小鼠中，瓜氨酸化波形蛋白65多肽刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的ifnγ應(yīng)答(平均值550/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0046)，但對(duì)野生型多肽無(wú)應(yīng)答。它還刺激了il-17應(yīng)答(平均值550/百萬(wàn)脾細(xì)胞)，但對(duì)野生型多肽無(wú)應(yīng)答。野生型vim65-77多肽刺激了對(duì)野生型和瓜氨酸化多肽的弱ifnγ和il-17應(yīng)答。還測(cè)試了hla-a2/dr1小鼠中的vim65-77多肽，也表現(xiàn)出對(duì)瓜氨酸化多肽的高頻率ifnγ應(yīng)答，還表現(xiàn)出與野生型多肽的一些交叉反應(yīng)性(圖16b)。還觀(guān)察到對(duì)瓜氨酸化多肽的低頻率il-10應(yīng)答。對(duì)nhcii類(lèi)的阻斷未消除瓜氨酸化多肽特異性應(yīng)答，由此表明vim65-77特異性應(yīng)答是mhci性限制性(圖16c)。這進(jìn)一步被胞內(nèi)細(xì)胞因子染色所證實(shí)，該染色表明，對(duì)vim65-77瓜氨酸化多肽應(yīng)答而產(chǎn)生ifnγ和tnfa的細(xì)胞為cd8陽(yáng)性細(xì)胞(圖16d)。瓜氨酸化vim65-77特異性應(yīng)答還表現(xiàn)出肽脈沖hla-a2陽(yáng)性靶細(xì)胞(圖16e)的細(xì)胞毒性(圖16e)，表明了hla-a2限制性。使用2個(gè)高預(yù)測(cè)hla-a2結(jié)合性的9聚體多肽來(lái)繪制vim65-77序列中的最小hla-a2限制性表位，揭示了最佳序列位于vim68-76區(qū)域(圖16f)。對(duì)該瓜氨酸化9聚多肽的特異性應(yīng)答未與野生型交叉反應(yīng)。分析對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于hla錯(cuò)配b16細(xì)胞，瓜氨酸化65-77多肽誘導(dǎo)的間接體內(nèi)應(yīng)答對(duì)轉(zhuǎn)基因hla-a2改造el4細(xì)胞系(el4hhd)具有良好識(shí)別(圖16g)。實(shí)施例4：測(cè)定對(duì)自體表位的cd4應(yīng)答是否為初次應(yīng)答、記憶應(yīng)答或treg應(yīng)答小鼠對(duì)人瓜氨酸化vim415的單免疫接種產(chǎn)生了強(qiáng)力ifnγ和il-17應(yīng)答，暗示著其促進(jìn)了記憶應(yīng)答或treg應(yīng)答。為了測(cè)定這是否是轉(zhuǎn)化為ifnγ/il-17應(yīng)答的天然treg應(yīng)答，用抗cd25mab清空小鼠的天然tregs，并以瓜氨酸化vim415對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。清空天然treg對(duì)該應(yīng)答的頻率或親抗原性未產(chǎn)生影響，暗示著天然tregs并非應(yīng)答細(xì)胞群(圖17)。為了確定該應(yīng)答是否也可由其他佐劑來(lái)誘導(dǎo)，用以明礬、弗氏不完全佐劑(ifa)、gmcsf、mpla、tmx201、mpla/tmx201或cpg/mpla為佐劑的瓜氨酸化vim415-433和瓜氨酸化28-49，對(duì)小鼠免疫接種，并篩選ifnγ、il-17或il-10生成(圖18)。cpg/mpla、gmcsf和tmx201誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的瓜氨酸化vim415-433和瓜氨酸化28-49表位的ifnγ/il-17應(yīng)答，但是，當(dāng)以明膠或ifa為佐劑進(jìn)行多肽給藥時(shí)，未產(chǎn)生應(yīng)答。多肽和ifa的免疫接種誘導(dǎo)了對(duì)瓜氨酸化多肽的高頻率il-10應(yīng)答?？筩tla-4單克隆抗體可以阻斷ctla-4與其同源受體cd80/86的相互作用，由此防止該配體誘導(dǎo)的t細(xì)胞抑制。在存在抗ctla-4mab的情況下，以瓜氨酸化vim415免疫接種的小鼠，t細(xì)胞應(yīng)答的親抗原性從10-6m顯著提高為10-8m(圖19)。實(shí)施例5：癌癥患者對(duì)自體多肽的應(yīng)答對(duì)9位黑色素瘤病人篩選其對(duì)一系列自體多肽的應(yīng)答(圖20)。8個(gè)病人中有5人在第4(1)、7(1)或大于11(3)天表現(xiàn)出對(duì)瓜氨酸化vim415的應(yīng)答。11個(gè)病人中有6人在>第10天對(duì)未修飾vim415做出應(yīng)答。所述病人中僅有4人對(duì)修飾后多肽和未修飾多肽均產(chǎn)生應(yīng)答。8個(gè)病人中有2人在第11天對(duì)vim28產(chǎn)生應(yīng)答，而5人對(duì)瓜氨酸化vim28應(yīng)答。對(duì)未修飾多肽產(chǎn)生應(yīng)答的2人也能識(shí)別修飾后的多肽。