專(zhuān)利名稱(chēng)：包裝的病毒樣顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答的組合物和方法，所述抗原與由免疫刺激核酸包裝的病毒樣顆粒(VLP)偶合或融合，所述免疫刺激核酸優(yōu)選含有至少一種非甲基化CpG序列和toll樣受體(TLR)配體的低聚核苷酸。本發(fā)明可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答，特別是用于治療變態(tài)反應(yīng)、腫瘤、慢性病毒性疾病和其它慢性病。
相關(guān)領(lǐng)域通常誘導(dǎo)產(chǎn)生與自體抗原有關(guān)的抗體反應(yīng)很難。一種改善接種效率的方法是提高使用抗原的重復(fù)程度。不同于分離蛋白，病毒在沒(méi)有佐劑存在條件下不管有或沒(méi)有T細(xì)胞幫助，都可以迅速有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)(Bachmann and Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1991))。盡管病毒通常只由很少的蛋白構(gòu)成，但它們比起其獨(dú)立的各組分更能觸發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。對(duì)于B細(xì)胞反應(yīng)，已知一種影響病毒致免疫性的重要因素是表面表位的重復(fù)性和排列順序。許多病毒表現(xiàn)為類(lèi)晶體樣表面，顯示了與B細(xì)胞上表位特定免疫球蛋白有效交聯(lián)的表位a的有規(guī)律的排列。(Bachmann andZinkernagel，Immunol.Today17553-558(1996))。B細(xì)胞上表面免疫球蛋白的交聯(lián)是一個(gè)強(qiáng)烈的活化信號(hào)，直接誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程和產(chǎn)生IgM抗體。進(jìn)而，被觸發(fā)的B細(xì)胞激活輔助T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)B細(xì)胞從IgM到IgG抗體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)換和長(zhǎng)期B細(xì)胞記憶的生成-接種疫苗的目的(Bachmannand Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.1 5235-270(1997))。病毒結(jié)構(gòu)甚至與自身免疫病中抗抗體的產(chǎn)生有關(guān)，并且是病原體天然應(yīng)答一部分(參見(jiàn)Fehr，T.，et al.，JExp.1792(1997))。因而，高度組織化病毒表面遞呈的抗原能誘導(dǎo)針對(duì)抗原的強(qiáng)烈抗體應(yīng)答。
然而，正如所指出的那樣，免疫系統(tǒng)通常不能產(chǎn)生針對(duì)自身結(jié)構(gòu)的抗體。對(duì)于低濃度的可溶性抗原，這歸因于輔助T細(xì)胞水平的耐受性。在這些條件下，將自身抗原偶合到能遞送輔助T細(xì)胞的載體上能打破耐受性。對(duì)于高濃度的可溶性蛋白或低濃度的膜蛋白，B和輔助T細(xì)胞是有耐受力的。然而，B細(xì)胞耐受性是可逆的(無(wú)變應(yīng)性)，而且在給予與外來(lái)載體以高度有組織形式偶合的抗原時(shí)可以被打破(Bachmann and Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。
最新證據(jù)表明含有包裝CpG的病毒樣顆粒(VLP)能觸發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生針VLP共軛抗原的應(yīng)答(WO03/024481)。此外，包裝CpG增強(qiáng)了VLP的穩(wěn)定性，基本上除去了上述副作用如導(dǎo)致小鼠骨髓外血生成并伴有脾大和淋巴結(jié)病。
與CpG使TLR9接合到APCs上不同，其它TLR-配體單獨(dú)不能增強(qiáng)VLP誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答(Schwarz et al.，(2003)Eur.J.Immunol.，33，1465-1470)。特別地，TLR2的配體肽聚糖，TLR3的配體poly(IC)，TLR4的配體LPS，TLR5的配體鞭毛蛋白和TLR7的配體imiquimode，都不能以類(lèi)似CpG的方式增強(qiáng)VLP誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答。
近來(lái)，在接種疫苗策略上已經(jīng)有了顯著進(jìn)步，然而現(xiàn)有策略仍有需要改善的地方。特別地，該領(lǐng)域仍需要發(fā)展新的和改良的疫苗，其允許誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T和B細(xì)胞應(yīng)答而不產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，且特別地，允許如天然病原體一樣能有效促進(jìn)強(qiáng)烈CTL免疫應(yīng)答和抗病原保護(hù)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于以下驚人發(fā)現(xiàn)免疫刺激核酸，典型且優(yōu)選能刺激Toll樣受體(TLR9)的含CpG基序的DNA低聚核苷酸，經(jīng)包裝進(jìn)VLP，能增強(qiáng)B和T細(xì)胞對(duì)與VLP偶合或?qū)σ黄鹗褂?，如與包裝的VLP混合使用，的抗原的應(yīng)答然而其它TLRs配體，包括TLR2的配體肽聚糖，TLR3的配體poly(I:C)，TLR4的配體LPS，TLR5的配體鞭毛蛋白和TLR7的配體imiquimode，都不能以類(lèi)似CpG的方式增強(qiáng)VLP誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答(Schwarz et al.，(2003)Eur.J.Immunol.，33，1465-1470)。然而令人吃驚地，盡管TLR9的配體與其它TLRs不同，例如TLR4，不能增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)VLP偶合或融合抗原的應(yīng)答，但在免疫刺激核酸存在條件下，特別在含非甲基化CpG低聚核苷酸存在條件下，他們能有效增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答，因而，在TLRs配體和免疫刺激核酸之間存在協(xié)同增效作用。
在第一個(gè)優(yōu)先實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的組合物，其中包括(a)病毒樣顆粒(VLP)，(b)免疫刺激核酸，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中核酸或低聚核苷酸經(jīng)偶合、融合、或其它方式連接或裝入病毒樣顆粒，如與病毒樣顆粒結(jié)合，優(yōu)選用病毒樣顆粒包裝，(c)至少一種VLP偶合或融合的抗原，或與VLP混合的抗原，和(d)至少一種TLR配體。優(yōu)選將本發(fā)明的TLR配體(d)與VLP(a)混合。
在一個(gè)同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的組合物，其中包括(a)VLP，(b)免疫刺激核酸，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中核酸或低聚核苷酸與病毒樣顆?；旌?，(c)至少一種VLP偶合或融合的抗原或與病毒樣顆?；旌系目乖?，且(d)至少一種TLR配體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫刺激核酸不含CpG基序，但仍表現(xiàn)免疫刺激活性，例如WO 01/22972所描述的核酸。其中所描述的序列在這里引用作為參考。
在一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，含非甲基化CpG的低聚核苷酸經(jīng)磷酸二酯主鏈的硫代磷酸修飾后并未變得穩(wěn)定。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，含非甲基化CpG的低聚核苷酸誘導(dǎo)人體細(xì)胞內(nèi)的IFN-alpha。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，IFN-alpha誘導(dǎo)低聚核苷酸側(cè)翼有富含鳥(niǎo)嘌呤核苷重復(fù)側(cè)翼連接序列，且含有回文序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，病毒樣顆粒是重組病毒樣顆粒。還優(yōu)選，病毒樣顆粒不含脂蛋白膜。優(yōu)選地，重組病毒樣顆粒包括，或可選擇地由下述病毒的重組蛋白組成乙肝病毒，麻疹病毒，辛德比斯病毒，輪狀病毒，口蹄疫病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，諾沃克病毒或人乳頭瘤瘤病毒，RNA噬菌體，Qβ-噬菌體，GA-噬菌體，fr-噬菌體，AP205-噬菌體和Ty。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包括，或可選擇地由一種或多種乙肝病毒核心(衣殼)蛋白(HBcAg)組成。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包括RNA噬菌體的重組蛋白或其片斷片斷，優(yōu)選的RNA噬菌體是Qβ-噬菌體，AP 205-噬菌體，GA-噬菌體，fr-噬菌體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原或抗原混合物是重組抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原、多個(gè)抗原或抗原混合物提取自天然來(lái)源，其中包括但不限于花粉、粉塵、真菌、昆蟲(chóng)、食物、哺乳動(dòng)物表皮、毛發(fā)、唾液、血清、蜜蜂、腫瘤、病原體和羽毛。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原與病毒性顆粒偶合或以遺傳方式融合。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原選自(1)適合誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的多肽；(2)適合誘導(dǎo)針對(duì)傳染病的免疫應(yīng)答的多肽；(3)適合誘導(dǎo)針對(duì)變態(tài)反應(yīng)原的免疫應(yīng)答的多肽；(4)適合誘導(dǎo)針對(duì)自身抗原的提高的免疫應(yīng)答的多肽；和(5)適合誘導(dǎo)養(yǎng)殖動(dòng)物或?qū)櫸锩庖邞?yīng)答的多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原、多個(gè)抗原或抗原混合物選自(1)適合誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的有機(jī)分子；(2)適合誘導(dǎo)針對(duì)傳染病的免疫應(yīng)答的有機(jī)分子；(3)適合誘導(dǎo)針對(duì)變態(tài)反應(yīng)原的免疫應(yīng)答的有機(jī)分子；(4)適合誘導(dǎo)針對(duì)自身抗原的提高的免疫應(yīng)答的有機(jī)分子；和(5)適合誘導(dǎo)養(yǎng)殖動(dòng)物或?qū)櫸锩庖邞?yīng)答的有機(jī)分子；和(6)適合誘導(dǎo)針對(duì)藥物、荷爾蒙和有毒化合物的免疫應(yīng)答的有機(jī)分子。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抗原包括，或可選擇地由細(xì)胞毒性T細(xì)胞或Th細(xì)胞表位組成。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式，抗原包括，或可選擇地由B細(xì)胞表位組成。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，病毒樣顆粒包括乙肝病毒殼蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，另外加入到載有CpG病毒樣顆粒的TLRs配體被TLR4識(shí)別。例如，配體是LPS，優(yōu)選去毒版的LPS，如MPL(Nat Biotechnol 171075)或合成的TLR4配體。
本發(fā)明另一方面，提供了一種增強(qiáng)人或其它動(dòng)物種類(lèi)體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括往動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入一種組合物，包括(a)VLP，(b)免疫刺激核酸，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中核酸或低聚核苷酸經(jīng)混合、偶合、融合，或以其它方式連接或裝入病毒樣顆粒，如與病毒樣顆粒結(jié)合，優(yōu)選用病毒樣顆粒包裝，(c)至少一種VLP偶合或融合的抗原，或與病毒樣顆?；旌系目乖?，和(d)至少一種TLR配體。
也是在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物通過(guò)皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)，動(dòng)物體內(nèi)直接導(dǎo)入或直接引入淋巴結(jié)。在一個(gè)同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，針對(duì)需要預(yù)防接種的人，該增強(qiáng)免疫組合物在局部使用，靠近腫瘤或局部病毒儲(chǔ)庫(kù)(local vical reservoir)。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面是，免疫應(yīng)答是T細(xì)胞應(yīng)答，且T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答增強(qiáng)了。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，T細(xì)胞應(yīng)答是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，且細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答增強(qiáng)了。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答是B細(xì)胞應(yīng)答，且B細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答增強(qiáng)了。
本發(fā)明還涉及一種疫苗，其中包括免疫學(xué)有效量的本發(fā)明所述增強(qiáng)免疫組合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。本發(fā)明也提供了一種免疫和/或治療動(dòng)物的方法，其中包括給予動(dòng)物免疫學(xué)有效量的所公開(kāi)之疫苗。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，針對(duì)與修飾后VLP偶合或混合的抗原，將含免疫刺激核酸的VLP，和優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸VLP用作動(dòng)物或人的接種疫苗。修飾后的VLP能用于接種針對(duì)例如腫瘤、病毒病、或自身分子，疫苗能用作預(yù)防或治療目的，或二者兼顧。修飾后的VLP能用于接種預(yù)防變態(tài)反應(yīng)，或與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病如哮喘，以誘導(dǎo)針對(duì)變態(tài)反應(yīng)原的免疫偏離和/或抗體應(yīng)答。如接種疫苗和治療分別能使得，如使以前患過(guò)敏癥的動(dòng)物和病人脫敏。
在多數(shù)情況下，預(yù)期免疫應(yīng)答直接針對(duì)與含免疫刺激核酸偶合或混合的抗原，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸VLP?？乖嵌嚯?、蛋白或功能域及其混合物。
優(yōu)選的注射途徑是皮下注射或肌內(nèi)注射，但也可將含CpG的VLP通過(guò)皮內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)或直接用于淋巴結(jié)。在一個(gè)同樣優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)于進(jìn)行接種預(yù)防的人，與抗原混合或偶合的含CpG的VLP在局部使用，靠近腫瘤或局部病毒灶。
顯而易見(jiàn)前面的概述和下面的詳細(xì)描述僅僅是示范性的和解釋性的，目的是對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行進(jìn)一步的解釋。


圖1顯示VLP在對(duì)照孵育后或在用核糖核酸酶A消化后的非變性瓊脂凝膠電泳(1％瓊脂)，上面用溴乙非啶(A)或考馬斯藍(lán)(B)染色以檢測(cè)RNA或蛋白質(zhì)的存在。
將重組獲得的VLP用最終濃度為0.5μg/μl的蛋白質(zhì)PBS緩沖液稀釋?zhuān)⑶以诤颂呛怂崦窤(100μg/ml)缺失(泳道1)或存在(泳道2)、溫度37℃條件下孵育兩小時(shí)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士瑞士)。樣品隨后補(bǔ)入6倍濃度的DNA載樣緩沖液(MBS FermentasGmbH，Heidelberg，德國(guó))，在100v電壓下在1％非變性瓊脂凝膠中跑30分鐘。用μlGene Rμler標(biāo)記(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德國(guó)))作為VLP遷移速率的參照(泳道M)。各泳帶表明裝入VLP(A)內(nèi)的RNA的存在或VLP自身(B)的存在。在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中也獲得相同結(jié)果。
圖2顯示在僅有緩沖液或含CpG的DNA低聚核苷酸時(shí)，VLP在對(duì)照孵育后或在用核糖核酸酶A消化后的非變性瓊脂凝膠電泳(1％瓊脂)，上面用溴乙非啶(A)或考馬斯藍(lán)(B)染色以檢測(cè)RNA/DNA或蛋白質(zhì)的出現(xiàn)。將重組獲得的VLP用最PBS緩沖液稀釋?zhuān)K濃度為0.5μg/μl蛋白質(zhì)，并且在核糖核酸酶A(100μg/ml)缺失(泳道1)或存在(泳道2)、溫度37℃條件下孵育兩小時(shí)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)。在核糖核酸酶A消化前，將5nmol CpG-低聚核苷酸(含磷酸主鏈的硫代磷酸修飾物)加入樣品3。用Gene Ruler標(biāo)記(MBSFermentas GmbH，Heidelberg，德國(guó)))作為p33-VLP遷移速率的參照(泳道M)。各泳帶表明裝入p33-VLP(A)內(nèi)的RNA/CpG-DNA的存在或p33-VLP自身(B)的存在。將正常磷鍵的CpG低聚核苷酸用于VLP與核糖核酸A的共孵育時(shí)得到的是可比的結(jié)果。
圖3顯示存在含CpG的DNA低聚核苷酸時(shí)，p33-VLP在用核糖核酸酶A消化之前或之后隨后進(jìn)行透析(除去未結(jié)合VLP的CpG低聚核苷酸)的非變性瓊脂凝膠電泳(1％瓊脂)，用溴乙非啶溴化物(A)或考馬斯藍(lán)(B)染色以檢測(cè)DNA或蛋白質(zhì)的出現(xiàn)。將重組VLP用μgμlPBS緩沖液稀釋至最終濃度為0.5μg/μl蛋白質(zhì)，并且在核糖核酸酶A(100μg/ml)缺失(泳道1)或存在(泳道2至5)、溫度37℃條件下孵育兩小時(shí)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)。在核糖核酸酶A消化前，將50nmol CpG-低聚核苷酸(含硫代磷酸鍵的硫代磷酸修飾物泳道2和3，含正常磷酸主鏈的磷修飾物泳道4和5)加入VLP。
用PBS(4500倍稀釋)將樣品徹底透析24小時(shí)，采用300kDaMWCO透析膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，USA)除去過(guò)量的DNA(泳道3and 5)。用(Gene Ruler標(biāo)記(MBS FermentasGmbH，Heidelberg，德國(guó)))作為p33-VLP遷移速率的參照(泳道M)。各泳帶表明裝入VLP(A)內(nèi)的RNA/CpG-DNA的存在或VLP自身(B)的存在。
圖4顯示VLP在對(duì)照孵育后或在用核糖核酸酶A消化后的非變性瓊脂凝膠電泳(1％瓊脂)，其中含CpG的DNA低聚核苷酸在RNA消化完成后才加入，上面用溴乙非啶溴化物(A)或考馬斯藍(lán)(B)染色以檢測(cè)DNA/RNA或蛋白質(zhì)的出現(xiàn)。將重組VLP用PBS緩沖液稀釋至最終濃度為0.5μg/μl的蛋白質(zhì)，并且在核糖核酸酶A(100μg/ml)缺失(泳道1)或存在(泳道2和3)、溫度37℃條件下孵育兩小時(shí)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)。
在核糖核酸酶A消化后，5nmolCpG-低聚核苷酸(含磷酸主鏈的硫代磷酸修飾物)才加入樣品3。用Gene Ruler(MBS Fermentas GmbH，Heidelberg，德國(guó)))作為p33-VLP遷移速率的參照(泳道M)。各泳道表明裝入VLP(A)內(nèi)的RNA/CpG-DNA的存在或VLP自身(B)的存在。當(dāng)正常磷鍵的CpG低聚核苷酸用于VLP的重新組裝時(shí)得到類(lèi)似的結(jié)果。
圖5顯示各種不同的TLRs配體，其中TLR9配體CpG例外，不能增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)乙肝病毒核抗原融合肽p33(p33-VLP)的應(yīng)答。在PBS或TLRs的指示刺激物存在條件下用p33-VLP使小鼠免疫。使用100μg的HBc33和100μg的佐劑。8天后通過(guò)四聚物染色法檢測(cè)p33-特定T細(xì)胞的頻率。每根棒代表一個(gè)小鼠個(gè)體。(LTA＝脂磷壁酸，PGN＝肽聚糖，LPS來(lái)自E.coliK-235，Sigma).