8個(gè)病人中有4人對(duì)vim65產(chǎn)生應(yīng)答，且8人中有3人對(duì)瓜氨酸化vim65產(chǎn)生應(yīng)答。這些病人中僅2人對(duì)修飾后多肽和未修飾多肽均產(chǎn)生應(yīng)答。8個(gè)病人還對(duì)瓜氨酸化nyeso-1119-143產(chǎn)生應(yīng)答；所述應(yīng)答中有6個(gè)在第4-7天達(dá)到峰值，暗示強(qiáng)烈應(yīng)答或記憶應(yīng)答。8個(gè)病人還對(duì)未修飾nyeso-1119-143產(chǎn)生應(yīng)答，這些病人具有一系列hla類(lèi)型(表4)。僅有一個(gè)是hla-a2/dr4，這暗示著其他hla單倍型可以對(duì)這些多肽產(chǎn)生應(yīng)答。表4：癌癥病人的單倍型pt019a2a3b7b55dr7dr16pt020a2b27b40dr3dr13pt021a3a25b44b35dr1dr13pt023a2a3b7b35dr1dr15pt028a2a24b7b35dr1dr13pt029a2a25b15dr15pt032a1a11b51b18dr15pt033b7dr11dr15pt034a11b7b35dr1dr4pt035a29a30b50dr1dr7表6：pad酶、波形蛋白和瓜氨酸的表白瓜氨酸化由pad酶執(zhí)行，尤其是pad2和pad4酶。這些酶要求高濃度鈣，且通常在死亡細(xì)胞或死亡中的細(xì)胞中激活。因此，似乎不可能在健康腫瘤細(xì)胞中表達(dá)瓜氨酸化蛋白。因此，對(duì)結(jié)腸直腸瘤和子宮瘤以及正常組織進(jìn)行波形蛋白、pad2和pad4酶的瓜氨酸化和表達(dá)的染色。正常組織正常組織的波形蛋白、pad2、pad4和瓜氨酸的表達(dá)如表5所示。間充質(zhì)細(xì)胞，例如結(jié)締組織細(xì)胞、血細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，都表達(dá)波形蛋白作為細(xì)胞骨骼蛋白。脾臟、甲狀腺、睪丸、宮頸、卵巢、扁桃體、子宮、肺、胸腺和乳腺中的大多數(shù)細(xì)胞均可對(duì)波形蛋白強(qiáng)烈染色。胎盤(pán)、直腸、結(jié)腸、胰腺和十二指腸骨骼肌和平滑肌、膽囊、食道、腎臟、肝臟、膀胱、回腸、空腸、胃中，小于50％的細(xì)胞為弱染色。皮膚、脂肪組織、骨骼肌、直腸、大腦、小腦、隔膜或心臟中未觀(guān)察到染色。大多數(shù)肝臟細(xì)胞可以抗pad2mab強(qiáng)烈染色。平滑肌細(xì)胞和大腦細(xì)胞大多數(shù)為弱染色。小腦、胰腺和睪丸的過(guò)半細(xì)胞以pad2強(qiáng)烈染色。膽囊、回腸、空腸、胃和結(jié)腸中低于50％細(xì)胞對(duì)pad2強(qiáng)烈染色。食道、直腸、骨骼肌、膀胱、胸腺、腎臟、胎盤(pán)、心臟、隔膜、十二指腸、甲狀腺和肺部細(xì)胞低于50％為弱染色。皮膚、脂肪組織、脾臟、扁桃體、胸腺、卵巢和子宮細(xì)胞無(wú)染色。表5波形蛋白、pad2、pad4和瓜氨酸化蛋白在正常組織中的表達(dá)肝臟和小腦細(xì)胞大多數(shù)對(duì)抗pad4mab強(qiáng)烈染色。大腦和心臟細(xì)胞大多數(shù)弱染色。結(jié)腸和胃低于50％的細(xì)胞對(duì)pad4強(qiáng)烈染色，而回腸、隔膜、十二指腸、甲狀腺、睪丸、乳腺、膽囊、食道低于50％的細(xì)胞弱染色。皮膚、骨骼肌和平滑肌、膀胱、胰臟、空腸、腎臟、肝臟、宮頸、肺部、卵巢、扁桃體、脾臟、子宮、直腸、脂肪組織、胸腺無(wú)染色。小腦和肝臟對(duì)抗瓜氨酸mab強(qiáng)烈染色。皮膚、心臟、腎臟肺部、胰臟和大腦細(xì)胞大多數(shù)弱染色。超過(guò)50％十二指腸強(qiáng)染色，且超過(guò)50％的胸腺細(xì)胞和睪丸細(xì)胞弱染色。胸腺、結(jié)腸和空腸中低于50％細(xì)胞弱染色。胸腺中低于25％的細(xì)胞強(qiáng)烈染色，且食道、直腸、膽囊、骨骼肌、膀胱、回腸、胸腺、扁桃體、隔膜和子宮中超過(guò)25％弱染色。脾臟、皮膚、胃、卵巢、扁桃體、脂肪組織、胎盤(pán)和宮頸對(duì)瓜氨酸無(wú)染色。卵巢瘤卵巢瘤起源于間葉細(xì)胞，因此預(yù)期可能表達(dá)波形蛋白。pad4在正常卵巢中弱表達(dá)。219個(gè)卵巢瘤被波形蛋白特異性mab染色。僅9/219(4％)腫瘤無(wú)染色，還有16/219(7％)弱染色，而194/219(89％)強(qiáng)染色。卡普蘭邁耶存活分析顯示，波形蛋白表達(dá)和存活之間無(wú)相關(guān)性。波形蛋白表達(dá)與應(yīng)激相關(guān)蛋白u(yù)lbp1(p＝0.017)、pad4(p＝0.018)和cea-cam4(p＝0.033)之間有弱相關(guān)性。219個(gè)卵巢瘤以pad4特異性mab染色(圖23)。腫瘤中僅9/219(4％)未染色，126/219(58％)弱染色，而84/219(38％)強(qiáng)染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，pad表達(dá)和存活之間無(wú)相關(guān)性。