圖6顯示原型佐劑礬和IFA不能增強(qiáng)VLP-誘導(dǎo)的免疫性。在PBS，CpG，礬orIFA存在條件下，用p33-VLP給小鼠接種，8天后以活LCMV(200pfu)攻擊。五天后測(cè)定脾內(nèi)病毒效價(jià)。
圖7顯示TLR4配體增強(qiáng)了針對(duì)與裝載有CpG的VLP偶合的p33的CTL應(yīng)答。在PBS、LPS、或MPL(1∶1混合)存在條件下，用與裝載有NK-PO CpG的Qb偶合的p33給小鼠接種，8天后，用四聚物染色法(A)檢測(cè)p33-特定T細(xì)胞的頻率，在同一天，用重組疫苗病毒表達(dá)的LCMV-GP攻擊小鼠并在五天后測(cè)定卵巢內(nèi)病毒效價(jià)(B).
發(fā)明詳述除非另有定義，這里用的所有科技術(shù)語(yǔ)都與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)所能理解的含義相同。盡管任何與此處描述類(lèi)似或相同的方法和原料都可以用于實(shí)施或驗(yàn)證本發(fā)明，后面只對(duì)優(yōu)選的方法和原料進(jìn)行描述。
1.定義氨基酸連接體這里所用的″氨基酸連接體″，或在說(shuō)明書(shū)里以術(shù)語(yǔ)″連接體″稱(chēng)之，連接抗原或抗原決定簇至第二附著位點(diǎn)，或更優(yōu)選，其中已經(jīng)包括或含有第二附著位點(diǎn)，典型的但不是必需的如一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。然而這里所用的術(shù)語(yǔ)″氨基酸連接體″，并非用于暗示這樣一個(gè)氨基酸連接體僅僅由氨基酸殘基組成，即使含有氨基酸殘基的氨基酸連接體是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。氨基酸連接體的氨基酸殘基，優(yōu)選地，由天然發(fā)生的氨基酸組成或本領(lǐng)域公知的非天然氨基酸組成，所有-L或所有-D或其混合物。然而，一個(gè)包括帶巰基的分子或半胱氨酸殘基的氨基酸連接體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類(lèi)優(yōu)選包括C1-C6烷基-，環(huán)烷基(C5，C6)，芳基-或雜芳基部分的分子。但是，在氨基酸連接體之外，優(yōu)選包括C1-C6烷基-，環(huán)烷基-(C5，C6)，芳基-或雜芳基部分的連接體和不含任何氨基酸的連接體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？乖蚩乖瓫Q定簇或任意第二附著位點(diǎn)與氨基酸連接體之間的連接優(yōu)選通過(guò)至少一種共價(jià)鍵，更優(yōu)選通過(guò)至少一種肽鍵。
動(dòng)物這里所用術(shù)語(yǔ)″動(dòng)物″的意思包括，例如人，綿羊，馬，牛，豬，狗，貓，大鼠，小鼠，鳥(niǎo)，爬行類(lèi)，魚(yú)，昆蟲(chóng)和蜘蛛。
抗體這里所用術(shù)語(yǔ)“抗體”指包括能結(jié)合到表位或抗原決定簇上的分子。術(shù)語(yǔ)的意思包括所有的抗體和其抗原結(jié)合片斷片斷，包括單鏈抗體。最為優(yōu)選的抗體是人抗原結(jié)合抗體片斷片斷，包括但不限于Fab，F(xiàn)ab′和F(ab′)2，F(xiàn)d，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和包括VL或VH域的片斷片斷?？贵w可以來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源包括鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選抗體是人、鼠、兔子、山羊、幾內(nèi)亞豬、駱駝、馬或雞。這里所使用的“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體和包括分離自人免疫球蛋白庫(kù)的抗體或分離自一種或多種人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的且不表達(dá)免疫球蛋白的抗體，例如在Kucherlapati等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,939,598中所描述的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物用于設(shè)計(jì)治療變態(tài)反應(yīng)的疫苗。IgE同型抗體是變應(yīng)性反應(yīng)的重要成分。肥大細(xì)胞在其表面結(jié)合IgE抗體，釋放組胺和其它變應(yīng)性反應(yīng)介質(zhì)，使特定的抗原與結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的IgE分子結(jié)合。因而，IgE抗體抑制產(chǎn)物是免除變態(tài)反應(yīng)的很有希望的一個(gè)目標(biāo)。這是可能通過(guò)達(dá)到獲得預(yù)期的輔助T細(xì)胞應(yīng)答實(shí)現(xiàn)的。輔助T細(xì)胞應(yīng)答可以分為1型(TH1)和2型(TH2)輔助T細(xì)胞應(yīng)答(Romagnani，Immunol.Today 18263-266(1997))。TH1細(xì)胞分泌Y干擾素和其它引發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體的細(xì)胞因子。與之不同，TH2細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵性的細(xì)胞因子是IL-4，促使B細(xì)胞產(chǎn)生IgE。在許多試驗(yàn)體系中，TH1和TH2應(yīng)答的發(fā)展是互相排他的，因?yàn)門(mén)H1細(xì)胞壓制了TH2細(xì)胞誘導(dǎo)，反之亦然。因而，引發(fā)強(qiáng)烈TH1應(yīng)答的抗原同時(shí)抑制了TH2應(yīng)答的發(fā)展，因此抑制了IgE抗體的產(chǎn)生。高濃度IgG抗體的出現(xiàn)可以阻止抗原與結(jié)合IgE的肥大細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制了組胺的釋放。因而，IgG抗體的出現(xiàn)可以保護(hù)遠(yuǎn)離IgE引起的變態(tài)反應(yīng)。導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的典型物質(zhì)包括，但不限于花粉(如草，豕草，樺或西洋杉)；室內(nèi)粉塵和塵螨；哺乳動(dòng)物表皮變態(tài)反應(yīng)原和動(dòng)物頭皮屑；霉菌和真菌；昆蟲(chóng)尸體和昆蟲(chóng)毒液；羽毛；食物；和藥物(例如，青霉素)。參見(jiàn)Shoμgh，H.等人的REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，19th edition，(Chap.82)，Mack Publishing Company，Mack Publishing Group，Easton，Pennsylvania(1995)，這里全文引用作為參考。因而，凡是用與含包裝富含非甲基化CG基序的DNA的病毒樣顆?；旌系淖儜?yīng)原免疫接種的個(gè)體，無(wú)論在變態(tài)反應(yīng)開(kāi)始前還是開(kāi)始后都會(huì)獲益。
抗原這里所用的術(shù)語(yǔ)″抗原″指能被抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子，如由MHC分子遞呈的話。這里所用的術(shù)語(yǔ)″抗原″也包括T細(xì)胞表位。抗原還要能被免疫系統(tǒng)識(shí)別和/或能誘導(dǎo)人產(chǎn)生能導(dǎo)致B或T淋巴細(xì)胞活化的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而這要求，至少在某些情況下要求，抗原含有Th細(xì)胞表位或與Th細(xì)胞連接并通過(guò)佐劑給予。一個(gè)抗原可以有一個(gè)或多個(gè)表位(B-和T-表位)。參照上述內(nèi)容特異性應(yīng)答的意思是指示該抗原優(yōu)選，典型地是以高度選擇性的方式，與其對(duì)應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)，而不與多數(shù)可由其它抗原喚起的其它抗體或TCRs反應(yīng)。這里所用的抗原可以是幾種單一抗原的混合物。
這里所用的″微生物抗原″是一種微生物的抗原，包括但不限于傳染性病毒、傳染性細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和傳染性真菌。此類(lèi)抗原包括完整的微生物和天然分離物和其片斷或衍生物，也包括誘導(dǎo)針對(duì)特定微生物的免疫應(yīng)答，與天然微生物抗原相同或相似的合成或重組化合物，一個(gè)化合物與天然微生物抗原相似，如果其誘導(dǎo)針對(duì)天然微生物抗原的免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞)。這些抗原在本領(lǐng)域按常規(guī)方法使用，且為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。
這里所用的作為微生物抗原的傳染性病毒、細(xì)菌和傳染性真菌的例子，在WO03/024481中有述(第23頁(yè)最后一段至第25頁(yè)第3段)，其中所公開(kāi)的內(nèi)容這里引用作為參考。
本發(fā)明的組合物和方法也用于通過(guò)刺激針對(duì)癌癥抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答來(lái)治療癌癥。這里所用的“腫瘤抗原″是化合物，如與腫瘤或癌癥相關(guān)，能刺激免疫應(yīng)答的肽。特別地，化合物在MHC分子形式遞呈時(shí)能激起免疫應(yīng)答.腫瘤抗原從癌細(xì)胞中制備，比如從癌細(xì)胞的粗提物制備，如Cohen等人在Cancer Research，541055(1994)所描述的，或通過(guò)部分純化抗原，通過(guò)重組技術(shù)或通過(guò)已有抗原的重頭合成。腫瘤抗原包括整個(gè)腫瘤或癌多肽或其抗原部分。這類(lèi)抗原能通過(guò)分離、重組或其本領(lǐng)域公知方法制備。癌癥或腫瘤包括但不限于膽管癌、腦癌、乳房癌、宮頸癌、絨膜癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、上皮內(nèi)瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌)、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌、腎癌，以及其它癌癥和肉瘤。
變態(tài)反應(yīng)原在脊椎動(dòng)物體內(nèi)也作為抗原。這里所用的術(shù)語(yǔ)″變態(tài)反應(yīng)原″也包括″變態(tài)反應(yīng)原提取物″和″變態(tài)反應(yīng)原表位″。變態(tài)反應(yīng)原的例子包括，但不限于花粉(例如草、豕草、樺和西洋杉)；室內(nèi)粉塵和塵螨；哺乳動(dòng)物表皮變態(tài)反應(yīng)原和動(dòng)物皮屑、霉菌和真菌、昆蟲(chóng)尸體和昆蟲(chóng)毒液、羽毛、食物和藥物(如青霉素)。
抗原決定簇這里所用的術(shù)語(yǔ)″抗原決定簇″的意思指抗原的一部分，能被B或T淋巴細(xì)胞特異性地識(shí)別。對(duì)于相應(yīng)的抗原決定簇，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而T淋巴細(xì)胞通過(guò)為介導(dǎo)細(xì)胞和/或體液免疫所必需的增殖和效應(yīng)子功能的確立來(lái)應(yīng)答抗原決定簇。
抗原呈遞細(xì)胞這里所用的術(shù)語(yǔ)″抗原呈遞細(xì)胞″的意思指一群異源的白細(xì)胞人群或骨髓來(lái)源的細(xì)胞，具有免疫刺激功能。例如，這類(lèi)細(xì)胞能生成與MHC分子結(jié)合的肽，其中MHC分子能被T細(xì)胞識(shí)別。該術(shù)語(yǔ)與″佐細(xì)胞″含義相同，包括如胰島細(xì)胞，交錯(cuò)突細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在某些條件下，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和其它，非骨髓來(lái)源細(xì)胞也可作為抗原呈遞細(xì)胞。
締合這里所用的術(shù)語(yǔ)“締合”當(dāng)其用于第一和第二附著位點(diǎn)時(shí)指的是第一和第二附著位點(diǎn)的結(jié)合，優(yōu)選通過(guò)至少一種非肽鍵結(jié)合。天然的締合可以是共價(jià)鍵、離子鍵、疏水鍵、極性鍵或其組合，優(yōu)選的天然締合是共價(jià)鍵，更優(yōu)選的締合通過(guò)至少一種，優(yōu)選一種非肽鍵。這里所用的術(shù)語(yǔ)“締合”當(dāng)其用于第一和第二附著位點(diǎn)時(shí)，不僅包括第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)的直接結(jié)合或締合形成本發(fā)明的組合物，也包括，選擇地或優(yōu)選地，第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)間接地結(jié)合或締合獲得本發(fā)明的組合物，這里典型地和優(yōu)選地通過(guò)使用異雙功能交聯(lián)劑結(jié)合。
第一附著位點(diǎn)這里所用的短語(yǔ)″第一附著位點(diǎn)″指非天然或天然來(lái)源的元件，典型和優(yōu)選地，包括于病毒樣顆粒，而第二位點(diǎn)，典型和優(yōu)選地包括于抗原或抗原決定簇，與之締合。第一附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、維生素A醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化物)，或其組合，或其化學(xué)活性基團(tuán)。典型和優(yōu)選地，第一附著位點(diǎn)位于病毒樣顆粒的表面。多數(shù)第一附著位點(diǎn)出現(xiàn)于病毒樣顆粒的表面，典型為重復(fù)構(gòu)型。優(yōu)選地，第一附著位點(diǎn)是氨基酸或其化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。
第二附著位點(diǎn)這里所用的短語(yǔ)″第二附著位點(diǎn)″指與抗原或抗原決定簇相締合的元件，典型和優(yōu)選地，包括于抗原或抗原決定簇，位于病毒樣顆粒表面的第一附著位點(diǎn)與之締合。抗原或抗原決定簇的第二附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、維生素A醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化物)，或其組合，或其化學(xué)活性基團(tuán)。至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)出現(xiàn)在抗原或抗原決定簇上。因此，術(shù)語(yǔ)“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇”指至少含有抗原或抗原決定簇和第二附著位點(diǎn)的抗原或抗原構(gòu)造。然而，特別地，對(duì)于非天然來(lái)源的第二附著位點(diǎn)，也就是非抗原或抗原決定簇內(nèi)非天然發(fā)生的那些，這些抗原或抗原構(gòu)造含有“氨基酸連接體”。
結(jié)合這里所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指共價(jià)結(jié)合，例如本發(fā)明免疫刺激核酸與病毒樣顆粒的化學(xué)偶合，或非共價(jià)結(jié)合，例如離子相互作用，疏水相互作用，氫鍵等。共價(jià)鍵的例子如酯鍵、醚鍵、磷酸酯鍵、酰胺鍵、肽鍵、亞胺鍵、碳-硫鍵、碳-磷鍵和類(lèi)似鍵。該術(shù)語(yǔ)也包括物質(zhì)封裝或部分封裝。術(shù)語(yǔ)″結(jié)合″范圍更大，包括術(shù)語(yǔ)如″偶合″、″融合″、″封裝″和″附著″。此外，關(guān)于與病毒樣顆粒結(jié)合免疫刺激物質(zhì)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”也包括免疫刺激物質(zhì)的封裝或部分封裝。因此，關(guān)于與病毒樣顆粒結(jié)合的免疫刺激核酸，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”范圍更大，包括“術(shù)語(yǔ)”如″偶合″、″融合″、″封裝″、″包裝″和″附著″。例如，免疫刺激核酸如含非甲基化CpG的低聚核苷酸可以封裝于VLP卻沒(méi)有實(shí)質(zhì)上的結(jié)合，既不是以共價(jià)鍵方式也不是以非共價(jià)鍵方式，這類(lèi)低聚核苷酸被固定僅僅是通過(guò)“包裝”。
偶合這里所用的術(shù)語(yǔ)“偶合”通過(guò)共價(jià)鍵附著或通過(guò)強(qiáng)的非共價(jià)相互作用附著，典型和優(yōu)選地通過(guò)共價(jià)鍵附著。此外，關(guān)于抗原與病毒樣顆粒的偶合，術(shù)語(yǔ)“偶合”優(yōu)選指分別至少通過(guò)一個(gè)非肽鍵的締合和連接。任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于偶合生物活性材料的常規(guī)方法都可以用于本發(fā)明。
融合這里所用的術(shù)語(yǔ)″融合″指不同來(lái)源的氨基酸序列通過(guò)其編碼核苷酸序列的符合讀框的聯(lián)合形成的以一條多肽鏈形式的組合。術(shù)語(yǔ)″融合″很清楚地包括內(nèi)部融合，也就是在與其一個(gè)末端的融合之外，不同來(lái)源序列的插入多肽鏈之中。
CpG這里所用的術(shù)語(yǔ)″CpG″指低聚核苷酸，其中包括至少一個(gè)非甲基化胞嘧啶，鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸序列(如″CpG-低聚核苷酸″或含胞嘧啶的DNA，胞嘧啶后面是鳥(niǎo)嘌呤，兩者通過(guò)磷酸酯鍵相連)，且刺激/激活，如有致有絲分裂效應(yīng)，或誘導(dǎo)或通過(guò)脊椎動(dòng)物骨髓來(lái)源的細(xì)胞提升細(xì)胞因子表達(dá)。例如，CpG用于激活B細(xì)胞，NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，如樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CpG也包括核苷酸類(lèi)似物，如含硫代磷酸酯鍵且能可以是雙鏈或單鏈的核苷酸類(lèi)似物。一般而言，雙鏈分子在體內(nèi)更穩(wěn)定，而單鏈分子有更高的免疫活性。
外殼蛋白這里所用的術(shù)語(yǔ)″外殼蛋白″指噬菌體或RNA-噬菌體蛋白質(zhì)(s)，能合并入噬菌體或RNA-噬菌體裝配衣殼中。然而，當(dāng)所指為RNA-噬菌體外殼蛋白基因的特異性基因產(chǎn)物時(shí)，使用術(shù)語(yǔ)″CP″。例如，RNA-噬菌體Qβ外殼蛋白基因的特異性基因產(chǎn)物被指稱(chēng)為″Qβ CP″，鑒于此，噬菌體Qb″外殼蛋白″包括″Qβ CP″以及A1蛋白。噬菌體Qβ衣殼主要由Qβ CP組成，還有少量的A1蛋白。同樣地，VLPQ外殼蛋白主要含有Qβ CP，和少量的A1蛋白。
表位這里所用的術(shù)語(yǔ)″表位″指多肽的連續(xù)或非連續(xù)部分，在動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，更優(yōu)選在人體內(nèi)有抗原或免疫活性。表位在MHC分子環(huán)境下通過(guò)其T細(xì)胞受體被抗體或T細(xì)胞識(shí)別。這里所用的″致免疫表位″被定義為多肽一部分，能引起在動(dòng)物體內(nèi)抗體應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答，可由本領(lǐng)域任何已知方法測(cè)得。(參見(jiàn)，如，Geysenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983)).這里所用的術(shù)語(yǔ)″抗原表位″，被定義為蛋白的一部分，在此部分抗體能免疫特異性地結(jié)合其抗原，這一點(diǎn)由本領(lǐng)域任何公知的方法測(cè)得。免疫特異結(jié)合將非特異結(jié)合排出在外，但不必排除與其它抗原的交叉反應(yīng)?？乖砦徊⒎潜匦枋侵旅庖叩??？乖砦灰部墒荰細(xì)胞表位，這種情況下他們能在MHC分子環(huán)境之下通過(guò)T細(xì)胞受體免疫特異地結(jié)合。
表位在其空間構(gòu)型中可包括3個(gè)氨基酸對(duì)于其表位是獨(dú)特的。一般來(lái)說(shuō)，表位由至少約5個(gè)這樣的氨基酸組成，更常見(jiàn)地，由約8-10個(gè)這樣的氨基酸組成。如果表位為有機(jī)分子，它可以與硝基苯一樣小。
免疫應(yīng)答這里所用的術(shù)語(yǔ)″免疫應(yīng)答″指體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B-和/或T-淋巴細(xì)胞和/或抗原呈遞細(xì)胞的活化或增殖，然而，免疫應(yīng)答的強(qiáng)度可能較低，只有在使用至少一種本發(fā)明的物質(zhì)后才能檢測(cè)到?！逯旅庖叩摹逯杆幬锎碳せ钌矬w的免疫系統(tǒng)，使免疫系統(tǒng)的一種或多種功能獲得提升，且直接指向致免疫原。“致免疫多肽″是引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的多肽，無(wú)論單獨(dú)還是與其它載體連接，有還是沒(méi)有佐劑。優(yōu)選地，抗原呈遞細(xì)胞可被激活。