pad4表達(dá)與應(yīng)激相關(guān)蛋白之間raet1e(p＝0.036)和ulbp1之間(p＝0.016)之間存在弱相關(guān)性，而與波形蛋白表達(dá)(p＝0.001)之間和lewisy(p＝0.006)之間存在強(qiáng)相關(guān)性。雖然腫瘤表達(dá)pad4，但其應(yīng)僅在死亡中的細(xì)胞中激活。為了評(píng)估其真實(shí)性，卵巢腫瘤對(duì)抗瓜氨酸多肽特異性mab染色。僅7/228(3％)腫瘤未染色，34/228(15％)為弱染色，而187/228(82％)為強(qiáng)染色。但是，并非腫瘤中的所有細(xì)胞均被染色。在69/228(30％)腫瘤中，低于25％的細(xì)胞染色。83/228(36％)的腫瘤中，25-50％的細(xì)胞染色，且如前所述，這些細(xì)胞主要是來(lái)源于基質(zhì)的細(xì)胞。53/228(23％)的腫瘤中，50-75％的細(xì)胞染色，包括一些上皮細(xì)胞；16/228(7％)腫瘤中，大于75％的細(xì)胞染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，瓜氨酸表達(dá)和存活之間不存在相關(guān)性。瓜氨酸表達(dá)強(qiáng)度和cea-cam5(p＝0.037)之間、bcl2(p＝0.011)之間、lewisy(p＝0.053)之間存在相關(guān)性。表達(dá)瓜氨酸的細(xì)胞百分比和分級(jí)(p＝0.034)之間、bcl2(p＝0.035)之間,cd59(p＝0.049)之間和ulbp1(p＝0.044)之間存在相關(guān)性。360個(gè)卵巢瘤對(duì)pad2染色。9％因?yàn)槿鄙僮懔拷M織芯樣或芯樣中無(wú)可評(píng)測(cè)的腫瘤細(xì)胞(即全為基質(zhì))而無(wú)法進(jìn)行評(píng)測(cè)。329個(gè)以pad2特異性mab染色的可評(píng)測(cè)的卵巢瘤中，所有腫瘤均表達(dá)pad2。其中277/329(84％)弱染色，52/329(16％)強(qiáng)染色。卡普蘭邁耶分析(圖21a)表明，pad2表達(dá)和存活之間存在相關(guān)性，pad2高表達(dá)具有保護(hù)性(p＝0.033)。pad2表達(dá)與mhc表達(dá)之間(p＝0.038)和hmgb1表達(dá)之間(p＝0.008)存在相關(guān)性。多變量分析表明，pad2是獨(dú)立的預(yù)后因素(p＝0.002)。360個(gè)卵巢瘤對(duì)hmgb1染色。10％因?yàn)槿鄙僮懔拷M織芯樣或芯樣中無(wú)可評(píng)測(cè)的腫瘤細(xì)胞(即全為基質(zhì))而無(wú)法進(jìn)行評(píng)測(cè)。316個(gè)以hmgb-1特異性mab染色的可評(píng)測(cè)的卵巢瘤中，僅23/360(7％)腫瘤未染色。42/316(13％)弱染色，52/329(87％)強(qiáng)染色?？ㄆ仗m邁耶分析(圖21b)表明，hmgb1表達(dá)和存活之間存在相關(guān)性，hmgb1低表達(dá)具有保護(hù)性(p＝0.002)。hmgb1表達(dá)與波形蛋白表達(dá)之間(p＝0.034)存在弱相關(guān)性。多變量分析表明，hmgb1是獨(dú)立的預(yù)后因素(p＝0.02)。腫瘤分期、腫瘤類(lèi)型和對(duì)化療的應(yīng)答也與病人存活相關(guān)。在多變量模型中，tnm分期(p＝<0.0001)、腫瘤類(lèi)型(p＝<0.031)、對(duì)化療的應(yīng)答(p＝<0.0001)和hmgb1表達(dá)(p＝0.002)是獨(dú)立的病人存活指標(biāo)。若將高和低pad2細(xì)胞表達(dá)與高和低hmgb1表達(dá)相比(圖21c)，表現(xiàn)出高h(yuǎn)mgb1和低pad2表達(dá)的病人中，310人中有219人(70％)具有最差中位生存期50個(gè)月，而具有低hmgb1和高pad2的病人則表現(xiàn)出較好存活，310人中有41人(13％)的中位生存期為101個(gè)月。結(jié)腸直腸瘤結(jié)腸直腸瘤是上皮起源，且預(yù)期并不表達(dá)波形蛋白，除非經(jīng)歷上皮到間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化。正常結(jié)腸中可見(jiàn)pad2和pad4表達(dá)。取282個(gè)結(jié)腸直腸瘤以波形蛋白特異性mab染色。僅25/282(9％)腫瘤未染色，4/282(1％)弱染色，53/282(90％)強(qiáng)染色。但是，一個(gè)腫瘤中并非所有細(xì)胞均染色。114/282(40％)個(gè)腫瘤中，低于25％細(xì)胞染色，且全部為基質(zhì)細(xì)胞。68/282(24％)個(gè)腫瘤中，25-50％細(xì)胞染色，且也主要是基質(zhì)起源。42/282(15％)個(gè)腫瘤中，50-75％細(xì)胞染色，包括一些上皮細(xì)胞；33/282(12％)個(gè)腫瘤中，大于75％的細(xì)胞染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，波形蛋白強(qiáng)度或染色細(xì)胞百分比和存活之間無(wú)相關(guān)性。波形蛋白表達(dá)和trailr2(p＝0.003)、腫瘤中的il-17(p＝0.021)、muc1(p＝0.001)、pad2(p＝0.025)和pad4(p＝<0.0001)相關(guān)。取296個(gè)結(jié)腸直腸瘤以pad2特異性mab染色(圖26)。僅45/296(15％)腫瘤未染色，60/296(20％)弱染色，191/296(65％)強(qiáng)染色。但是，一個(gè)腫瘤中并非所有細(xì)胞軍染色。99/296(33％)個(gè)腫瘤中，低于25％細(xì)胞染色，且全部為基質(zhì)細(xì)胞。82/296(28％)個(gè)腫瘤中，25-50％細(xì)胞染色，且也主要是基質(zhì)起源。55/296(19％)個(gè)腫瘤中，50-75％細(xì)胞染色；15/296(5％)個(gè)腫瘤中，大于75％的細(xì)胞染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，pad2強(qiáng)度或染色細(xì)胞百分比和存活之間無(wú)相關(guān)性。pad2表達(dá)和cd59(p＝0.006)、β-連環(huán)蛋白(p＝0.005)、cd8t細(xì)胞數(shù)量(p＝0.009)、muc1(p＝0.012)、波形蛋白(p＝0.038)和pad4(p＝0.000)相關(guān)。取291個(gè)結(jié)腸直腸瘤以pad4特異性mab染色(圖26)。僅18/291(6％)腫瘤未染色，158/291(54％)弱染色，115/291(40％)強(qiáng)染色。但是，一個(gè)腫瘤中并非所有細(xì)胞軍染色。65/291(22％)個(gè)腫瘤中，低于25％細(xì)胞染色，且全部為基質(zhì)細(xì)胞。68/291(23％)個(gè)腫瘤中，25-50％細(xì)胞染色，且也主要是基質(zhì)起源。98/291(34％)個(gè)腫瘤中，50-75％細(xì)胞染色；42/291(14％)個(gè)腫瘤中，大于75％的細(xì)胞染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，pad4強(qiáng)度和存活之間無(wú)相關(guān)性(圖21d；表6；p＝0.032)。表6：表達(dá)pad4的結(jié)腸直腸癌病人的生存期平均值a若截尾，則估計(jì)值被限制為最大生存期。腫瘤分期和血管入侵也與病人存活相關(guān)。在多變量模型tnm分期(p＝<0.0001),中，血管入侵(p＝<0.0001)和pad4表達(dá)(p＝0.017)均為病人存活的獨(dú)立指標(biāo)。pad4表達(dá)和bcl2(p＝0.01)、β-catenin(p＝0.001)、cd8t細(xì)胞數(shù)量(p＝0.006)、muc1(p＝0.000)、cea.cam5(p＝0.000)、cd59(p＝0.038)波形蛋白(p＝0.000)和pad2(p＝0.000)之間也存在相關(guān)性。雖然腫瘤表達(dá)pad4，但這應(yīng)該僅在死亡中的細(xì)胞中表達(dá)。為了評(píng)估其真實(shí)性，結(jié)腸直腸腫瘤對(duì)抗瓜氨酸多肽特異性mab染色。所有被染色的腫瘤中，41/316(13％)為弱染色，而275/316(87％)為強(qiáng)染色?？ㄆ仗m邁耶存活分析表明，瓜氨酸表達(dá)和存活之間存在弱相關(guān)性(p＝0.078)。瓜氨酸表達(dá)和放射治療之間存在相關(guān)性(p>0.001)。實(shí)施例7：對(duì)瓜氨酸化多肽的抗腫瘤應(yīng)答小鼠和人均對(duì)瓜氨酸化自體多肽和dna疫苗表現(xiàn)出應(yīng)答。但是，若腫瘤中的這些表位并未瓜氨酸化，則t細(xì)胞無(wú)抗腫瘤活性。由于人腫瘤表達(dá)波形蛋白、pad2/4和瓜氨酸，在鼠模型中評(píng)估了瓜氨酸化波形蛋白的抗腫瘤應(yīng)答。對(duì)以瓜氨酸化波形蛋白415-433和28-49多肽免疫接種的小鼠，評(píng)價(jià)其脾細(xì)胞對(duì)b16腫瘤細(xì)胞的體外應(yīng)答能力。圖22a展示了血清饑餓誘導(dǎo)自體吞噬表達(dá)hla-dr4(b16dr4)的b16腫瘤細(xì)胞特異性的ifnγ釋放，與未處理細(xì)胞或hla-錯(cuò)配細(xì)胞相比較，以說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別(p<0.0001)。當(dāng)以自體吞噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-ma)(p<0.0001)或pad抑制劑ci脒(p＝0.0012)的存在下處理細(xì)胞時(shí)，對(duì)誘導(dǎo)自體吞噬b16dr4細(xì)胞的識(shí)別顯著降低。因此，這表明該識(shí)別具有自體吞噬和瓜氨酸化依賴(lài)性。