免疫這里所用的術(shù)語(yǔ)″使免疫″或″免疫″或相關(guān)術(shù)語(yǔ)指的是授予能針對(duì)靶抗原或表位的逐步積累巨大的免疫應(yīng)答的能力(包括抗體和/或細(xì)胞免疫性，如效應(yīng)器CTL)。這些術(shù)語(yǔ)不要求獲得完全的免疫性，但所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答顯著大于基線。例如，哺乳動(dòng)物將被認(rèn)為對(duì)靶抗原免疫，如果應(yīng)用本發(fā)明方法后發(fā)生了對(duì)靶抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。
免疫刺激核酸這里所用的術(shù)語(yǔ)免疫刺激核酸指能誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的核酸。這里所用的免疫刺激核酸包括核糖核酸，特別是脫氧核糖核酸。優(yōu)選地，免疫刺激核酸含有至少一個(gè)CpG基序，例如CG二核苷酸，其中C非甲基化。CG二核苷酸可以是回文回文序列的一部分或能被非回文序列圍繞在內(nèi)。上述不含CpG基序的免疫刺激核酸包括，例如缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有帶甲基化CG二核苷酸的CG基序的核酸。這里所用的術(shù)語(yǔ)″免疫刺激核酸″應(yīng)該也指含改性堿基的核酸，如4-溴-胞嘧啶。
免疫刺激物這里所用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激物”指一種能誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。這里所用的免疫刺激物，包括但不限于，toll樣受體激活物和誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌物。Toll樣受體激活物包括但不限于免疫刺激核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激有機(jī)物如紫杉醇。
混合的這里所用的術(shù)語(yǔ)“混合的”指兩種或兩種以上物質(zhì)、成分或元件加在一起的聯(lián)合，彼此之間不是化學(xué)結(jié)合，是能分離開(kāi)的。
低聚核苷酸這里所用的術(shù)語(yǔ)″低聚核苷酸″或″低聚物″指包括2個(gè)或更多核苷酸的核酸序列，一般至少約6個(gè)至約100,000核苷酸，優(yōu)選約6個(gè)至約2000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選約6個(gè)到約300個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選約20至約300個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選約20至約100個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)″低聚核苷酸″或″低聚物″也指包括超過(guò)100指約2000個(gè)核苷酸的核酸序列，優(yōu)選超過(guò)100至約1000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選約超過(guò)100至約500個(gè)核苷酸?！宓途酆塑账帷逡话阋仓溉魏味嗑酆颂呛塑账峄蚨嗑勖撗鹾颂呛塑账?，其可以是未改性RNA或DNA或改性RNA或DNA。修飾可包括主鏈或核酸類(lèi)似物?！宓途酆塑账帷灏ǎ幌抻?，單鏈和雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈和雙鏈RNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA，以及包括單鏈或更典型地雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA和RNA的雜交分子。此外″低聚核苷酸″指包括RNA或DNA或RNA與DNA兼有的三鏈區(qū)。低聚核苷酸還可是合成的、基因組的或重組的，例如λ-DNA，粘粒DNA，人造細(xì)菌染色體，酵母人造染色體和絲狀噬菌體如M13。
術(shù)語(yǔ)″低聚核苷酸″也包括為了穩(wěn)定或其它原因含一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNAs或RNAs，及主鏈修飾的DNAs或RNAs。例如，適當(dāng)?shù)暮怂嵝揎椢?類(lèi)似物包括肽核酸、肌苷(inosin)、三苯甲游基化堿基，硫代磷酸基，烷基硫代磷酸基，5-硝基吲哚脫氧呋喃核糖基，5-甲基脫氧胞嘧啶和5，6-二氫-5，6-二羥基脫氧脫氧胸苷?？梢詫?duì)DNA和RNA進(jìn)行各種不同的修飾，因而，″低聚核苷酸″包括典型常見(jiàn)于自然界的多核苷酸的化學(xué)的、酶的或代謝修飾形態(tài)，以及病毒和細(xì)胞DNA和RNA特性的化學(xué)形態(tài)。其它核苷酸類(lèi)似物/修飾物對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
包裝這里所用的術(shù)語(yǔ)″包裝″指免疫刺激物質(zhì)的狀態(tài)，特別是與VLP有關(guān)的免疫刺激核酸的狀態(tài)。這里所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”包括共價(jià)鍵，例如化學(xué)偶合或非共價(jià)鍵，例如離子相互作用、疏水鍵相互作用或氫鍵等。例如，共價(jià)鍵可以是如，酯鍵、醚鍵、磷酸酯鍵、酰胺鍵、肽鍵、亞胺鍵、碳-硫鍵、碳-磷鍵和類(lèi)似鍵。術(shù)語(yǔ)″包裝″包括術(shù)語(yǔ)如″偶合″和″連接″，且特別地，優(yōu)選術(shù)語(yǔ)“包裝″也包括物質(zhì)封裝或部分封裝。例如，免疫刺激物質(zhì)如含非甲基化CpG的低聚核苷酸可以被封裝入VLP而不用任何實(shí)際上的結(jié)合，既不用共價(jià)鍵也不用非共價(jià)鍵。因此，優(yōu)選的含義，這里所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”，如果所述免疫刺激物質(zhì)是免疫核酸，則特別表明包裝狀態(tài)的核酸不受DNAse或RNAse的水解作用的影響。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫刺激核酸包裝在VLP衣殼內(nèi)，更優(yōu)選以非共價(jià)鍵的方式。
PCR產(chǎn)物這里所用的術(shù)語(yǔ)″PCR產(chǎn)物″指靶DNA序列的擴(kuò)增拷貝，其中靶DNA序列起到PCR起始材料的作用。靶序列包括，例如雙鏈DNA。用于PCR的DNA來(lái)源可以是互補(bǔ)DNA，也稱(chēng)作″cDNA″，可以是mRNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。用于PCR的DNA來(lái)源可以是提取自細(xì)胞中的總基因組DNA?？梢詮闹刑崛NA用于PCR的細(xì)胞的來(lái)源包括，但不限于血樣；人、動(dòng)物、或植物組織；真菌；和細(xì)菌。用于PCR的DNA反應(yīng)起始物可以是未純化的、部分純化的，或高度純化的。用于PCR的DNA來(lái)源來(lái)自于載體中的克隆插入物，其中包括但不限于，質(zhì)體載體和噬菌體載體。術(shù)語(yǔ)″PCR產(chǎn)物″與術(shù)語(yǔ)″聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物″可互換。
本發(fā)明組合物可任意與藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)合。這里所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指一種或多種適于對(duì)人體或其它動(dòng)物進(jìn)行給藥的適宜的固體或液體填充劑，稀釋劑或裝膠囊物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“載體”指示有機(jī)或無(wú)機(jī)成分，天然或合成，活性成分與之結(jié)合以獲得更好地應(yīng)用。
多肽這里所用的術(shù)語(yǔ)“多肽″指通過(guò)酰胺鍵(已知如肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。它指示一個(gè)氨基酸分子鏈，而不是特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因而，肽、低聚肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽的定義中。該術(shù)語(yǔ)也用來(lái)指多肽的表達(dá)前修飾物，例如糖基化、乙酰化、磷酸化和類(lèi)似修飾物。重組或衍生的多肽不必轉(zhuǎn)化自指定的核酸序列。它可以以任何方式生成，包括化學(xué)合成。
″增強(qiáng)″免疫應(yīng)答的物質(zhì)指相對(duì)于不加入該物質(zhì)時(shí)所測(cè)量的同一免疫應(yīng)答，能觀察當(dāng)該物質(zhì)加入時(shí)，免疫反應(yīng)以任意方式增大或增強(qiáng)或偏離。例如，在有和沒(méi)有該物質(zhì)的情況下，測(cè)量細(xì)胞毒性T細(xì)胞的溶胞活性，例如用51Cr釋放射線測(cè)試。當(dāng)活性相對(duì)于沒(méi)有該物質(zhì)的CTL溶胞活性增強(qiáng)時(shí)該物質(zhì)的用量被稱(chēng)為增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)抗原免疫應(yīng)答的足夠量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答增強(qiáng)至少約2倍、更優(yōu)選約3倍或更多。分泌的細(xì)胞因子的量或類(lèi)型可以改變?？蛇x擇地，誘導(dǎo)的抗體量和其分型可以改變。
有效量這里所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指必需的劑量或足夠的劑量以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的生物效應(yīng)。組合物的有效量應(yīng)當(dāng)獲得選定的結(jié)果，這樣一個(gè)劑量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)可以決定的。例如，用于治療免疫系統(tǒng)缺乏的有效量應(yīng)是激活免疫系統(tǒng)所需的劑量，遇到抗原時(shí)發(fā)生抗原特異性免疫應(yīng)答。該術(shù)語(yǔ)與″足夠量″同義。
任意特定用途的有效量根據(jù)諸多因素如所治療的疾病或不適，特定組合物的給藥方式，受試者的尺寸，和/或疾病或不適的嚴(yán)重程度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)完全可以決定本發(fā)明特定組合物的有效量而不必進(jìn)行過(guò)度的試驗(yàn)。
Toll樣受體(TLR)配體這里所用的術(shù)語(yǔ)″Toll樣受體配體″或″TLR配體″指任何能激活至少一個(gè)TLRs的配體(參見(jiàn)如Beutler，B.2002，Curr.Opin.Hematol.，9，2-10，Schwarz et al.，2003，Eur.J.Immunol.，33，1465-1470)。本發(fā)明的TLR配體激活而不限制至少一種toll樣受體1(TLR1)，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，或TLR11。例如，肽聚糖(PGN)或脂磷壁酸(LTA)典型和優(yōu)選地激活TLR2(Aliprantis et al.，Science(1999)，285736-9；Underhill，等人，Nature，(1999)，401811-5)；雙鏈RNA，例如poly(I:C)，典型和優(yōu)選地激活TLR3(Alexopoμlou等人，Nature(2001)，413732-8)；脂多糖(LPS)典型和優(yōu)選激活TLR4(Poltorak，el at.，Science(1998)，2822085-8)；鞭毛蛋白典型和優(yōu)選地激活TLR5(Hayashi等人Nature(2001)，4101099-103)；單鏈RNA，如細(xì)菌RNA，和某些合成物質(zhì)如咪唑喹啉，典型和優(yōu)選地激活TLR7和TLR8(Diebold S.等人Science 3031529；Heil，F(xiàn)H.et al.Science 3031526)；細(xì)菌DNA，特別是含CpG基序的DNA典型和優(yōu)選地激活TLR9(Schnare等人Curr.Biol.(2000)，101139-42；Hemmi H et al.Nature(2000)，408740-5)。這些被引用的論文這里引入作為參考。TLR配體的概述見(jiàn)Abreu′s綜述論文表，這里也引用作為參考(Abreu M.T.and Arditi M.J.，Pediatrics(2004)，421-9)，對(duì)TLR 11及其配體的描述見(jiàn)Zhang等人，Science，(2004)，3031522-6。通過(guò)參考這些引用的論文，再結(jié)合本領(lǐng)域的公知常識(shí)，在常規(guī)操作范圍內(nèi)就可以檢測(cè)一個(gè)分子是否是本發(fā)明所說(shuō)的TLR配體，以及是否TLR配體激活至少一個(gè)TLR。典型和優(yōu)選的這類(lèi)檢測(cè)是按下述步驟3×106HEK293細(xì)胞在200伏和960uF條件下用1μg的TLR表達(dá)質(zhì)粒和20ng NF-KB的熒光素酶受體質(zhì)粒電穿孔。過(guò)量的質(zhì)粒DNA通過(guò)加入適當(dāng)空表達(dá)的載體，維持恒定在每次電穿孔15μg。以每孔105個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞，隔夜培養(yǎng)后用受試配體再刺激7到10個(gè)小時(shí)。已知TLR配體濃縮范圍的典型例子是與DOTAP復(fù)合的25μg/ml RNA40-42(促進(jìn)RNA在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化)，1μMCpG-ODN 2006，10μMR-848，50μg/ml poly(I:C)或1μg/mlPam3Cys(Heil，F(xiàn)H.等人Science 3031526)。受刺激的細(xì)胞使用受體細(xì)胞溶解緩沖液溶解(Promega，Mannheim，德國(guó))且根據(jù)廠商說(shuō)明，使用發(fā)光計(jì)分析溶胞產(chǎn)物的熒光素酶活性，典型和優(yōu)選Berthold發(fā)光計(jì)(Wildbad，德國(guó))。這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道對(duì)前述試驗(yàn)作相應(yīng)調(diào)整，以檢測(cè)任意配體。
根據(jù)本發(fā)明當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光素酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于從陰性對(duì)照組測(cè)得的閾值(同樣的試驗(yàn)、同樣的試驗(yàn)條件，只是不加入受試配體)時(shí)，認(rèn)為配體激活TLR。這里所指的閾值是陰性對(duì)照組的熒光素酶活性，陰性對(duì)照組以六個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果加六個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)熒光素酶活性的三次標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。典型和優(yōu)選地，當(dāng)配體熒光素酶活性高于如上述所測(cè)的閾值時(shí)，認(rèn)為配體″統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地″激活TLR。優(yōu)選地，當(dāng)配體熒光素酶活性高于如上述指示所測(cè)的閾值至少兩倍，優(yōu)選高于三倍，更優(yōu)選高于五倍時(shí)，認(rèn)為配體″統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地″激活TLR。
典型和優(yōu)選地，在本發(fā)明免疫刺激核酸激活TLR配體的情況下，本發(fā)明TLR配體(d)激活的TLR不同于免疫刺激核酸所激活的配體。例如，免疫刺激核酸是TLR9配體CpG，而本發(fā)明組合物的TLR配體(d)，則其次級(jí)TLR配體激活的次級(jí)TLR可以是任何TLR而不是TLR9，激活如TLR1，2，3，4，5，6，7，8，10，或11。另一方面，如果免疫刺激核酸的例子是poly(I:C)，TLR3配體，本發(fā)明組合物的TLR配體(d)，和其次級(jí)TLR配體激活的次級(jí)TLR可以是任何TLR而不是TLR3，激活如TLR1，2，4，5，6，7，8，9，10，或11。
Toll樣受體4(TLR4)配體TLR4配體以TLR4依賴方式，向細(xì)胞內(nèi)發(fā)生信號(hào)。典型和優(yōu)選的例子是LPS和其衍生物，gp96，熱激蛋白和防衛(wèi)素。優(yōu)選TLR4配體是LPS和其衍生物如缺少脂質(zhì)A尾側(cè)鏈的脫毒版的LPS(Persing等人，(2002)，Trends Microbiol.，10(10Suppl)，32-37)，如MPL，單磷酰脂A和其衍生物(Johnson等人，(1999)，J MedChem.，42(22)，4640-4649)或LPS經(jīng)化學(xué)改變的和合成的類(lèi)似物(Fernandes et al，(1997)，34(8-9)569-576；Przetak等，(2003)，21，961-970)。所有引用的參考文件這里全文引用。本發(fā)明優(yōu)選的LPS衍生物，如脫毒版LPS，LPS經(jīng)化學(xué)改變的和合成的類(lèi)似物按本領(lǐng)域人員公知的方法在兔體內(nèi)進(jìn)行熱源性測(cè)試。典型和優(yōu)選地，優(yōu)選的LPS衍生物在兔體內(nèi)沒(méi)有或沒(méi)有顯著的熱源性測(cè)試。
自體抗原這里所用的術(shù)語(yǔ)″自體抗原″指宿主基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)和按宿主基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA的產(chǎn)物，定義為自體。優(yōu)選地，這里所用的術(shù)語(yǔ)″自體抗原″指按人基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)或人基因組或DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA的產(chǎn)物，被定義為自體。本發(fā)明組合物，藥物組合物，和含自體抗原的疫苗，當(dāng)用于宿主時(shí)，特別地能夠打破對(duì)自體抗原的耐受性。在本文中，″打破對(duì)自體抗原的耐受性″指，特別是在將本發(fā)明的含自體抗原組合物、藥物組合物、和的疫苗用于宿主時(shí)，針對(duì)自體抗原的免疫應(yīng)答優(yōu)選B或T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。此外，兩個(gè)或多個(gè)自身分子組合物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或遞呈自身分子的一部分蛋白質(zhì)，與如上所述兩個(gè)自身分子具有高度同源性的蛋白質(zhì)(＞95％，優(yōu)選＞97％，更優(yōu)選＞99％)也被認(rèn)為自體。在本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原為自體抗原。本發(fā)明可用的自體抗原更優(yōu)選的實(shí)施方式在WO 02/056905有詳細(xì)描述，其中所公開(kāi)的內(nèi)容這里全文引用作為參考。
治療這里所用的術(shù)語(yǔ)″治療″指預(yù)防和/或治療。當(dāng)用于傳染病時(shí)，例如，該術(shù)語(yǔ)指預(yù)防性治療，能提高受試者對(duì)病原體傳染的抵抗力，換句話，降低了受試者被病原體感染或表現(xiàn)出傳染病病癥的可能性，以及在受試者感染疾病后與感染斗爭(zhēng)進(jìn)行治療，如減少或除去感染或阻止病情惡化。
疫苗這里所用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”指包含本發(fā)明組合物的制劑，具有可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行給藥的形式。典型地，疫苗包括常規(guī)的鹽水或緩沖水溶液介質(zhì)，本發(fā)明的組合物混懸或溶解于其中。以這種形式，本發(fā)明的組合物能方便地用于預(yù)防、改善、或治療疾病。在導(dǎo)入宿主后，疫苗能夠引起免疫應(yīng)答，其中包括但不限于抗體和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的激活和/或其它細(xì)胞應(yīng)答。
任選地，本發(fā)明的疫苗還包含佐劑，相對(duì)于本發(fā)明的化合物，它可能占一小部分或大部分。這里所用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產(chǎn)生貯存的物質(zhì)，當(dāng)本發(fā)明的疫苗與該物質(zhì)組合能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。有多種佐劑可以使用，例子包括弗式不完全佐劑、氫氧化鋁、和修飾的胞壁酰二肽。