以瓜氨酸化vim28-49或vim415-433多肽或兩者免疫接種的小鼠的脾細(xì)胞顯示，當(dāng)以vim415-433(p<0.0001)和vim28-49(p<0.0001)瓜氨酸化多肽，而非野生型進(jìn)行刺激時(shí)，發(fā)生顆粒酶b(一種細(xì)胞毒性的標(biāo)記)釋放(圖22b-d)。顆粒酶b還在對(duì)血清饑餓b16dr4腫瘤靶細(xì)胞的應(yīng)答中釋放，暗示著呈遞瓜氨酸化表位的腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性(p＝0.014)(圖22e)。測(cè)定以瓜氨酸化vim415或瓜氨酸化vim28免疫接種的小鼠體外殺滅以人dr4轉(zhuǎn)染的t2腫瘤細(xì)胞的能力。圖23a顯示，兩種瓜氨酸化多肽均能誘導(dǎo)cd細(xì)胞殺滅轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，無(wú)論是否曾以適當(dāng)多肽進(jìn)行脈沖沖擊。由于t2細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，這暗示著所述多肽由t2細(xì)胞內(nèi)源性呈遞。相反地，未殺滅同樣表達(dá)波形蛋白但不表達(dá)pad酶的正常脾細(xì)胞。向hla/dr4轉(zhuǎn)基因小鼠置入以dr4轉(zhuǎn)染的b16腫瘤。小鼠以vim415-433瓜氨酸化多肽或編碼vim415-433序列的dna疫苗免疫接種，并監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)。以vim415-433瓜氨酸化多肽或編碼于dna疫苗中的vim415-433免疫接種的小鼠，刺激了強(qiáng)烈的抗腫瘤應(yīng)答(圖24a)。未免疫接種小鼠中，腫瘤迅速生長(zhǎng)，且所有小鼠在第23天時(shí)都不得不處死。相反，以vim415瓜氨酸化多肽免疫的小鼠有50％在第35天無(wú)腫瘤，且30％腫瘤治愈。以vim28-49瓜氨酸化多肽或以編碼vim28-49序列的dna疫苗接種的小鼠，相對(duì)于未免疫接種對(duì)照或以vim28-49野生型多肽而言,表現(xiàn)出顯著提高的生存期(圖24b)。以vim28-49野生型多肽免疫接種的小鼠表現(xiàn)出幾乎達(dá)到顯著的抗腫瘤應(yīng)答。以vim415-433和28-49瓜氨酸化多肽聯(lián)合免疫接種，相對(duì)于對(duì)照得到更好的腫瘤保護(hù)和總生存期(p<0.0001)(圖24c)。這些研究表明，腫瘤表達(dá)瓜氨酸化波形蛋白，而后者是細(xì)胞毒性cd4殺手t細(xì)胞的標(biāo)靶。為了展示這些抗腫瘤應(yīng)答由cd4t細(xì)胞調(diào)控，以抗cd4抗體處理小鼠，以體內(nèi)清空cd4細(xì)胞。免疫接種聯(lián)合cd4t細(xì)胞清空，完全終止了由瓜氨酸化vim415(p＝0.0005)和瓜氨酸化vim28多肽(p＝0.0001)所調(diào)控的抗腫瘤應(yīng)答(圖24d和e)。vim415-433和vim28-49瓜氨酸化多肽均誘導(dǎo)了高頻率ifnγ應(yīng)答。體內(nèi)阻斷ifnγ終止了vim415-433和vim28-49瓜氨酸化多肽特異性抗腫瘤應(yīng)答(圖25a和b)。瓜氨酸化vim415-433特異性應(yīng)答還表現(xiàn)出il-17應(yīng)答。對(duì)這些進(jìn)行體內(nèi)阻斷，對(duì)體內(nèi)抗腫瘤作用的影響為低顯著性(圖25c)。對(duì)il-17的阻斷還對(duì)體內(nèi)瓜氨酸化vim28-49特異性抗腫瘤應(yīng)答具有低顯著性的影響作用(圖25d)。為了確定vim415-433和vim28-49瓜氨酸化特異性應(yīng)答的直接腫瘤識(shí)別的重要性，以缺失hla-dr0401表達(dá)的b16腫瘤處理小鼠，隨后以vim415-433或vim28-49瓜氨酸化多肽免疫接種。以vim28-49瓜氨酸化多肽免疫接種的小鼠，與對(duì)照相比，表現(xiàn)出延遲腫瘤生長(zhǎng)和提高的生存期(圖26a)，暗示著對(duì)腫瘤細(xì)胞上的hla/dr4和同源多肽的直接識(shí)別對(duì)抗腫瘤應(yīng)答并非必需條件，但對(duì)表達(dá)腫瘤環(huán)境中的同源多肽和hla/dr4的抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答而從旁釋放ifnγ，則是該抗腫瘤應(yīng)答的成因。相反，以vim415-433瓜氨酸化多肽免疫接種的小鼠，在此模型中未顯示任何腫瘤應(yīng)答，暗示著對(duì)腫瘤細(xì)胞上的hla/dr4和同源多肽的直接識(shí)別對(duì)抗腫瘤應(yīng)答是對(duì)該表位進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)答的必需條件。為了確認(rèn)vim415-433特異性應(yīng)答依賴(lài)于直接腫瘤識(shí)別，以表達(dá)hla-dr0401的b16腫瘤處理后的小鼠，以vim415-433瓜氨酸化多肽聯(lián)合抗hla-dr阻斷抗體進(jìn)行免疫接種。