病毒樣顆粒這里所用的術(shù)語(yǔ)“病毒樣顆粒″(VLP)指裝配有病毒的結(jié)構(gòu)，但并未證明有致病性。
典型地，本發(fā)明的病毒樣顆粒不攜帶編碼病毒樣顆粒蛋白的遺傳信息。一般而言，病毒樣顆粒缺少病毒基因組，因此是非感染性的。病毒樣顆粒通常也能通過(guò)異源表達(dá)大量生產(chǎn)，且易于純化。某些病毒樣顆粒可能含有不同于其基因組的核酸。典型地，本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和非傳染性的，因?yàn)樗狈θ炕虿糠只蚪M，特別是病毒基因組的復(fù)制性和感染性部分。本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎胁煌谄浠蚪M的核酸。本發(fā)明病毒樣顆粒的一個(gè)典型的優(yōu)選實(shí)施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體或RNA噬菌體的病毒衣殼。術(shù)語(yǔ)″病毒衣殼″或″衣殼″，在此可以互換使用，指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體。典型而且優(yōu)選地，病毒蛋白質(zhì)亞單位分別裝配為病毒衣殼和衣殼，具有固有的重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)，其中這種結(jié)構(gòu)一般是球形或管狀。例如，RNA噬菌體或HbcAg的衣殼是二十面體對(duì)稱(chēng)的球形。這里所用的術(shù)語(yǔ)“衣殼樣結(jié)構(gòu)”指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體，它類(lèi)似于上述衣殼形態(tài)，但是與典型的對(duì)稱(chēng)裝配體不同，而保持足夠程度的順序和重復(fù)性。
RNA噬菌體外殼蛋白的VLP衣殼結(jié)構(gòu)由RNA噬菌體外殼蛋白的180個(gè)亞單位自裝配而成。任選地含有宿主RNA的衣殼結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP″。一個(gè)具體例子是Qβ外殼蛋白VLP。在此具體情況下，Qβ外殼蛋白的VLP可能僅僅由Qβ CP亞單位(SEQ ID NO1)裝配而成，該亞單位通過(guò)表達(dá)含有如TAA終止密碼子的Qβ CP基因產(chǎn)生，所述中止密碼子通過(guò)抑制來(lái)阻止更長(zhǎng)A1蛋白的任何表達(dá)，參見(jiàn)Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣殼裝配體中還含有A1蛋白亞單位(SEQ ID NO2)。通讀過(guò)程的效率低，在VLP中只有極少量的A1蛋白。已經(jīng)對(duì)包裝的ISS與偶合的抗原的不同組合已有大量的實(shí)施例。當(dāng)使用僅由Qβ CP亞單位裝配的Qβ外殼蛋白的VLP或在衣殼中還含有A1蛋白亞單位的Qβ外殼蛋白VLP時(shí)，偶合效率和包裝未見(jiàn)差異。此外，沒(méi)有觀察到這些Qβ VLP樣本的免疫應(yīng)答之間有差別。因此，為了更清楚，說(shuō)明書(shū)實(shí)施例所用的術(shù)語(yǔ)″Qβ VLP″不僅代表只從Qβ CP亞基裝配而來(lái)的Qβ外殼蛋白的VLP，還代表在衣殼中含另外A1蛋白亞單位的Qβ外殼蛋白的VLP。
這里所用的術(shù)語(yǔ)″病毒顆?！逯覆《镜男螒B(tài)學(xué)的形狀。在一些病毒類(lèi)型中病毒包括被蛋白衣殼包裹的染色體；其它的則具有另外的結(jié)構(gòu)(例如，膜，尾等)。
無(wú)膜病毒顆粒由包圍和保護(hù)病毒染色體的蛋白質(zhì)衣殼組成。有膜病毒也具有包裹病毒染色體的衣殼結(jié)構(gòu)，但此外還有脂質(zhì)雙分子層包裹在衣殼上。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，VLP沒(méi)有脂蛋白膜或含脂蛋白的膜。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，VLP完全沒(méi)有膜。
一個(gè)當(dāng)術(shù)語(yǔ)″一個(gè)″在公開(kāi)的內(nèi)容中使用時(shí)，表示″至少一個(gè)″或″一個(gè)或更多，″除非有其它指示。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該清楚，本發(fā)明某些實(shí)施方式涉及重組核酸技術(shù)的應(yīng)用，如克隆、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA和RNA純化、重組蛋白在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的表達(dá)等。這類(lèi)方法學(xué)的東西是本領(lǐng)域人員公知的，在出版的方法手冊(cè)中很容易找到(例如，Sambrook，J.等人，eds.，MOLECMLAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd.edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人，eds.，CURRENT PROTOCOLS INMOLECMLAR BIOLOGY，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)).組織培養(yǎng)細(xì)胞系工作所需的實(shí)驗(yàn)室基本技術(shù)(Celis，J.，ed.，CELL BIOLOGY，Academic Press，2″d edition，(1998))和抗體基礎(chǔ)知識(shí)(Harlow，E.andLane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guideto Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，″Protein Purification Principles and Practice，″3rded.，SpringerVerlag，New York(1994))在這些著作中也得到了足夠的描述，此處全部引用作為參考。
2.增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組合物和方法本發(fā)明公開(kāi)提供增強(qiáng)動(dòng)物針對(duì)一種或多種抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包括，或可選擇地由下述組成(a)病毒樣顆粒，(b)免疫刺激核酸，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中核酸或低聚核苷酸與病毒樣顆粒偶合、融合或以其它方式連接或附著如結(jié)合、優(yōu)選包裝，(c)至少一種與VLP偶合或結(jié)合的抗原或與VLP混合的抗原，和(d)至少一種TLR配體。優(yōu)選地，TLR配體(d)與本發(fā)明的VLP(a)混合。此外，本發(fā)明很容易使執(zhí)業(yè)醫(yī)師構(gòu)建這樣一個(gè)組合物，以達(dá)到各種不同的治療/預(yù)防目的，其中包括預(yù)防和/或治療傳染病，和慢性傳染病，預(yù)防和/或治療癌癥，和預(yù)防和/或治療變態(tài)反應(yīng)或與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病，例如哮喘。
在本申請(qǐng)中所出現(xiàn)的病毒樣顆粒指VLP，在WO 03/024481第39頁(yè)至第59頁(yè)有詳細(xì)描述，其中公開(kāi)的內(nèi)容此處引用作為參考。VLP的例子包括但不限于，乙肝病毒，RNA噬菌體，Ty，fr-噬菌體，GA-噬菌體，AP 205-噬菌體和，特別是，Qβ-噬菌體的殼蛋白。在更具體的實(shí)施方式中，VLP包括或可選擇地由重組多肽或其片斷片斷組成或基本由其組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包括，基本上由，或可選擇地由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片斷組成。優(yōu)選地，RNA-噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；1)噬菌體PP7；和m)噬菌體AP205。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方實(shí)中，重組蛋白包括，基本上由，或可選擇地由RNA噬菌體外殼蛋白組成。
用于制備本發(fā)明組合物的特別優(yōu)選的噬菌體外殼蛋白的例子在WO 03/024481(第41頁(yè)最后第49頁(yè)第二段)有詳細(xì)描述，其中公開(kāi)的內(nèi)容此處引用作為參考，其中包括RNA噬菌體外殼蛋白，例如噬菌體Qβ(PIR Database，Accession No.VCBPQ指Qβ CP and AccessionNo.AAA16663指Qβ A1 protein)，噬菌體R17(PIR Accession No.VCBPR7)，噬菌體fr(PIR Accession No.VCBPFR)，噬菌體GA(GenBank Accession No.NP-040754)，噬菌體SP(GenBank AccessionNo.CAA30374指SP CP and Accession No.NP 695026指SP A1protein)，噬菌體MS2(PIR Accession No.VCBPM2)，噬菌體M11(GenBank Accession No.AAC06250)，噬菌體MX1(GenBankAccession No.AAC 14699)，噬菌體NL95(GenBank Accession No.AAC 14704)，噬菌體f2(GenBank Accession No.P03611)，噬菌體PP7(SEQ ID NO3)，噬菌體AP205(SEQ ID NO32 or 33).
有四個(gè)賴氨酸殘基暴露于Qβ外殼蛋白衣殼表面。本發(fā)明也可用精氨酸替換暴露賴氨酸殘基的Qβ突變體。本發(fā)明在實(shí)施中可用下列Qβ外殼蛋白突變體和突變的Qβ VLP″Qβ-240″(Lys13-Arg；SEQID NO4)，″Qβ-243″(Asn 10-Lys；SEQ ID NO5)，″Qβ-250″(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO6)，″Qβ-251″(SEQ ID NO7)and″Qβ-259″(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO8)。因此，在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含、基本上由或可選擇地由突變QB外殼蛋白重組蛋白組成。其包含具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)a)氨基酸序列SEQ ID NO4；b)氨基酸序列SEQ ID NO5；c)氨基酸序列SEQ ID NO6；d)氨基酸序列SEQ ID NO7；和e)氨基酸序列SEQ ID NO8。上述Qβ外殼蛋白、突變Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構(gòu)造、表達(dá)和純化分別在WO 02/056905中描述。
本發(fā)明還包括包含蛋白的組合物，蛋白包括，或可選擇地基本由與上述序列有至少80％，85％，90％，95％，97％，或99％相同的氨基酸序列組成。VLP片斷仍保留誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，其中包括，或可選擇由多肽組成，所述多肽長(zhǎng)度約15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，300，350，400，450或500個(gè)氨基酸，但顯然這取決于含有VLP的亞單位序列的長(zhǎng)度。這類(lèi)片斷的例子包括這里所討論的蛋白質(zhì)片斷，適合于制備免疫應(yīng)答增強(qiáng)組合物。
如前所述，本發(fā)明包括病毒樣顆?；蚱渲亟M形式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何制備這類(lèi)顆粒和混合抗原。以提供其它實(shí)施例的方式，本發(fā)明在這里提供乙肝病毒樣顆粒的制備作為制備病毒樣顆粒的范例(實(shí)施例1)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物所使用的顆粒由乙肝病毒衣殼(核)蛋白(HBcAg)或HbcAg片斷構(gòu)成，或經(jīng)修飾除去或減少了游離半胱氨酸殘基數(shù)量的HbcAg構(gòu)成。特別優(yōu)選的HbcAg蛋白的例子有，例如HBcAg SEQ ID NO9或其變體能用于制備本發(fā)明的組合物，這在WO 03/024481(第52頁(yè)第4段到第58頁(yè)最后一段)中有詳細(xì)描述，其中所公開(kāi)的內(nèi)容這里引用作為參考。本發(fā)明使用的乙肝病毒樣顆粒的制備方法在WO 00/32227中已經(jīng)公開(kāi)，特別在實(shí)施例17至19和21至24中，在WO 01/85208也公開(kāi)過(guò)，特別在實(shí)施例17至19，21至24，31至41中，而且在WO 02/056905也有公開(kāi)。在后一申請(qǐng)中，特別是實(shí)施例23，24，31和51。這三篇文獻(xiàn)這里都詳細(xì)地引用作為參考。
大量的適合在本發(fā)明實(shí)施中使用的天然發(fā)生的HBcAg變體已經(jīng)確認(rèn)大量的適合在本發(fā)明實(shí)施中使用的天然發(fā)生的HBcAg變體(例如Yuan等人，(RVirol.7310122-10128(1999))。還有的適合在本發(fā)明實(shí)施中使用的HBcAg變體在WO 03/024481(第54頁(yè)第三段至第55頁(yè)第一段)公開(kāi)了，其中公開(kāi)的內(nèi)容這里引用作為參考。
本發(fā)明適用的HbcAgs衍生自任何生物體，只要它們能封裝或偶合或以其它方式附著到含非甲基化CpG的低聚核苷酸，并能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，將賴氨酸殘基導(dǎo)入HbcAg多肽，介導(dǎo)抗原或抗原決定簇與HbcAg結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物優(yōu)選使用的HbcAg包括，或可選擇地由SEQ ID NO10的氨基酸1-144，或1-149，或1-185組成，進(jìn)行修飾使對(duì)應(yīng)于79位和80位的氨基酸被氨基酸序列為Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO34)的肽置換，使得HbcAg變異體氨基酸序列為SEQ ID NO96.在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，SEQ ID NO10在48位和107位的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸(SEQ ID NO36)。本發(fā)明還包括包括對(duì)應(yīng)的多肽組合物，其中多肽具有WO 03/024481(第54頁(yè)第三段至第55頁(yè)第一段)所示的氨基酸序列，也有上述的氨基酸更替。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是另外的與形成衣殼或VLP有關(guān)的氨基酸，具有上述氨基酸更替。因而，本發(fā)明還包括含HbcAg多肽的組合物，多肽中包括或可選擇地由氨基酸序列組成，氨基酸序列與任何野生型氨基酸序列至少有80％，85％，90％，95％，97％或99％的同一性，如果適當(dāng)，蛋白質(zhì)的形態(tài)經(jīng)過(guò)加工，可以除去N-末端前導(dǎo)序列并通過(guò)上述改造進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的一個(gè)方面，病毒樣顆粒，結(jié)合了含非甲基化CpG的低聚核苷酸，與期望增強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原/免疫原偶合或混合。在一些例子中，單一抗原與這類(lèi)修飾后的病毒樣顆粒偶合或混合。在其它例子中，這類(lèi)修飾后VLP與幾種抗原或甚至與復(fù)合抗原混合物偶合或混合?？乖捎芍亟M制備或從天然來(lái)源中提取，天然來(lái)源包括但不限于花粉、粉塵、真菌、昆蟲(chóng)、食物、哺乳動(dòng)物表皮、羽毛、蜜蜂、腫瘤、病原體和羽毛。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，加入組合物的物質(zhì)包括含至少一個(gè)免疫刺激核酸，優(yōu)選至少一個(gè)含非甲基化CpG的低聚核苷酸的VLP，以及與VLP偶合/融合或混合的抗原，以及至少一個(gè)TLR配體，它能夠引發(fā)激活TLR，典型和優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫刺激核酸不能激活的第二個(gè)TLR。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的組合物，包括(a)病毒樣顆粒(VLP)，(b)免疫刺激核酸，優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中核苷酸或低聚核苷酸與病毒樣顆粒偶合、融合，或者附著或封裝入病毒樣顆粒，優(yōu)選以病毒樣顆粒包裝，(c)至少一種VLP偶合或融合的抗原或與VLP混合的抗原，和(d)至少一種TLR配體。優(yōu)選地，TLR配體(d)與本發(fā)明的VLP(a)混合。優(yōu)選地，免疫刺激核酸(b)激活的TLR與配體(d)激活的TLR不同。
TLRs被描述為模式識(shí)別分子，是免疫系統(tǒng)進(jìn)行自身/非自身辨識(shí)的關(guān)鍵。目前已知十個(gè)人toll樣受體。它們由各種配體激活。TLR2被肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸，和酵母多糖激活，且被巨噬菌體激活脂肽MALP-2激活；TLR3被雙鏈RNA如poly(I:C)激活；TLR4被脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇和熱激蛋白如熱激蛋白HSP-60，Gp96和防衛(wèi)素激活；TLR5被細(xì)菌鞭毛，尤其是鞭毛蛋白激活；TLR6被肽聚糖激活；TLR7被imiquimoid和咪唑喹啉化合物激活，如R-848，loxoribine和bropirimine，TLR9被細(xì)菌DNA，特別是CpG-低聚核苷酸激活。TLR1，TLR8，TLR10，和TLR11的配體目前還不清楚。然而，進(jìn)來(lái)的研究表明相同的受體可以與不同的配體反應(yīng)，且更多的受體是已有受體。上述配體列表并非窮舉，且更多的配體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。一般而言，是通過(guò)觸發(fā)TLRs激活抗原呈遞細(xì)胞(APC)。因而，觸發(fā)TLRs可激活A(yù)PCs從而增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明中，令人吃驚的發(fā)現(xiàn)不同TLRs刺激可以產(chǎn)生協(xié)同反應(yīng)。具體地，TLR9經(jīng)包裝在VLP中的CpG刺激能與TLR4經(jīng)LPS或其它TLR4配體刺激起協(xié)同增效作用。因而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)于CpG刺激的TLR9，額外TLR刺激可以是TLR4。已知各種不同的TLR4配體。包括LPS，天然的TLR4配體。此外，脫毒版的LPS，缺少如脂質(zhì)A尾側(cè)鏈的，也是TLR4潛在的激活劑。單磷酰脂A和其衍生物是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選的衍生物是3去-氧-酰單磷酰脂A，，在British Patent No.2220211中公開(kāi)。不管其刺激TLR4的能力如何，這些非天然配體相對(duì)無(wú)毒，因此優(yōu)選用作疫苗中刺激TLR4的物質(zhì)(CurrDrμg Targets Infect Disord.2001 Nov；1(3)273-86.)。近來(lái)，TLR配體家族已經(jīng)擴(kuò)大到包括熱激蛋白(J Biol Chem.2002 Apr 26；277(17)15107-12.)和防衛(wèi)素(Science.2002 Nov 1；298(5595)1025-9.)。因此，防衛(wèi)素和熱激蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物所用的免疫刺激核酸選自(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸，(c)嵌合核酸；和(d)(a)，(b)和/或(c)中至少一種的任意混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激核酸是poly-(I:C)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫刺激核酸選自(a)含非甲基化CpG的低聚核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的低聚核苷酸，本發(fā)明的免疫刺激核酸優(yōu)選含非甲基化CpG的低聚核苷酸。
兩類(lèi)核酸，換句話說(shuō)，1)含免疫刺激序列特別是含于特定側(cè)翼堿基之內(nèi)(指CpG基序)的非甲基化CpG二核苷酸的細(xì)菌DNA，和2)由各種類(lèi)型的病毒合成的雙鏈RNA，代表了增強(qiáng)免疫應(yīng)答的微生物組分的重要成員。合成的雙鏈(ds)RNA如聚肌苷-聚胞苷酸(poly I:C)能誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生趨炎癥細(xì)胞因子(proinflammatory)并表達(dá)高水平的聯(lián)合刺激分子。
Tokunaga和Yamamoto等人所進(jìn)行的一系列的研究顯示細(xì)菌DNA或合成低聚脫氧核苷酸誘導(dǎo)人PBMC和小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素(IFN)(綜述在Yamamoto等人，Springer Semin Immunopathol.2211-19)。poly(I:C)最初合成作為潛在的I型IFN誘導(dǎo)劑，但也誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子如IL-12。
優(yōu)選的核糖核酸包括聚肌苷-聚胞苷酸雙鏈RNA(poly I:C)。核糖核酸和其修飾物以及它們的制備方法已經(jīng)被Levy，H.B(MethodsEnzymol.1981，78242-251)，DeClercq，E(Methods Enzymol.1981，78227-236)和Torrence，P.F.(Methods Enzymol1981；78326-331)和其中的參考文獻(xiàn)公開(kāi)。更優(yōu)選的核糖核酸包括肌苷酸和胞苷酸，如其中兩條鏈形式的雙鏈RNApoly(IC)，的多核苷酸。核糖核酸分離自生物體。核糖核酸也包括合成的核糖核酸，特別是合成的poly(I:C)低聚核苷酸，通過(guò)磷酸二酯主鏈的修飾，特別是硫代磷酸修飾，引起了核酸酶抵抗性。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，poly(I:C)的核糖主鏈被脫氧核糖取代。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何合成人造低聚核苷酸的方法。
一般來(lái)說(shuō)，含非甲基化CpG的低聚核苷酸包括序列5′X1X2CGX3X43′其中X1，X2，X3和X4是任意核苷酸。此外，低聚核苷酸包括約6個(gè)至約100,000個(gè)核苷酸，優(yōu)選約6個(gè)至約2000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選約20至約2000個(gè)核苷酸，而且甚至更優(yōu)選地包括約20至約300個(gè)核苷酸。此外，低聚核苷酸包括超過(guò)100至約2000個(gè)核苷酸，優(yōu)選超過(guò)100至約1000個(gè)核苷酸，而且更優(yōu)選超過(guò)100至約500個(gè)核苷酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，含CpG的低聚核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)磷酸主鏈的硫代磷酸修飾物。例如有一個(gè)或多個(gè)磷酸主鏈修飾或所有的磷酸主鏈經(jīng)修飾的含CpG的低聚核苷酸，和其中一個(gè)、一些或全部核酸磷酸主鏈修飾是硫代磷酸修飾，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
含CpG的低聚核苷酸可以是重組的、基因組的、合成的、cDNA的、質(zhì)粒衍生的、單鏈的或雙鏈的。為了在本發(fā)明中立即使用，核酸可以重新使用本領(lǐng)域公知的任意步驟的工藝來(lái)合成。例如b-氰乙基磷酰胺化方法(Beaucage，S.L.，和Caruthers，M.H.，Tet.Let.221859(1981)；核苷H-磷酸鹽方法(Garegg等人，Tet.Let.274051-4054(1986)；Froehler等人，Nucl.Acid.Res.145399-5407(1986)；Garegg等人，Tet.Let.274055-4058(1986)，Gaffney等人，Tet.Let.292619-2622(1988)).。這些化學(xué)方法可通過(guò)各種不同的市售自動(dòng)低聚核苷酸合成器來(lái)完成。可選擇地，CpG可以質(zhì)粒中大量生產(chǎn)，(參見(jiàn)Sambrook，T.，等人，″Molecμlar CloningA Laboratory Manual，″ColdSpring Harbor laboratory Press，New York，1989)給予受試者降解為低聚核苷酸。低聚核苷酸通過(guò)使用公知技術(shù)從現(xiàn)有核酸序列中制得(例如，基因組的或cDNA)，如使用限制酶，外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。
免疫刺激核酸以及含非甲基化CpG的低聚核苷酸可以通過(guò)任何本領(lǐng)域公知的方法與VLP結(jié)合，提供給予受試者后增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的組合物。例如低聚核苷酸共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合。此外，VLP可以封裝全部地或部分地，免疫刺激核酸以及含非甲基化CpG的低聚核苷酸。優(yōu)選地，免疫刺激核酸以及含非甲基化CpG的低聚核苷酸與一個(gè)VLP結(jié)合的位點(diǎn)如低聚核苷酸結(jié)合點(diǎn)(天然或是非天然發(fā)生的)，DNA結(jié)合點(diǎn)或RNA結(jié)合點(diǎn)結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，VLP位點(diǎn)包括富含精氨酸重復(fù)序列或富含賴氨酸重復(fù)序列。將本發(fā)明的免疫刺激核酸包裝入本發(fā)明VLP的方法，例如裝入HBcAg，RNA-噬菌體Qβ或AP205，是本領(lǐng)域人員公知的，在WO 03/024481已公開(kāi)(特別是在實(shí)施例11到17)，其中所公開(kāi)的內(nèi)容這里引用作為參考。
本發(fā)明組合物一個(gè)特殊的用途是激活樹(shù)突細(xì)胞，以增強(qiáng)針對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答。樹(shù)突細(xì)胞使用來(lái)自體內(nèi)或體內(nèi)技術(shù)增強(qiáng)。來(lái)自體內(nèi)工藝可使用自體同源的或異種細(xì)胞，但是優(yōu)選使用自體同源的細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，樹(shù)突細(xì)胞分離自外周血或骨髓，但也能分離自任何樹(shù)突細(xì)胞來(lái)源。為了癌癥免疫療法進(jìn)行的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)自體內(nèi)操作已經(jīng)在多篇本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中公開(kāi)，包括Engleman，E.G.，Cytotechnology251(1997)；Van Schooten，W.，等人，MolecμlarMedicine Today，June，255(1997)；Steinman，R.M.，ExperimentalHematology24849(1996)；和Gluckman，J.C.，Cytokines，Cellμlar和Molecμlar Therapy 3187(1997)。樹(shù)突細(xì)胞可通過(guò)體內(nèi)方法與本發(fā)明的組合物接觸。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，CpG與和抗原偶合或混合的VLP聯(lián)合給藥，另外的TLR配體直接加入給予需要免疫療法的受試者。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選VLP/CpG被施用于腫瘤局部域，可以用本領(lǐng)域已知的任何方法完成，例如直接注射入腫瘤內(nèi)。
在本發(fā)明一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，含非甲基化CpG的聚核苷酸包括，或可選擇地基本上由，或可選擇地由，序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO54)組成。后者之前被發(fā)現(xiàn)在體外能刺激血細(xì)胞(Kuramoto E.等人，JapaneseJournal Cancer Research 83，1128-1131(1992).
在另一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中所述非甲基化CpG低聚核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。優(yōu)選的所述回文序列是GACGATCGTC(SEQID NO39)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，回文序列在其3′末端和5′末端側(cè)翼連接至少10個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，其中所述回文序列優(yōu)選GACGATCGTC(SEQ ID NO39)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，回文序列在其N(xiāo)末端側(cè)翼連接至少3個(gè)和至多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，且其中所述回文序列在其C末端側(cè)翼連接至少6個(gè)和至多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。出人意料地發(fā)現(xiàn)這些本發(fā)明的免疫刺激核酸能高效地裝入VLP。相對(duì)于相應(yīng)的其序列GACGATCGTC(SEQ ID NO39)在5′和3′末端側(cè)翼連接10個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體的免疫刺激核酸，其包裝能力得到了增強(qiáng)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，回文序列包括，或可選擇地基本上由，或可選擇地由或就是GACGATCGTC(SEQ ID NO39)，其中所述回文序列在其5′末端側(cè)翼連接有至少3個(gè)和至多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，其中所述回文序列在其3′末端側(cè)翼連接有至少6個(gè)和至多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中所述非甲基化CpG的低聚核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述非甲基化CpG的低聚核苷酸的核酸序列選自(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO40)；和典型地簡(jiǎn)化為G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO41)；典型地簡(jiǎn)化為G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQID NO42)；典型地簡(jiǎn)化為G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO43)；典型地簡(jiǎn)化為G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO44)；典型地簡(jiǎn)化為G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO45)；典型地簡(jiǎn)化為G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO46)；典型地簡(jiǎn)化為G9-9)，和(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO47)；典型地簡(jiǎn)化為G6).
在本發(fā)明更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫刺激核酸含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中所屬含非甲基化CpG的低聚核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列為GACGATCGTC(SEQ IDNO39)，且所述回文序列在其5′末端側(cè)翼連接至少4個(gè)，最多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，其中述回文序列在其3′-末端側(cè)翼連接至少6個(gè)，最多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列為GACGATCGTC(SEQ IDNO39)，且所述回文序列在其5′末端側(cè)翼連接至少5個(gè)，最多8個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，且所述回文序列在其3′末端側(cè)翼連接至少6個(gè)，最多8個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明優(yōu)選的本發(fā)明免疫刺激核酸易于包裝，也就是說(shuō)，側(cè)翼連接回文序列鳥(niǎo)嘌呤核苷，回文的和含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中回文序列為GACGATCGTC(SEQ ID NO39)，且其中回文序列在其3′和5′末端側(cè)翼連接少于少10個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，如果回文序列側(cè)翼連接較少的鳥(niǎo)嘌呤核苷體，則更容易進(jìn)入VLP側(cè)翼連接于回文序列的鳥(niǎo)嘌呤核苷體數(shù)目降低導(dǎo)致在體外對(duì)血細(xì)胞的刺激下降。因而，包裝能力的代價(jià)是降低本發(fā)明所指免疫刺激核酸的活性。優(yōu)選的實(shí)施方式表現(xiàn)為包裝能力和生物活性的折中。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫刺激核酸為含非甲基化CpG的低聚核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸CpG基序是回文序列的一部分，其中所屬非甲基化具有核酸序列SEQ ID NO45，也就是說(shuō)免疫刺激核酸是G8-8。
在本發(fā)明特定的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物包括(a)VLP，(b)至少一種免疫刺激核酸，(c)至少一種抗原，和(d)至少一種TLR配體，其中所述免疫刺激核酸(b)是含非甲基化CpG的低聚核苷酸，且其中所述配體(d)是TLR 1，2，3，4，5，6，7，8，10或11的配體，其中所述TLR配體激活至少一種選自TLR 1，2，3，4，5，6，7，8，10和11。
在本發(fā)明更優(yōu)選的一個(gè)特定實(shí)施方式中，組合物包括(a)VLP，(b)至少一種免疫刺激核酸，(c)至少一種抗原，和(d)至少一種TLR配體，其中所述免疫刺激核酸(b)是poly(I:C)，且其中所述配體(d)是TLR1，2，4，5，6，7，8，10或11的配體，其中所述TLR配體激活至少一種選自TLR 1，2，4，5，6，7，8，10和11。
本發(fā)明組合物還包括與修飾的病毒樣顆粒混合或偶合的抗原或抗原決定簇。本發(fā)明提供的組合物根據(jù)考慮預(yù)期治療效應(yīng)而選擇的抗原和抗原決定簇來(lái)變化。本發(fā)明適用的抗原或抗原決定簇在WO00/32227、WO01/85208和在WO 02/056905中已經(jīng)公開(kāi)，所公開(kāi)的內(nèi)容這里全文引用以作參考。
抗原可以是任何已知和未知來(lái)源的抗原?？梢苑蛛x自細(xì)菌；病毒或其它病原體；腫瘤；或樹(shù)、草、野草、植物、真菌、食物、或動(dòng)物，在敏感患者中可引起變態(tài)反應(yīng)?？蛇x擇地，抗原也可以是重組抗原，得自適當(dāng)核酸編碼的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原是重組抗原。當(dāng)然，抗原的選擇依賴于預(yù)期的免疫應(yīng)答和宿主。
本發(fā)明可適用于多種抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原為蛋白質(zhì)、多肽或肽。
本發(fā)明的抗原選自(a)適合誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的多肽；(b)適合誘導(dǎo)針對(duì)傳染病的免疫應(yīng)答的多肽；(c)適合誘導(dǎo)針對(duì)變態(tài)反應(yīng)原的免疫應(yīng)答的多肽；(d)適合在飼養(yǎng)動(dòng)物或昆蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的多肽；(e)多肽上天然出現(xiàn)的碳水化合物，和(f)(a)-(e)中任意多肽的片斷(例如，域)。
優(yōu)選的抗原包括來(lái)自病原體(例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌)，腫瘤(尤其是與腫瘤相關(guān)的抗原或“腫瘤標(biāo)記”)和變態(tài)反應(yīng)原。
其它優(yōu)選的抗原分別是自身抗原和自體抗原。
在一些例子中，使用含肽p33的VLP。應(yīng)該注意的是含肽p33的VLP僅僅是為了方便而使用，野生型VLP也同樣可用于本發(fā)明。肽p33衍生自淋巴脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)。p33肽代表一種深入研究的CTL表位。p33-特異性T細(xì)胞已經(jīng)顯示誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生致死糖尿病(Speiser等人，J.Exp.Med.186645(1997))。因此，這種特異性表位，特別適合于研究自身免疫、腫瘤免疫和病毒性疾病。
在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式
中，抗原或抗原決定簇可用于傳染病的預(yù)防。這類(lèi)治療對(duì)多種對(duì)宿主影響廣泛的傳染病很有效，宿主例如人、奶牛、綿羊、豬、狗、貓、其他哺乳動(dòng)物種類(lèi)和非哺乳動(dòng)物種類(lèi)。本領(lǐng)域已知的傳染病的例子中包括病毒病源性的傳染病，例如HIV，流感，皰疹，病毒性肝炎，EB病毒，脊髓灰質(zhì)炎，病毒性腦炎，麻疹，雞瘟，乳頭狀瘤病毒等；細(xì)菌病原性傳染病如肺炎，肺結(jié)核，梅毒等；或寄生蟲(chóng)病源性傳染病，如瘧疾、錐蟲(chóng)病、利什曼病、滴蟲(chóng)病、阿米巴病等。因而本發(fā)明組合物所選的抗原或抗原決定簇是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知的，抗原或抗原決定簇的例子包括下述HIV抗原gpl40和gpl60；流行性感冒抗原血細(xì)胞凝集素，M2蛋白和神經(jīng)氨酸酶，乙肝病毒表面或核心抗原或瘧疾環(huán)子孢子蛋白或其片斷。
如上所述，抗原包括天然來(lái)源或合成的傳染性微生物如病毒、細(xì)菌和真菌和其片斷。
傳染性微生物如病毒的例子有RNA病毒，或例如在脊椎動(dòng)物體內(nèi)作為抗原的DNA病毒，用于本發(fā)明組合物的病毒在WO 03/024481(特別是第86到89頁(yè))有詳細(xì)描述，其中公開(kāi)的內(nèi)容這里引用作為參考。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，抗原包括一種或多種細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，Th細(xì)胞表位，或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和Th細(xì)胞表位的組合。
增強(qiáng)人體內(nèi)抗原特異性免疫應(yīng)答之外，優(yōu)選實(shí)施方式的方法特別適用于治療其它哺乳動(dòng)物或動(dòng)物，例如鳥(niǎo)類(lèi)如母雞、小雞、火雞、鴨子、鵝、鵪鶉和野雞。鳥(niǎo)類(lèi)是各種傳染病的易感目標(biāo)。其它用于本發(fā)明組合物的抗原的例子在WO 03/024481(第90至93頁(yè))中公開(kāi)。
本發(fā)明另一方面提供了疫苗組合物，適用于預(yù)防和/或減輕因“自身”基因產(chǎn)物引起或加劇的疾病或病情的方法。(例如腫瘤壞死因子)。因而，本發(fā)明的疫苗組合物包括產(chǎn)生抗體的組合物，預(yù)防和/或減輕因“自身”基因產(chǎn)物引起或加劇的疾病或病情。這類(lèi)疾病或病情的例子包括移植物抗宿主疾病，IgE-介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，過(guò)敏反應(yīng)，成人呼吸窘迫綜合癥，Crohn′s病，過(guò)敏性哮喘，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，葛雷夫斯氏病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，自體免疫炎癥，重癥肌無(wú)力，免疫增生性淋巴結(jié)病(IPL)，血管免疫增生性淋巴結(jié)病(AIL)，免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(IBL)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，多發(fā)性硬化癥，阿爾茨海默氏癥和骨質(zhì)疏松癥。