對(duì)hla-dr的阻斷阻止了抗腫瘤應(yīng)答的發(fā)生(圖26b)。實(shí)施例8：不同物種之間的波形蛋白同源性雞、鼠、狗、羊、牛、馬、豬和人之間的波形蛋白高度保守(圖27)。由于疫苗誘導(dǎo)人、鼠的t細(xì)胞應(yīng)答，以及鼠的抗腫瘤應(yīng)答，可以假定，類(lèi)似應(yīng)答也可見(jiàn)于其他物種中。實(shí)施例9：通過(guò)其他hla單倍型限制的波形蛋白應(yīng)答hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)人vim415瓜氨酸化多肽的單免疫接種產(chǎn)生了有力的ifnγ和il-17應(yīng)答。為了確定這一或其他瓜氨酸化波形蛋白表位可以在其他單倍型中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，在hla-dr1和c57/bl小鼠中，對(duì)涵蓋波形蛋白全長(zhǎng)并包含所有被瓜氨酸殘基取代的精氨酸的一系列20聚體多肽(表8)進(jìn)行ifnγ/il-17應(yīng)答篩選(圖28)。以3種瓜氨酸化波形蛋白多肽和cpg和mpla佐劑的組合對(duì)小鼠免疫接種，然后對(duì)所述組合中的每種多肽單獨(dú)進(jìn)行ifnγ和il-17應(yīng)答的篩選。圖28a顯示，在hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中，瓜氨酸化波形蛋白多肽9、10、14、15和16展示了顯著的ifnγ應(yīng)答(200-350斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞p<0.02)，且多肽10展示了il-17應(yīng)答(350斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞)。圖28b顯示，在c57bl/6小鼠中，瓜氨酸化波形蛋白多肽16、17、18、19和20展示了顯著ifnγ應(yīng)答(300-500斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞p<0.02)，且多肽19和20展示了il-17應(yīng)答(～400斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞p<0.05)。表7展示了所述多肽的序列，瓜氨酸化氨基酸的位點(diǎn)和在波形蛋白中的位點(diǎn)。圖28c展示了以波形蛋白14瓜氨酸化多肽進(jìn)行免疫接種的hla-a2/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)答。表7：瓜氨酸化波形蛋白ifnγ/il-17應(yīng)答瓜氨酸取代的精氨酸殘基以下劃線(xiàn)表示實(shí)施例10如何篩選瓜氨酸化t細(xì)胞表位文獻(xiàn)中所述的任何瓜氨酸化蛋白都可能是潛在的t細(xì)胞目標(biāo)。但是，首先它必須具有在mhci類(lèi)和/或ii類(lèi)mhc抗原上呈遞的能力，且它必須被t細(xì)胞受體所識(shí)別。抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行結(jié)構(gòu)性自體吞噬，且其雙膜自噬體中能夠累積足以激活pad酶(呈遞于mhc抗原上的瓜氨酸表位)的胞內(nèi)ca2+。最后，要成為抗腫瘤標(biāo)靶，腫瘤細(xì)胞必須還在自噬體中誘導(dǎo)瓜氨酸化，并將相同修飾后抗體呈遞在mhc抗原上。因此，要鑒別還能刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)的瓜氨酸化表位，需要篩選誘導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答和腫瘤識(shí)別的靶蛋白。a)瓜氨酸化多肽誘導(dǎo)下的人外周血t細(xì)胞體外增殖人外周血可以如實(shí)施例5所述進(jìn)行體外刺激。可在跨全蛋白的瓜氨酸化20聚體多肽中篩選t細(xì)胞增殖。cd4和cd8t細(xì)胞分類(lèi)，能鑒別cd4和cd8表位，且可以通過(guò)hla分型供體來(lái)鑒別hla限制性。b)以跨全靶蛋白的20聚體瓜氨酸化多肽體外或體內(nèi)刺激來(lái)自常規(guī)或hla轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞為了測(cè)定瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白-8表位能否誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，在涵蓋細(xì)胞角蛋白-8全長(zhǎng)且包含預(yù)期芯樣結(jié)合區(qū)域中被瓜氨酸殘基取代的精氨酸的一系列20聚體多肽(表8)中，篩選hla-dr1和c57bi小鼠中的ifnγ/il-17應(yīng)答(圖29)。