在相關(guān)的特定實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物是一種免疫治療劑，能用于變應(yīng)性、癌癥或毒癮的治療和/或預(yù)防。
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療這類(lèi)疾病的人應(yīng)該知道如何選擇組合物制備和在治療變態(tài)反應(yīng)的方法中所用到的抗原或抗原決定簇。這類(lèi)抗原或抗原決定簇的例子分別為下述蜂毒磷脂酶A2；Amb a1(豕草花粉變態(tài)反應(yīng)原)，Bet vI(樺樹(shù)花粉變態(tài)反應(yīng)原)；5Dol mV(白面大黃蜂毒變態(tài)反應(yīng)原)；Der p1，Der f2和Der2(室內(nèi)塵螨變態(tài)反應(yīng)原)；Lep d2(塵螨變態(tài)反應(yīng)原)；Alt a1，Aspf1，和Aspf 16(真菌變態(tài)反應(yīng)原)；Ara h1，Arah2，和Ara h3(花生變態(tài)反應(yīng)原)及其各自的片斷，能引起免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明在使用分離自生物體或部分生物體的變態(tài)反應(yīng)原混合物，如花粉提取物或蜂毒時(shí)特別有效。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，花粉提取物包括或可選擇地由樹(shù)、草、雜草和公園植物組成?；ǚ厶崛∥锏睦影ǖ幌抻谙率鼋鸷蠚g、榿木(灰色)、杏仁、蘋(píng)果樹(shù)、杏樹(shù)、側(cè)柏、岑樹(shù)、白楊、月桂、山毛櫸、樺樹(shù)(春)，樺樹(shù)(白)，紅千層，羽葉槭，角豆樹(shù)、雪松，包括但不限于日本柳杉、櫻桃、栗樹(shù)、三葉楊、柏樹(shù)、接骨木、榆樹(shù)(美洲)、桉樹(shù)、冷杉、樸樹(shù)、榛子樹(shù)、鐵杉、山核桃樹(shù)、霍布葉鐵木、鐵木、刺柏、洋槐、槭樹(shù)、白千層、牡豆樹(shù)、山梅花、桑樹(shù)、橡樹(shù)(白橡)、橄欖樹(shù)、桔樹(shù)、桑橙樹(shù)、假紫荊、桃樹(shù)、梨樹(shù)、美洲山核桃樹(shù)、胡椒樹(shù)、松樹(shù)、李樹(shù)、楊樹(shù)、女貞、紅杉、沙棗、云杉、香楓、小無(wú)花果樹(shù)、美洲落葉松、臭椿、胡桃和柳樹(shù)。菁草花粉提取物的例子包括但不限于百喜草、大麥、山毛櫸、剪股穎、狗牙草、早熟禾(草地早熟禾)、雀麥草、從生草、草蘆、雀麥草(chess)、玉米、羊茅(牛尾草)、格蘭馬草、蔣森草、六月草、koeler’s、燕麥、鴨茅、偃麥草、小糠草、黑麥草(多年生草本)、鹽草、高粱、蘇丹草、甜歐洲香草、梯牧草、絨毛剪股穎、小麥和冰草。野草和園林植物的例子包括但不限于紫花苜蓿、莧屬植物、紫菀、鳳仙花根、霧冰藜、beach bur、金雀花、burrow bush、careless weed、蓖麻子、chamise、三葉草、蒼耳、金雞菊、大波斯菊、水仙花、雛菊、蒲公英、酸模、臭甘菊、柳蘭、唐菖蒲、一枝黃花、肉葉刺莖藜、大麻、忍冬、蛇麻草、iodonebush、總狀花藜、地膚、藜、百合、金盞花、marshelder、土荊芥、艾屬植物、芥菜、蕁麻、pickleweed、莧、車(chē)前草(英國(guó))、罌粟、povertyweed、大濱藜、豕草(三裂葉豕草)、豕草(短豕草)、豕草(西方豕草)、玫瑰、俄羅斯薊、三齒蒿、濱藜、鱗苞、蘇格蘭金雀花、seablight、酸模、金魚(yú)草、甜菜、向日葵、western waterhemp、winterfat、美洲土荊芥。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，花粉提取物包括，或可選擇地由黑麥組成。
豕草花粉的季節(jié)性出現(xiàn)在(9-10月)，在許多個(gè)體中誘導(dǎo)哮喘(Marshall，J.et al.，J.Allergy Clin.Immunol.108191-197(2001))。哮喘的特征在于肺部炎癥、可逆性氣流堵塞和呼吸道高反應(yīng)性。對(duì)空氣變應(yīng)原的復(fù)雜免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)導(dǎo)致呼吸道中白細(xì)胞的募集。具體而言，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管粘膜(Redman，T.等人，Exp.Lung Res.27433-451(2001))。嗜酸性粒細(xì)胞的募集與TH2細(xì)胞因子IL-4和IL-5的產(chǎn)生增加有關(guān)，這兩種細(xì)胞因子是引起慢性炎癥過(guò)程的哮喘發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因子(Justice，J.等人，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.282L302-L309(2002)，其中全部?jī)?nèi)容引入作為參考)。短豕草(Ambrosiaartemisiifolia)中的免疫顯性變應(yīng)原是Ambal(Santeliz，J.etal.，JAllergy Clin.Immunol.109455-462(2002))。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，組合物含有與病毒樣顆?；旌系腁mbal。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，粉塵提取物包括或可選擇地由室內(nèi)粉塵和塵螨組成。室內(nèi)粉塵的例子包括但不限于室內(nèi)粉塵、褥墊粉塵和裝修粉塵、塵螨的例子包括但不限于美洲塵螨(D.farniae)，歐洲塵螨(D.ptreronysiinus)，塵螨混合物和害嗜鱗螨(L.destructor)。粉塵提取物包括但不限于雪松和紅松粉塵、軋棉機(jī)粉塵、櫟木屑、谷物(谷倉(cāng))屑、紫檀木屑和木屑?jí)m螨是氣候濕潤(rùn)的發(fā)達(dá)國(guó)家中室內(nèi)長(zhǎng)期變應(yīng)原的一個(gè)重要來(lái)源(Arlian，L.，Current Allergy and Asthma ReportsL 581-586(2001)).。所有變應(yīng)性支氣管哮喘病患者中約有60-85％對(duì)室內(nèi)塵螨歐洲塵螨過(guò)敏(Arlian，L.，Current Allergy and Asthma Reports 1581-586(2001))。免疫顯性歐洲塵螨變應(yīng)原包括Der p1，Der f2，和Der2(Kircher，M.etal.，J.Allergy Clin.Immunol.109517-523(2002)and Clarke，A.et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.120126-134(1999)，其中全部?jī)?nèi)容這里引用作為參考)。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，組合物包括Der p1，Der f2，Der2，或其片斷，或其與病毒樣顆粒偶合或混合的抗原混合物。特別是在農(nóng)村，粉塵變態(tài)反應(yīng)的一個(gè)重要成因是害嗜鱗螨(Ericksson，T.等人，Clinical and Exp.Allergy 311181-1890(2001))。一種免疫顯性害嗜鱗螨變態(tài)反應(yīng)原是Lep d2(Ericksson，T.等人，Clinical and Exp.Allergy 311181-1890(2001))。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，組合物含有與病毒樣顆粒偶合或混合的Lep d2。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，真菌提取物包括或由下列成分組成鏈格孢屬、曲霉屬、葡萄孢屬、假絲酵母屬、頭孢屬、復(fù)端孢屬、毛殼屬、支孢屬、隱球酵母屬、彎孢屬、附球菌屬、表皮癬菌屬、鐮孢屬、麻孢殼屬、地霉屬、粘帚屬、長(zhǎng)蠕孢屬、單孢枝霉屬、小孢霉屬、毛霉屬、疣孢霉屬、黑孢屬、擬青霉屬、青霉屬、莖點(diǎn)霉屬、芽霉屬、根霉屬、紅酵母屬、銹菌、酵母屬、黑粉菌、椎枝孢屬、匍柄霉屬、木霉屬、發(fā)癬菌屬和輪枝孢屬。
在美國(guó)，鏈格孢(Alternaria alternata)被認(rèn)為是引起變應(yīng)性疾病的最重要的真菌之一，在美國(guó)和澳大利亞的沙漠地區(qū)，鏈格孢屬是主要的哮喘相關(guān)變應(yīng)原，在美國(guó)中西部地區(qū)已經(jīng)報(bào)道可引起嚴(yán)重呼吸停止和死亡(Vailes，L.等人，J.Allergy Clin.Immunol.107641(2001)和Shampain，M.等人，Am.Rev.Respir.Dis.126493-498(1982)，其中全部?jī)?nèi)容引用作為參考)。免疫顯性鏈格孢抗原是Alt a1(Vailes，L等人，J.Allergy Clin.Immunol.107641(2001))。超過(guò)80％的鏈格孢致敏的個(gè)體都含有抗Alt a的IgE抗體(2001))。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，該組合物含有與病毒樣顆?；旌匣蚺己系腁lt a1。
另一種機(jī)會(huì)性致病真菌是煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，它與多種肺病有關(guān)，包括過(guò)敏性哮喘。免疫顯性煙曲霉抗原包括Aspf1和Aspf16(Vailes，L等，J.Allergy Clin.Immunol.107641(2001))。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，組合物包括Aspf1或Aspf16或者是其與病毒樣顆粒偶聯(lián)或混合的抗原性混合物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，昆蟲(chóng)提取物包括，或可選擇地由整個(gè)蟲(chóng)體都能誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的有刺昆蟲(chóng)組成，有刺昆蟲(chóng)的毒液蛋白誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)，昆蟲(chóng)誘導(dǎo)吸入的變態(tài)反應(yīng)。整個(gè)蟲(chóng)體誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的有刺昆蟲(chóng)包括，但不限于螞蟻(黑)、螞蟻(紅)、雜交螞蟻(黑/紅)、螞蟻(火)。毒液蛋白誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的有刺昆蟲(chóng)的例子包括，但不限于蜜蜂、大黃蜂、黃蜂、小黃蜂、白面黃蜂和雜交黃蜂。誘導(dǎo)吸氣變態(tài)反應(yīng)的昆蟲(chóng)的例子包括，但不限于蚜蟲(chóng)、黑蠅、蝴蝶、石蛾、蟬/蝗蟲(chóng)、蟋蟀、蟑螂、水蚤、鹿虻、果蠅、蜜蜂(全身)、馬虱、家蠅、葉蟬、蜉蝣、墨西哥豆象鼻蟲(chóng)、螨(塵)、蚊子、蛾、蘑菇蠅、幼蠅、母豬蟲(chóng)、蜘蛛和水蚤。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，食品提取物包括，或由其組成，但不限于動(dòng)物產(chǎn)品和植物產(chǎn)品。動(dòng)物產(chǎn)品的例子包括但不限于鹿、牛、雞、鴨子、蛋(雞)、魚(yú)、山羊、鵝、小羊、奶(奶牛)、奶(山羊)豬肉、兔、貝類(lèi)和火雞。植物產(chǎn)品的例子包括，但不限于蘋(píng)果、杏、竹芋、朝鮮薊、蘆筍、avodaco、香蕉、豆、甜菜、漿果、卷心菜類(lèi)、胡蘿卜、旱芹、櫻桃、巧克力、柑橘類(lèi)、椰子、咖啡、黃瓜、棗椰子、茄子、谷物、葡萄、綠色植物、樹(shù)膠、啤酒花、萵苣、麥芽、芒果、甜瓜、蘑菇、堅(jiān)果、黃秋葵、橄欖、洋蔥、番木瓜、歐洲防風(fēng)草、豌豆、花生、梨子、西班牙甘椒、鳳梨、李子、土豆、梅干、南瓜、蘿卜、大黃、香料/調(diào)味品、菠菜、果汁、木薯粉、茶、西紅柿、西瓜和酵母。
兩種主要的變應(yīng)原性花生蛋白，其被95％的患者通過(guò)花生變態(tài)反應(yīng)識(shí)別，是Ara h1和Ara h2(Bannon，G.等人，Int.Arch.AllergyImmunol.12470-72(2001)和Li，X.等人，J.AllergyClin.Immunol.106150-158(2000))，其全部?jī)?nèi)容此處引用作為參考)。Arah3被約45％的花生變態(tài)反應(yīng)患者識(shí)別。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，組合物包括與病毒樣顆粒偶合或混合的抗原Ara h1、Ara h2或Ara h3或其抗原混合物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物表皮變應(yīng)原包括但不限于駱駝、貓的毛發(fā)、貓的毛皮、灰鼠毛皮、牛、鹿、狗、沙鼠、山羊、豚鼠、倉(cāng)鼠、豬、馬、馬海毛、猴、小鼠、兔、羊毛(綿羊)、在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，羽毛包括但不限于金絲雀、雞、鴨、鵝、鸚鵡、鴿子、火雞，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其它吸入物包括但不限于阿拉伯膠、藻類(lèi)、蓖麻子、棉絨、棉籽、魚(yú)藤根、蕨類(lèi)孢子、谷粒塵、大麻纖維、指甲花、亞麻籽、胍爾膠、黃麻、刺梧桐樹(shù)膠、木棉、皮革、石松、鳶尾根、除蟲(chóng)菊、絲(生絲)、劍麻、煙葉、黃耆膠和木屑。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，典型地包括從天然來(lái)源純化的或重組表達(dá)的限定的哺乳動(dòng)物反應(yīng)原。包括但不限于來(lái)自貓的Fel d1，F(xiàn)eld3(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)和來(lái)自貓、駱駝、灰鼠毛皮、牛、鹿、狗、沙鼠、山羊、豚鼠、倉(cāng)鼠、豬、馬、馬海毛、猴、小鼠、羊毛的白蛋白。
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在治療這類(lèi)疾病時(shí)應(yīng)知道如何為治療癌癥的組合物和方法選擇抗原或抗原決定簇(參見(jiàn)Renkvist等人，Cancer.Immunol.Immunother.503-15(2001)這里引用作為參考)，這些抗原或抗原決定簇包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)，這類(lèi)抗原或抗原決定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)；GD2(神經(jīng)母細(xì)胞瘤)；EGF-R(惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)；CEA(甲狀腺髓樣癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤蛋白gplOO；人黑素瘤蛋白gplOO表位，如氨基酸154-162(序列KTWGQYWQV，SEQ ID NO14)、209-217(ITDQVPFSV，SEQ ID NO15)、280-288(YLEPGPVTA，SEQ ID NO16)，457-466(LLDGTATLRL，SEQ ID NO17)和476-485(VLYRYGSFSV，SEQ IDNO18)；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1表位，如氨基酸26-35(EAAGIGILTV)(SEQ ID NO37)，26-35AL(ELAGIGICTV，SEQ ID NO38)，27-35(AAGIGILTV，SEQID NO19)和32-40(ILTVILGVL，SEQ ID NO20)；酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白(例如，TRP-1和TRP-2)；酪氨酸酶表位，如氨基酸1-9(MLLAVLYCL，SEQ ID NO21)和368-376(YMDGTMSQV，SEQ IDNO22)；NA17-A nt蛋白；NA17-A nt蛋白表位如氨基酸38-64(VLPDVFIRC，SEQ ID NO23)；MAGE-3蛋白；MAGE-3蛋白表位如氨基酸271-279(FLWGPRALV，SEQ ID NO24)；其它人腫瘤抗原，例如CEA表位如氨基酸571-579(YLSGANLNL，SEQ ID NO25)；p53蛋白；p53蛋白表位如氨基酸65-73(RMPEAAPPV，SEQ ID NO26)，149-157(STPPPGTRV，SEQ ID NO27)和264-272(LLGRNSFEV，SEQ ID NO28)；Her2/neu表位如氨基酸369-377(KIFGSLAFL，SEQID NO29)和654-662(IISAVVGIL，SEQ ID NO30)；HPV16 E7蛋白；HPV16 E7蛋白表位如氨基酸86-93(TLGIVCPI，SEQ ID NO31)；以及能夠用來(lái)引發(fā)免疫應(yīng)答的各自的片斷或突變體。
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在治療這類(lèi)疾病時(shí)應(yīng)當(dāng)知道如何為治療其它自身抗原相關(guān)疾病的組合物和方法選擇抗原或抗原決定簇。這類(lèi)抗原或抗原決定簇的代表性例子包括，例如淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LT(β))，和淋巴毒素受體，核因子kappaB受體激活劑(RANKL)，破骨細(xì)胞相關(guān)受體(OSCAR)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF-R)，白介素17和淀粉樣β肽Aβ1-42，TNFα，MIF，MCP-1，SDF-1，Rank-L，M-CSF，血管緊張肽原，血管緊張素I，血管緊張素II，Endoglin，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)，Grehlin，BLC，CCL21，IL-13，IL-17，IL-5，IL-8，IL-15，緩激肽，抵抗素，LHRH，GHRH，GIH，CRH，TRH和胃泌素，以及能用于引發(fā)免疫應(yīng)答的各自的片斷。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗原和抗原決定簇選自(a)HIV的重組多肽；(b)流行性感冒病毒的重組多肽(例如，流行性感冒病毒M2多肽或其片斷)；(c)丙肝病毒的重組多肽；(d)乙肝病毒的重組多肽；(e)弓形體重組多肽；(f)惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)重組多肽；(g)間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax)重組多肽；(h)Plasmodiumovale重組多肽；(i)Plasmodium malariae重組多肽；(j)乳腺癌細(xì)胞重組多肽；(k)腎癌細(xì)胞重組多肽；(l)前列腺癌細(xì)胞重組多肽；(m)皮膚癌細(xì)胞重組多肽；(n)腦癌細(xì)胞重組多肽；(o)白血病細(xì)胞重組多肽；(p)arecombinant profiling；(q)蜂針變態(tài)反應(yīng)重組多肽；(r)堅(jiān)果變態(tài)反應(yīng)重組多肽；(s)花粉重組多肽；(t)室內(nèi)粉塵重組多肽；(u)貓或貓毛發(fā)變態(tài)反應(yīng)重組多肽；(v)食物變態(tài)反應(yīng)重組蛋白；(w)哮喘重組蛋白；(x)衣原體重組蛋白；(y)提取自(a-x)中任意蛋白來(lái)源的抗原；和(z)(a)-(x)中任意蛋白的片斷。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，與包裝了免疫刺激性核酸或含非甲基化CpG的低聚核苷酸的本發(fā)明病毒樣顆粒偶合或混合的抗原是T細(xì)胞表位，它是細(xì)胞毒性表位或Th細(xì)胞表位。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，與包裝了免疫刺激性核酸或含非甲基化CpG的低聚核苷酸的本發(fā)明病毒樣顆粒偶合或混合的抗原是B細(xì)胞表位，在更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原至少是兩種、優(yōu)選地不同表位的組合物，其中至少兩種表位直接鏈接或通過(guò)連接序列連接。這些表位優(yōu)選地選自細(xì)胞毒性表位和Th細(xì)胞表位。
本發(fā)明的抗原，特別是所述表位可以被合成或重組表達(dá)，并且與病毒樣顆粒偶合，或利用重組DNA技術(shù)與病毒顆粒融合?？乖c病毒樣顆粒的示范性連接方法在WO 00/32227，WO01/85208和WO02/056905中公開(kāi)，其中公開(kāi)的內(nèi)容在此引用作為參考。，本發(fā)明也提供一種用于預(yù)防和/或減輕病情的疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物包括，或可選擇地由免疫有銷(xiāo)量的本發(fā)明免疫增強(qiáng)組合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑組成。
本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和/或減輕動(dòng)物病情的接種疫苗的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供防止多種動(dòng)物傳染病的方法，特別是哺乳動(dòng)物如人、猴、奶牛、狗、貓、馬、豬等。疫苗可設(shè)計(jì)用于治療各種病毒所致的傳染病，如HIV，流感，皰疹，病毒性肝炎，EB病毒，脊髓灰質(zhì)炎，病毒性腦炎，麻疹，雞瘟等；細(xì)菌病原性傳染病如肺炎，肺結(jié)核，梅毒等；或寄生蟲(chóng)病源性傳染病，如瘧疾、錐蟲(chóng)病、利什曼病、滴蟲(chóng)病、阿米巴病等。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了預(yù)防各種癌癥的疫苗，特別是預(yù)防哺乳動(dòng)物如人、猴子、奶牛、狗、貓、馬、豬等。疫苗可設(shè)計(jì)用于治療各種類(lèi)型的癌癥，包括但不限于淋巴瘤、癌癥、肉瘤、黑色素瘤。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)對(duì)動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物時(shí)，該組合物可以含有鹽、緩沖液、佐劑或希望用來(lái)提高組合物效力的其它物質(zhì)，在大量資料中提出了適于制備藥用組合物的材料的例子，包括REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，編著，Mack Publishing Co.，(1990))。
本發(fā)明組合物是接受者個(gè)體在給藥時(shí)可以耐受的則稱(chēng)為″藥學(xué)上可接受的″。此外，本發(fā)明組合物給藥是以″治療有效量″(也就是說(shuō)，足以產(chǎn)生預(yù)期藥效的劑量)。
本發(fā)明組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種方式給藥。具體選定的模式取決于病程，對(duì)于特定的所選組合物，取決于所治療病情的嚴(yán)重程度和有效治療所需的劑量。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法可以用醫(yī)學(xué)上可以接受的任何給藥方式即任何可以產(chǎn)生活性化合物的有效水平而不引起臨床上不可接受的副反應(yīng)，包括口服、直腸、非胃腸道、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(通過(guò)粉末、軟膏、滴丸或經(jīng)皮貼劑)，面頰或口或鼻噴霧。此處所用的術(shù)語(yǔ)″非胃腸道″指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸液在內(nèi)的給藥方式。本發(fā)明的組合物也可以直接注射到淋巴結(jié)內(nèi)。
用于給藥的組合物組分包括無(wú)菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和混懸液。非水性溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。可以利用載體或封閉性包衣提高皮膚透過(guò)性并促進(jìn)抗原吸收。
聯(lián)合給藥可以同時(shí)，例如以混合物的形式，分開(kāi)但同時(shí)給藥或共同給藥，或相繼給藥。這包括組合物藥劑作為治療混合物一起施用的形式，以及各種組合藥劑分開(kāi)但同時(shí)施用的方法，例如通過(guò)不同的靜脈輸入同一個(gè)體內(nèi)，“聯(lián)合”給藥還包括先給予一種化合物或抗原，接著再給與第二種。
劑量水平有賴于給藥模式，受試者的特性，和載體/佐劑的劑型質(zhì)量。VLP、抗原和佐劑的典型用量范圍為每個(gè)受試者約0.001μg至約20mg。優(yōu)選用量每個(gè)受試者至少約10μg至約500μμg。優(yōu)選使受試者免疫的多種給藥方式，方案是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序，適于正在處理的受試者。典型的抗原用量范圍與沒(méi)有加入VLP時(shí)的典型用量范圍是可比的、相似的或相同的。
組合物很容易以單位劑量的形式出現(xiàn)，可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域任意已知方法制備。方法中包括使本發(fā)明的組合物與含有一種或多種附屬成分的載體聯(lián)合的步驟。一般來(lái)說(shuō)，制備組合物是通過(guò)將本發(fā)明組合物統(tǒng)一與液體載體、微粉化的固體載體、或二者一起，進(jìn)行緊密的聯(lián)合，以及之后如果需要的話再進(jìn)行產(chǎn)品塑形。
適于口服的組合物可表現(xiàn)為不連續(xù)單位，如膠囊、片劑或錠劑，每一種含有預(yù)訂量的本發(fā)明組合物。其它組合物還包括水性液體或非水性液體混懸液，如糖漿、酏劑或乳劑。
其它給藥系統(tǒng)包括定時(shí)釋放、延遲釋放或緩釋給藥系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可以避免重復(fù)施用上述本發(fā)明組合物，方便了醫(yī)生和患者，有多種類(lèi)型的釋放給藥系統(tǒng)可以應(yīng)用，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括生產(chǎn)本發(fā)明組合物的方法，和利用該組合物治療癌癥和變態(tài)反應(yīng)的方法。
因而，本發(fā)明尤其涉及一下發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒(VLP)分別載有和包裝有免疫刺激核酸，優(yōu)選富含非甲基化C和G(CpG)和TLR配體的DNA低聚核苷酸，這些抗原與VLP偶合或混合，就誘導(dǎo)產(chǎn)生增強(qiáng)的針對(duì)這些抗原的免疫應(yīng)答。令人吃驚的是，如果在組合物中加入TLR配體，免疫原性顯著增強(qiáng)。此外，針對(duì)這些抗原的T細(xì)胞應(yīng)答特指Th1型。
下述實(shí)施例只是說(shuō)明性的，并非對(duì)本發(fā)明由權(quán)利要求所限定的范圍的限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行多種修改和變化。因此，本發(fā)明還覆蓋本發(fā)明的各種修改和變化后形式，只要它們?cè)跈?quán)利要求和其等同物的范圍內(nèi)。
本文提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和公開(kāi)文獻(xiàn)在此均全文引用作為參考。
實(shí)施例1VLP的制備含有來(lái)自LCMV的肽p33的HBcAg DNA序列在SEQ ID NO12中給出。所述p33-HBcAg VLP(p33-VLP)按如下方法制備含有乙肝病毒完整病毒基因組的乙型肝炎克隆pEco63購(gòu)自ATCC，表達(dá)質(zhì)粒的制備之前已有描述(參見(jiàn)WO03/024481)。
為了良好地表達(dá)，選擇克隆大腸桿菌K802，用上述質(zhì)粒對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)細(xì)胞并重懸浮于5ml裂解緩沖液(10mMNa2HP04，30mMNaCI，10mM EDTA，0.25％Tween-20，pH 7.0)中，加入200μl溶菌酶溶液(20mg/ml)。超聲處理后，加入4μl Benzonase和10mMMgCl2，懸浮液在室溫下孵育30分鐘，在4℃以15,000rpm離心15分鐘，保留上清液。
然后，向上清液中添加20％(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸銨。在冰上孵育30分鐘后，在4℃以20,000rpm離心15分鐘，棄去上清液，將沉淀重懸浮于2-3ml PBS，20ml PBS-溶液上樣到Sephacryl S-400凝膠(Amersham Phanmacia Biotechnology AG)過(guò)濾柱上，將級(jí)分上樣到SDS-Page凝膠上，合并含有純化p33-HBcAg VLP衣殼的部分。將合并后的部分上樣到羥基磷灰石柱上，收集流出液(含純化p33-HBcAg VLP衣殼)。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行電子顯微鏡檢查，Storni T.，等人，(2002)J Immunol.；168(6)2880-6圖1顯示一個(gè)范例。
應(yīng)當(dāng)指出只是為了方便才使用含有p33的VLP，本發(fā)明同樣能夠使用野生型VLP。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)p33-HBcAg VLP，HBcAg-p33 VLP，p33-VLP和HBc33可以互換使用。
實(shí)施例2將含CpG低聚核苷酸包裝入HBcAg VLP。
如實(shí)施例1所示制得重組VLP，進(jìn)行非變性瓊脂糖(1％)凝膠電泳，并用溴化乙錠或考馬斯藍(lán)染色，以檢測(cè)RNA/DNA或蛋白質(zhì)(圖.1)。細(xì)菌產(chǎn)生的VLP含有高水平的單鏈RNA，X射線結(jié)晶學(xué)顯示，該單鏈RNA可能與靠近HBcAg蛋白C端在結(jié)構(gòu)上位于VLP內(nèi)部的精氨酸重復(fù)片斷結(jié)合。通過(guò)VLP與Rnase孵育，污染的RNA很容易消化除去。高活性的RnaseA分子量約為14kDa，可以小到足以進(jìn)入VLP，從而去除不希望的核糖核酸。
重組VLP在經(jīng)RNase A消化前添加富含CpG的低聚核苷酸(參見(jiàn)SEQ ID NO11)。如圖2所示，CpG-低聚核苷酸的存在保持了衣殼結(jié)構(gòu)，與未處理的p33-VLP類(lèi)似的遷移證明了這一點(diǎn)。通過(guò)透析去除未結(jié)合的低聚核苷酸，純化含CpG-低聚核苷酸VLP(PBS中稀釋4500倍，24小時(shí)，使用300kDa MWCO透析膜(參見(jiàn)圖3).
實(shí)施例3通過(guò)RNAse除去RNA隨后將低聚核苷酸包裝入VLP，含CpG的低聚核苷酸能被裝入VLP。
VLP(含有細(xì)菌單鏈RNA，如實(shí)施例1所述制備)首先與RnaseA孵育以除去RNA，第二步，向樣品中添加免疫刺激性CpG-低聚核苷酸(具有正常的磷酸二酯結(jié)構(gòu)，并且具有磷酸主鏈的硫代磷酸修飾)(圖.4)。該試驗(yàn)清楚地表明，在RNA降解反應(yīng)過(guò)程中不是絕對(duì)地同時(shí)需要CpG-低聚核苷酸，而是可以在稍后添加。
實(shí)施例4通過(guò)核糖核酸酶消化，將CpG低聚核苷酸包裝到RNA噬菌體Qb內(nèi)。
本實(shí)驗(yàn)使用RNA噬菌體Qb的外殼蛋白構(gòu)成的VLP。使用未經(jīng)處理的或使用有磷酸主鏈硫代磷酸修飾的CpG-2006低聚核苷酸(SEQ-ID NO114)包裝的VLP。CpG-2006的包裝過(guò)程為，加入0.2ml的100mM ZnS04溶液，在60℃將8ml的Qb VLP溶液(2.2mg/ml)孵育過(guò)夜。這樣處理導(dǎo)致Qb VLP含有的RNA水解。在20mMHepes，pH 7.5條件下透析，透析管(閥值MWCO 300000)，將CpG-2006以130nmol/1ml VLP溶液加入，在37℃孵育3小時(shí)，以650rpm振搖。之后以50U/ml Benzonase(Merck)，加入1mM MgCl2，在37℃處理3小時(shí)隨后如上所述在20mM Hepes，pH 7.5下透析。除去未包裝的CpG-2006。
CpG-2006的包裝通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，以溴化乙錠染色使核酸可見(jiàn)，隨后以考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)可見(jiàn)。此外，包裝后的的VLP經(jīng)TBE-尿素凝膠分析，估計(jì)已包裝好的CpG-低聚核苷酸的量。約6.7nmol的CpG-2006被包裝入100μg Qb VLP。
實(shí)施例5將免疫刺激核酸包裝入VLP.
RNaseA和ZnSO4引起VLP核酸內(nèi)容物的降解。
用RNaseA在低離子強(qiáng)度條件下(20mM Hepes pH 7.4或4mMHepes，30mM NaCl，pH 7.4)處理Qβ VLP。可選擇地，用ZnSO4在低離子強(qiáng)度條件下(20mM Hepes pH 7.4 or 4mM Hepes，30mM NaCIpH 7.4)處理Qβ VLP和AP205VLP，類(lèi)似于實(shí)施例11所描述的情況。AP205 VLP(1mg/ml)在20mM Hepes pH 7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH 7.4條件下，在Eppendorf Thermomixer內(nèi)用2.5mMZnSO4在50℃處理48小時(shí)，以550rpm振搖.Qβ and AP205VLP在14000rpm下離心，隨后用1O.000 MWCOSpectra/Por透析管(Spectrum，Cat.nr.128118)先在2升20mM Hepes，pH 7.4條件下于4℃處理2小時(shí)，之后換緩沖液過(guò)夜。樣品在透析后是澄清的，如實(shí)施例4所述，上清液的蛋白質(zhì)濃度通過(guò)Bradford分析測(cè)定。
將ISS包裝入RnaseA和ZnSO4處理的VLP.
RNA水解和透析后，Qβ和AP205 VLP(1-1.5mg/ml)，用每毫升VLP 130μl的CpG低聚核苷酸混合(NKCpG-cf.表1；G3-6，G8-8-cf.表2；1mM低聚核苷酸存于10mM Tris pH 8)。樣品在37℃在650rpm的熱搖動(dòng)器中培養(yǎng)3小時(shí)。隨后，樣品用125U Benzonase/mlVLP(MerckKGaA，Darmstadt，德國(guó))處理，透析前在2mM MgCl2條件下在37℃孵育3小時(shí)。樣品在300.000 MWCOSpectra/Por透析管中(Spectrum，Cat.nr.131447)經(jīng)20mM Hepes，pH 7.4在4℃透析2小時(shí)，然后用同樣緩沖液更換該沖液并過(guò)夜透析后樣品在14000rpm離心分離，上清液的蛋白濃度通過(guò)Bradford透析測(cè)定。
瓊脂糖凝膠電泳，隨后以溴化乙錠和考馬斯藍(lán)染色顯示低聚核苷酸已包裝入VLP內(nèi)。
實(shí)施例6將核糖核酸包裝到VLP中。
VLP核酸內(nèi)容物的ZnSO4依賴降解。
Qβ VLP用ZnSO4處理，在低離子強(qiáng)度條件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH 7.4)進(jìn)行，如同實(shí)施例11.
AP205VLP(1mg/ml)在20mM Hepes pH 7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH 7.4于550rpm振搖48小時(shí)，2.5mM ZnSO4中于50℃，用Eppendorf Thermomixer，Qβ和AP205VLP樣品如同實(shí)施例8在14000rpm離心分離和在20mM Hepes，pH 7.4中透析。
將poly(I:C)包裝入經(jīng)ZnSO4處理的VLP免疫刺激核糖核酸poly(I:C)，(Cat.nr.27-4732-01，poly(I)poly(C)，Pharmacia Biotech)溶解于PBS(Invitrogen cat.nr.14040)或水中，濃度為4mg/ml(9μM)。poly(I:C)在60℃孵育10分鐘，然后冷卻至37攝氏度。將孵育后的poly(I:C)10倍摩爾數(shù)過(guò)量的量加入ZnSO4-處理的Qβ或AP205VLP(1-1.5mg/ml)，混合物在650rpm的thermomixer中于37℃培養(yǎng)3小時(shí)。隨后，過(guò)量的游離poly(I:C)經(jīng)酶水解，具體是與125U Benzonase/毫升VLP混合物在加入2mMMgCl2條件下于37℃在300rpm的thermomixer孵育30分鐘。Benzonase水解樣品在14000rpm離心分離，上清液在300.000MWCOSpectra/Por透析管(Spectrum，Cat.nr.131 447)中透析，用2升20mM Hepes，pH 7.4于4℃透析2小時(shí)，用相同的緩沖液換緩沖液過(guò)夜。透析后，樣品在14000rpm離心分離，上清液中蛋白質(zhì)濃度通過(guò)Bradford分析測(cè)定。
在1％瓊脂糖凝膠，在蛋白酶K降解后，在TBE/尿素凝膠確認(rèn)包裝成功。
實(shí)施例7將核糖核酸包裝入HBcAg VLP內(nèi)HBcAg VLP用ZnSO4處理，在低離子強(qiáng)度條件下(20mM HepespH 7.4or 4mM Hepes，30mMNaCI，pH 7.4)，類(lèi)似于實(shí)施例11，如實(shí)施例22經(jīng)20mM Hepes pH 7.4下透析。加入摩爾數(shù)10倍過(guò)量于HBcAg VLP(1-1.5mg/ml)的poly(I:C)，在650rpm的thermomixe中于37℃培養(yǎng)3小時(shí)。如同實(shí)施例24。隨后過(guò)量的游離poly(I:C)進(jìn)行酶水解，具體是與每毫升VLP 125U Benzonase的混合物在加入2mM MgCl2條件下在300rpm的thermomixer中于37C孵育3小時(shí)。樣品在Benzonase水解后變得澄清，類(lèi)似于實(shí)施例4的情況，如實(shí)施例9進(jìn)行透析。透析后，樣品在14000rpm下離心，上清液的蛋白質(zhì)濃度由Bradford分析測(cè)定。
實(shí)施例8只有CpG能增強(qiáng)針對(duì)與HBcAg融合的p33(p33-VLP)的CTL應(yīng)答。
p33-VLP按下述方法制備含有全部乙肝病毒的病毒基因組的乙肝病毒克隆pEco63購(gòu)自ATCC。在tac啟動(dòng)子控制下，編碼HBcAg的基因?qū)氡磉_(dá)載體pKK223.3(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，NJ)的EcoRI/HindIII限制位點(diǎn)。衍生自LCMV的p33肽(KAVYNFATM)(SEQ ID NO60)按照標(biāo)準(zhǔn)PCR方法通過(guò)三個(gè)亮氨酸連接體與HBcAg(aa1-183)的C-末端融合。E.coli K802d用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以2升的培養(yǎng)物生長(zhǎng)直到光學(xué)密度為1(600nm波長(zhǎng)下)。通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞4小時(shí)(Sigma，Division of Fluka AG，瑞士)至最終濃度為1mM。
離心分離收集細(xì)菌，使重懸浮于5ml溶解緩沖液(10mMNa2HPO4，30mMNaCl，10mM EDTA，0.25％Tween-20，pH 7.0)。加入μl200μl的溶菌酶溶液(20mg/ml)。超聲降解后，將4μl benzonase(Merck，Darmstadt，德國(guó))和10mM MgCl2補(bǔ)充入細(xì)胞溶解產(chǎn)物?；鞈乙涸赗T下孵育30分鐘，在27000xg下離心15。保留的混懸液補(bǔ)充20％(w/v)硫酸銨鹽。在冰上孵育30分鐘后，在48000xg下離心分離15分鐘，棄去混懸液，顆粒狀物重懸浮于2-3ml磷酸緩沖液。將制得物上樣到Sephacryl S-400凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia BiotechInc.，NJ)進(jìn)行純化。在SDS PAGE凝膠中分析流分的蛋白質(zhì)含量，合并含純HBc衣殼的流分。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行電子顯微鏡檢查。.在各種TLR配體(每一種100μg)存在條件下用p33VLP(100μg)致小鼠免疫μg(參見(jiàn)圖.5)。
LPS(E.coli K-235)購(gòu)自Sigma(Buchs，瑞士)，poly(I:C)來(lái)自Amersham Biosciences(Dubendorf，瑞士)，肽聚糖(金黃色葡萄球菌(S.aureus)來(lái)自Fluka(Buchs，))瑞士)，Imiquimodum(asAldara cream)來(lái)自3M(Ruschlikon，瑞士)。脂磷壁酸(金黃色葡萄球菌和鏈球菌(Streptococcus))由LUNAMeD AG(Zurich，Schwitzerland)提供。硫代磷酸修飾的CpG-ODN由Microsynth合成(Balgach，瑞士)。十二天后，用四聚物染色法測(cè)定血液中p33-特異T細(xì)胞的頻率。收集血樣加入FACS緩沖液(PBS，2％FBS，5mM EDTA)，通過(guò)密度梯度法離心分離淋巴細(xì)胞，條件是在淋巴細(xì)胞-M溶液中在1200g、22℃條件下分離20分鐘(Cedarlane Laboratories Ltd.，Hornby，Canada)。沖洗后淋巴細(xì)胞重懸浮于FACS緩沖液在4℃用PE-標(biāo)記的p33-H-2b四聚復(fù)合物染色10分鐘，之后用抗鼠CD8a-FITC抗體在37℃染色30分鐘，(Pharmingen，clone 53-6.7)細(xì)胞在FACSCalibur上使用CellQuest軟件分析(BD Biosciences，Mountain View，CA)。
圖5顯示不同的TLRs配體，TLR9配件CpG例外，不能增強(qiáng)針對(duì)肽p33融合的乙肝病毒核心抗原(p33-VLP)的T細(xì)胞應(yīng)答。在PBS或指示的TLRs刺激存在條件下用p33-VLP致小鼠免疫。用100μgμgHBc33和100μμg佐劑。八天后，用四聚物染色法測(cè)定p33-特異T細(xì)胞的頻率。每個(gè)柱代表一個(gè)小鼠個(gè)體(LTA＝脂磷壁酸，PGN＝肽聚糖，LPS來(lái)自E.coli K-235，Sigma).