以3個(gè)瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白8多肽與cpg和mpla佐劑的組合對(duì)小鼠免疫接種，然后篩選對(duì)該組合中每個(gè)多肽單獨(dú)的ifnγ和il-17應(yīng)答。圖28a展示了hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中表現(xiàn)出顯著ifnγ應(yīng)答(200-300斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞p<0.02)的瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白8多肽1、2、3、13、16和17，以及顯示出il-17應(yīng)答的多肽1、2、3、13和14(250-350斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p<0.02)。圖29b顯示，細(xì)胞角蛋白8多肽未在c57b1小鼠中刺激應(yīng)答。表8瓜氨酸化細(xì)胞角蛋白的ifnγ/il-17應(yīng)答瓜氨酸取代的精氨酸殘基以下劃線(xiàn)表示c)篩選已知瓜氨酸化表位的t細(xì)胞應(yīng)答ing4蛋白在其nls區(qū)域的位點(diǎn)133處被pad4酶瓜氨酸化。這防止了它與p53結(jié)合，該結(jié)合是p53激活所必需的。瓜氨酸化ing4蛋白迅速降解，暗示著它可能在mhcii類(lèi)上大量表達(dá)。ing4多肽aqkklklvrtspeygmp未能在hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中刺激任何免疫應(yīng)答，但aqkklklvcittspeygmp刺激了對(duì)瓜氨酸化多肽的ifnγ/il-17應(yīng)答(平均200斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞)，但對(duì)野生型多肽無(wú)應(yīng)答。對(duì)瓜氨酸化多肽的應(yīng)答被mhcii類(lèi)阻斷mab所阻斷(圖31a)。這是能夠刺激瓜氨酸化/腫瘤特異性cd4應(yīng)答的蛋白的又一示例。d)篩選任意蛋白的瓜氨酸化t細(xì)胞表位如申請(qǐng)人在實(shí)施例2中所示，以編碼全抗原的dna進(jìn)行免疫接種，得到對(duì)瓜氨酸化多肽的應(yīng)答。在此，我們展示了，若以編碼全抗原的dna進(jìn)行免疫接種，并對(duì)所有可能的瓜氨酸化20聚體多肽進(jìn)行篩選，僅對(duì)hla分子呈遞的瓜氨酸化表位的t細(xì)胞應(yīng)答刺激了免疫應(yīng)答。瓜氨酸化多肽組如表7所示。圖33a展示了hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠以波形蛋白dna免疫接種后產(chǎn)生的應(yīng)答，圖33b展示了hla-dr1轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)答。hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠展現(xiàn)出對(duì)瓜氨酸化波形蛋白28-49和415-433的高頻率特異性應(yīng)答，以及對(duì)波形蛋白19-33、26-44和36-54多肽的低頻率應(yīng)答。hla-a2/dr1轉(zhuǎn)基因小鼠展現(xiàn)出對(duì)瓜氨酸化波形蛋白65-77多肽的高頻率特異性應(yīng)答。這證明，編碼全抗原的dna可用于誘導(dǎo)瓜氨酸化t細(xì)胞應(yīng)答，且這是一種用于篩選更多瓜氨酸化t細(xì)胞表位的極好方法。類(lèi)似地，可以通過(guò)在存在高水平鈣的情況下，將蛋白與pad酶共培養(yǎng)，以進(jìn)行間接體內(nèi)瓜氨酸化。這些蛋白質(zhì)可用于對(duì)小鼠免疫接種，隨后針對(duì)所有可能的瓜氨酸化20聚體多肽進(jìn)行篩選。e)篩選根據(jù)mhc結(jié)合評(píng)分和核心區(qū)域中的精氨酸殘基選擇的預(yù)測(cè)多肽。本文展示了，可以在已知瓜氨酸化表位中誘導(dǎo)應(yīng)答，但在此，還展示了可根據(jù)預(yù)測(cè)mhc結(jié)合評(píng)分和存在于核心mhc結(jié)合區(qū)域中的精氨酸殘基，選擇多肽表位。在此實(shí)施例中，多肽以syfpeithi預(yù)測(cè)算法(www.syfpeithi.de)，選自對(duì)hla-dr4具有高結(jié)合預(yù)期的bip、hsp90、cxcl10、cxcl12和ing4，然后進(jìn)一步通過(guò)存在于核心mhc結(jié)合區(qū)域中的精氨酸殘基(以iedb預(yù)測(cè)算法(www.iedb.org)確定)進(jìn)行限制(表9)。對(duì)含有所有轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸的多肽進(jìn)行測(cè)試。表9：預(yù)測(cè)hla-dr4多肽以瓜氨酸化多肽對(duì)hla-dr4轉(zhuǎn)基因小鼠免疫接種至多3次，然后以ifng酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法對(duì)相關(guān)瓜氨酸化多肽和未修飾多肽的應(yīng)答進(jìn)行間接體內(nèi)分析。圖34展示了對(duì)瓜氨酸化bip39-53、bip172-186、hsp90346-360、hsp90456-477和ing444-58的顯著應(yīng)答，相對(duì)于未修飾多肽或背景對(duì)照。這提供了又一種選擇瓜氨酸化t細(xì)胞表位的方法。為了證明所述t細(xì)胞識(shí)別腫瘤，可以對(duì)其進(jìn)行識(shí)別腫瘤靶細(xì)胞的篩選，除酸以促進(jìn)mhc循環(huán)，采用無(wú)血清以誘導(dǎo)自體吞噬(圖22a和22e)。瓜氨酸化和自體吞噬的作用可以使用pad和自體吞噬抑制劑來(lái)加以證實(shí)(圖22a)。體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答可以通過(guò)觸發(fā)腫瘤、以瓜氨酸多肽免疫接種、監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)來(lái)測(cè)量，如圖24-26所示。實(shí)施例11此前的研究表明，可能對(duì)原生cd4細(xì)胞受刺激后根據(jù)其細(xì)胞因子環(huán)境分化為不同輔助表型進(jìn)行測(cè)定。相反地，我們?cè)趫D15中首次公布，某些表位可以無(wú)視細(xì)胞因子環(huán)境地測(cè)定t輔助細(xì)胞分化。瓜氨酸化vim415刺激了th1/il-17表現(xiàn)型，即使是在th2佐劑完全弗氏佐劑的存在下。這暗示著cd4t細(xì)胞受體與mhc多肽的結(jié)合強(qiáng)度能夠決定t細(xì)胞分化?；诖?，我們展示了野生型vim415刺激的il-10應(yīng)答(圖30；平均值580斑點(diǎn)/百萬(wàn)脾細(xì)胞；p＝0.0249)，即使是在th1佐劑cpg/mpla的存在下。但是，未能刺激顯著ifnγ或il-17應(yīng)答。參考文獻(xiàn)1.gao,f.g.,etal.,antigen-specificcd4+t-cellhelpisrequiredtoactivateamemorycd8+tcelltoafullyfunctionaltumorkillercell.cancerres,2002.62(22):p.6438-41.2.janssen,e.m.,etal.,cd4+tcellsarerequiredforsecondaryexpansionandmemoryincd8+tlymphocytes.nature,2003.421(6925):p.852-6.3.fearon,e.r.,etal.,interleukin-2productionbytumorcellsbypassesthelperfunctioninthegenerationofanantitumorresponse.cell,1990.60(3):p.397-403.4.baxevanis,c.n.,etal.,tumor-specificcd4+tlymphocytesfromcancerpatientsarerequiredforoptimalinductionofcytotoxictcellsagainsttheautologoustumor.jimmunol,2000.164(7):p.3902-12.5.cella,m.,etal.,ligationofcd40ondendriticcellstriggersproductionofhighlevelsofinterleukin-12andenhancestcellstimulatorycapacity:t-thelpviaapcactivation.jexpmed,1996.184(2):p.747-52.6.ridge,j.p.,f.dirosa,andp.matzinger,aconditioneddendriticcellcanbeatemporalbridgebetweenacd4+t-helperandat-killercell.nature,1998.393(6684):p.474-8.7.schoenberger,s.p.,etal.,t-cellhelpforcytotoxictlymphocytesismediatedbycd40-cd40linteractions.nature,1998.393(6684):p.480-3.8.ayyoub,m.,etal.,animmunodominantssx-2-derivedepitoperecognizedbycd4+tcellsinassociationwithhla-dr.jclininvest,2004.113(8):p.1225-33.9.halder,t.,etal.,isolationofnovelhla-drrestrictedpotentialtumor-associatedantigensfromthemelanomacelllin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