實(shí)施例9標(biāo)準(zhǔn)佐劑如礬和IFA不能增強(qiáng)p33-特異CTL應(yīng)答。按照標(biāo)準(zhǔn)程序在CyCpGpt(20nmol)，礬或IFA，用100μg p33-融合的HBcAg(p33-VLP)致小鼠免疫，12天后，用活LCMV(200pfu)攻擊小鼠以測(cè)定抗病毒保護(hù)力。五天后，測(cè)脾內(nèi)病毒效價(jià)。在含2％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基(Gibco)中用勻化器研磨脾臟，并補(bǔ)充谷氨酸鹽，earls′s鹽和抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素)?；鞈乙合♂屖逗笱杆僭贛C57細(xì)胞上滴定。孵育一小時(shí)后用含5％胎牛血清、1％甲基纖維素和抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素)的DMEM覆蓋。接著在37下孵育兩天，用細(xì)胞內(nèi)染色法(感染病毒核蛋白)測(cè)定細(xì)胞感染LCMV的情況。細(xì)胞用4％甲醛固定30分鐘，之后用1％Triton X-100進(jìn)行20分鐘的細(xì)胞溶解。用10％胎牛血清孵育1小時(shí)阻斷非特異性結(jié)合，細(xì)胞用大鼠抗-LCMV-抗體(VL-4)染色1小時(shí)。以過(guò)氧化酶-綴合的山羊抗-鼠-IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc)作為第二抗體使用，然后與ODP底物發(fā)生顏色反應(yīng)，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行(圖6)。
圖6顯示原型佐劑礬和IFA不能增強(qiáng)VLP誘導(dǎo)的免疫性。小鼠在PBS，CpG，礬或IFA存在條件下接種p33-VLP，8天后用活LCMV(200pfu)激發(fā)免疫反應(yīng)。五天后測(cè)脾內(nèi)病毒效價(jià)。
實(shí)施例10TLR4配體增強(qiáng)了由裝載CpG的VLP誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答如同實(shí)施例7，肽p33與Qb偶合并裝載CpG。本試驗(yàn)所用CpG為NK CpG(GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO52)。
隨后在PBS，MPL(Sigma，根據(jù)廠商指示，用a 1∶1的混合物)或LPS(20μgμg，E.coli K-235，Sigma)存在條件下，用p33-Qb/CpG(180μμg)致小鼠免疫。十天后，用四聚物染色法測(cè)定p33-特異T細(xì)胞的頻率(Fig 7A)。將采集的血樣放入FACS緩沖液(PBS，2％FBS，5mM EDTA)且在淋巴細(xì)胞通過(guò)密度梯度濃縮分離淋巴細(xì)胞，條件是在淋巴細(xì)胞-M溶液中在1200g、22℃條件下分離20分鐘(CedarlaneLaboratories Ltd.，Hornby，Canada)。沖洗重懸浮于FACS緩沖液中的淋巴細(xì)胞之后，在4℃下用PE標(biāo)記的p33-H-2b四聚絡(luò)合物染色10分鐘，隨后在37℃用抗鼠CD8a-FITC抗體染色30分鐘(Pharmingen，clone 53-6.7)。在FACS Calibur上使用CellQuest軟件(BD Biosciences，Mountain View，CA)分析細(xì)胞。
同日，用表達(dá)LCMV-GP(肽p33的來(lái)源)的重組疫苗病毒經(jīng)腹膜內(nèi)給藥攻擊小鼠，且在五天后測(cè)定卵巢內(nèi)的病毒效價(jià)(圖7B)。在含5％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基(Gibco)中用勻化器研磨卵巢，并補(bǔ)充谷氨酸鹽，earls′s鹽和抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素)?；鞈乙合♂屖逗笱杆僭贐SC40細(xì)胞上滴定。在37℃下孵育過(guò)夜，粘著細(xì)胞層用含50％乙醇、2％結(jié)晶紫和150mMNaCI的溶液染色，使病毒斑可見(jiàn)。
圖7顯示TLR4配體增強(qiáng)了CTL針對(duì)裝載CpG的VLP偶合的p33而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。在PBS，LPS或MPL(1∶1混合物)存在條件下，小鼠接種與裝載NK-PO CpG的Qb偶合的p33。八天后，用四聚物染色法測(cè)定p33-特異T細(xì)胞的頻率(A)。同日，用表達(dá)LCMV-GP的重組疫苗病毒攻擊小鼠，且在五天后測(cè)定卵巢內(nèi)的病毒效價(jià)(B)。
實(shí)施例11常規(guī)的佐劑不能增強(qiáng)由裝載CpG的VLP誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。
同實(shí)施例21，肽p33與Qb偶合并裝載CpG。本試驗(yàn)所用CpG為NK CpG(GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO52)或G10-PO(GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG)(SEQ ID NO54)。隨后按照標(biāo)準(zhǔn)程序，在PBS，礬或IFA存在的條件下，用p33-Qb/CpG(180μg)使小鼠免疫。十天后，用四聚物染色法測(cè)定p33-特異T細(xì)胞的頻率。將采集的血樣放入FACS緩沖液(PBS，2％FBS，5mMEDTA)且在淋巴細(xì)胞通過(guò)密度梯度濃縮分離淋巴細(xì)胞，條件是在淋巴細(xì)胞-M溶液中在1200g、22℃條件下分離20分鐘(CedarlaneLaboratories Ltd.，Hornby，Canada)。沖洗重懸浮于FACS緩沖液中的淋巴細(xì)胞之后，在4℃下用PE標(biāo)記的p33-H-2b四聚絡(luò)合物染色10分鐘，隨后在37℃用抗鼠CD8α-FITC抗體染色30分鐘(Pharmingen，clone 53-6.7)。在FACS Calibur上使用CellQuest軟件(BD Biosciences，Mountain View，CA)分析細(xì)胞。
同日，用表達(dá)LCMV-GP(肽p33的來(lái)源)的重組疫苗病毒經(jīng)腹膜內(nèi)給藥攻擊小鼠，且在五天后測(cè)定卵巢內(nèi)的病毒效價(jià)。在含5％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基(Gibco)中用勻化器研磨卵巢，并補(bǔ)充谷氨酸鹽，earls′s鹽和抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素)?；鞈乙合♂屖逗笱杆僭贐SC40細(xì)胞上滴定。在37℃下孵育過(guò)夜，粘著細(xì)胞層用含50％乙醇、2％結(jié)晶紫和150mM NaCI的溶液染色，使病毒斑可見(jiàn)。
表1說(shuō)明書(shū)中所用到的一些免疫刺激核酸的術(shù)語(yǔ)和序列。
小寫(xiě)字母表示通過(guò)硫代磷酸鍵連接的脫氧核糖核酸，大寫(xiě)字母表示通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核酸。

序列表<110>Cytos Biotechnology AGBachmann，Martin FSchwarz，Katrin<120>包裝的病毒樣顆粒<130>C62863PC<150>US 60/485,717<151>2003-07-10<160>60<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>1Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 1015Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 9095Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>2<211>329<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>2Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>3<211>128<212>PRT<213>噬菌體PP7<400>3Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125<210>4<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Qbeta 240突變體<400>4Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115120125Asn Pro Ala Tyr130<210>5<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 243突變體<400>5Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 7580
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 9095Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>6<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 250突變體<400>6Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 7580Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>7<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 251突變體<400>7Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115120 125Ash Pro Ala Tyr130<210>8<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 259突變體<400>8Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 9095Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>9<211>185<212>PRT<213>乙肝病毒<400>9Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>10<211>185<212>PRT<213>乙肝病毒<400>10Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala6570 7580Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180185
<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyCpG<400>11tccatgacgt tcctgaataa t 21<210>12<211>594<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有p33的乙肝病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(594)<400>12atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 1015tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60
ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca 240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala6570 7580tcc agg gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag 288Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 9095atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga 336Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105110gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act 384Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg 432Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga 480Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga 528Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170175aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt ctt crc ctt aaa gct gtt tac 576Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180 185 190aac ttc gct acc atg taa 594Asn Phe Ala Thr Met195<210>13<211>197<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有p33的乙肝病毒
<400>13Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala6570 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 9095Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
165170175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180185 190Asn Phe Ala Thr Met195<210>14<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala1 5
<210>17<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu1 5 10<210>18<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val1 5 10<210>19<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>19Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu1 5
<210>21<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>21Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>23Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>24Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val1 5
<210>25<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>25Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>26Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>27Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>28Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val15
<210>29<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>29Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>30Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu15<210>31<211>8<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>31Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile1 5<210>32<211>131<212>PRT<213>噬菌體AP205<400>32Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115120 125Thr Thr Ala130<210>33<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體AP205突變體<400>33Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115120 125Thr Thr Ala130<210>34<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HBcAg肽<400>34
Gly Gly Lys Gly Gly1 5<210>35<211>152<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HBcAg變體<400>35Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 1015Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly6570 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 9095Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115120 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val145 150<210>36<211>185<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HBcAg變體<400>36Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 1015Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Ser35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala6570 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 9095
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Ser Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>37<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>37Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 510<210>38<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>38Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Cys Thr Val1 5 10
<210>39<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ISS<400>39gacgatcgtc 10<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G3-6<400>40ggggacgatc gtcgggggg 19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G4-6<400>41gggggacgat cgtcgggggg20<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G5-6<400>42ggggggacga tcgtcggggg g 21<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G6-6<400>43gggggggacg atcgtcgggg gg 22<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G7-7<400>44ggggggggac gatcgtcggg gggg 24<210>45<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G8-8<400>45ggggggggga cgatcgtcgg gggggg 26<210>46<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G9-9<400>46gggggggggg acgatcgtcg gggggggg 28<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G6<400>47ggggggcgac gacgatcgtc gtcggggggg 30<210>48<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CpG-2006，通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸<400>48tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt23<210>49<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyCpGpt，通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸<400>49tccatgacgt tcctgaataa t 21
<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>B-CpGpt，通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸<400>50tccatgacgt tcctgacgtt20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>B-CpG<400>51tccatgacgt tcctgacgtt20<210>52<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NKCpG<400>52ggggtcaacg ttgaggggg 19<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyCpG-rev-pt，通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸<400>53attattcagg aacgtcatgg a 21<210>54<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>g10gacga-PO(G10-PO)<400>54gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30<210>55<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>g10gacga-PS(G10-PS)，通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核苷酸<400>55gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30<210>56<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>(CpG)20OpA<400>56cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg aaatgcatgt caaagacagc60at 62
<210>57<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cy(CpG)20<400>57tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc60g61<210>58<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cy(CpG)20-OpA<400>58tccatgacgy cctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc 60gaaatgcatg tcaaagacag cat83<210>59<211>253<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>dsCyCpG-253<400>59ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgattc atgacttcct gaataattcc60atgacgttgg tgaataattc catgacgttc ctgaataatt ccatgacgtt cctgaataat 120tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat 180
aattccatga cgttcctgaa taattccatg acgttcctga aaattccaat caagcttatc 240gataccgtcg acc 253<210>60<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>60Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，包括(a)病毒樣顆粒；(b)免疫刺激核酸；其中所述免疫刺激核酸(b)與到所述病毒樣顆粒(a)結(jié)合；(c)至少一種抗原，其中所述抗原與所述病毒樣顆粒(a)混合或偶合；和(d)至少一種toll樣受體(TLR)配體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述TLR配體(d)與所述VLP混合。
3.前述權(quán)利要求中的任何組合物，其中所述TLR配體選自TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，或TLR11。
4.前述權(quán)利要求中的任何組合物，其中所述免疫刺激核酸(b)激活的TLR不同于配體(d)激活的的TLR。
5.前述權(quán)利要求中任一組合物，其中所述配體是TLR4配體。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述激活TLR4的配體(d)選自(a)LPS和其衍生物；(b)單磷酰脂A和其衍生物；(c)合成的LPS類(lèi)似物(d)gp96及其衍生物；(e)熱激蛋白；或(f)防衛(wèi)素。
7.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸選自(a)核糖核酸；(b)脫氧核糖核酸，(c)嵌合核酸；或(d)核酸(a)，(b)和/或(c)中至少一種的任意混合物。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述核糖核酸是poly-(IC)或其衍生物。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述脫氧核糖核酸選自(a)含非甲基化的CpG的低聚核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的低聚核苷酸。
10.權(quán)利要求1至7和權(quán)利要求9之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸是含非甲基化CpG的低聚核苷酸。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸包括序列5′X1X2CGX3X43′，其中X1，X2，X3，和X4為任意核苷酸。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述核苷酸X1，X2，X3，和X4中至少一種有磷酸主鏈修飾。
13.權(quán)利要求10的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸包括，或可選擇地基本由下述序列構(gòu)成，或可選擇地由下述序列構(gòu)成，所述序列選自(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO49)；(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO51)；(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO52)；(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO54)；或(e)″dsCyCpG-253″(SEQ ID NO59)。
14.權(quán)利要求10的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述回文序列為GACGATCGTC(SEQ ID NO39)。
16.權(quán)利要求10的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸包括，或可選擇地基本由下述序列構(gòu)成，或可選擇地由下述序列構(gòu)成GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO54).
17.權(quán)利要求10至16之任一的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸含由一種或多種磷酸主鏈的硫代磷酸修飾或所述低聚核苷酸磷酸主鏈各個(gè)磷酸鹽部分均為硫代磷酸修飾。
18.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，與所述病毒樣顆粒通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合。
19.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，被包裝進(jìn)所述病毒樣顆粒內(nèi)。
20.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸(b)裝入所述病毒樣顆粒(a)。
21.權(quán)利要求14或15之任一的組合物，其中所述回文序列在其3′-末端和5′-末端側(cè)翼連接有10個(gè)或少于10個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
22.權(quán)利要求14或15之任一的組合物，其中所述回文序列在其N(xiāo)-末端側(cè)翼連接有最少3個(gè)和至多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，和其中所述回文序列在其C-末端側(cè)翼連接最少6個(gè)和最多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
23.權(quán)利要求14或15之任一的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸的核酸序列選自(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO40)；(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO41)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO42)；(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO43)；(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO44)；(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO45)；(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO46)；或(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO47)。
24.權(quán)利要求14或15之任一的組合物，其中所述回文序列在其5′-末端側(cè)翼連接有最少4個(gè)和最多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，和其中所述回文序列在其3′-末端側(cè)翼連接有最少6個(gè)和最多9個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，且優(yōu)選其中所述回文序列在其5′-末端側(cè)翼連接最少5個(gè)和最多8個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體，和其中所述回文序列在其3′-末端側(cè)翼連接有最少6個(gè)和最多8個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷體。
25.權(quán)利要求14或15之任一的組合物，其中所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸的核酸序列為SEQ ID NO45。
26.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，包括約6到約300個(gè)核苷酸，優(yōu)選約6到約100個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選約6到約40個(gè)核苷酸。
27.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，包括約20到約300個(gè)核苷酸，優(yōu)選約20到約100個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選約20到約40個(gè)核苷酸。
28.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，包括約10到約30個(gè)核苷酸。
29.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，選自(a)重組低聚核苷酸；(b)基因組低聚核苷酸；(c)合成低聚核苷酸；(d)質(zhì)粒衍生的低聚核苷酸；(e)PCR產(chǎn)物；(f)單鏈低聚核苷酸；或(g)雙鏈低聚核苷酸。
30.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸(b)連接病毒樣顆粒的位點(diǎn)上，該位點(diǎn)選自低聚核苷酸結(jié)合點(diǎn)，DNA結(jié)合點(diǎn)和RNA結(jié)合點(diǎn)。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述低聚核苷酸結(jié)合點(diǎn)是非天然存在的低聚核苷酸結(jié)合點(diǎn)。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述病毒樣顆粒位點(diǎn)包括富含精氨酸重復(fù)序列。
33.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸(b)是含非甲基化CpG的低聚核苷酸，且其中所述配體(d)是TLR1，2，3，4，5，6，7，8，10或11的配體。
34.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸(b)含非甲基化CpG的低聚核苷酸，且其中所述配體(d)是TLR4的配體，優(yōu)選是LPS或其衍生物。
35.權(quán)利要求1至32之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸(b)是poly-(IC)，且其中所述配體(d)是TLR1，2，4，5，6，7，8，9，10或11的配體。
36.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述免疫刺激核酸(b)，和優(yōu)選的所述含非甲基化CpG的低聚核苷酸，含有一種或多種磷酸主鏈的硫代磷酸修飾物或所述低聚核苷酸磷酸主鏈中的每一磷酸部分均為硫代磷酸修飾物。
37.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所說(shuō)病毒樣顆粒(a)缺少含脂蛋白的被膜。
38.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述病毒樣顆粒(a)是重組病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒優(yōu)選選自(a)RNA噬菌體重組蛋白；(b)麻疹病毒重組蛋白；(c)辛德比斯病毒重組蛋白；(d)輪狀病毒重組蛋白；(e)口蹄疫病毒重組蛋白；(f)逆轉(zhuǎn)錄病毒重組蛋白；(g)諾沃克病毒重組蛋白；(h)阿爾發(fā)病毒重組蛋白；(i)人乳頭狀瘤病毒重組蛋白；(j)多瘤病毒重組蛋白；(k)噬菌體重組蛋白；(l)乙肝病毒重組蛋白；(m)Qβ-噬菌體重組蛋白；(n)GA-噬菌體重組蛋白(o)fr-噬菌體重組蛋白；(p)AP 205-噬菌體重組蛋白；(q)Ty重組蛋白；和(r)從(a)到(p)中任何重組蛋白的片斷。
39.前述權(quán)利要求之任一組合物，其中所述重組病毒顆粒是乙肝病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。
40.權(quán)利要求1至38之任一的組合物，其中所述病毒樣顆粒包括，或可選擇地基本由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片斷組成，或可選擇地由RNA-噬菌體的重組蛋白或其片斷組成，其中所述RNA-噬菌體選自(a)噬菌體Qβ；(b)噬菌體R17；(c)噬菌體fr；(d)噬菌體GA；(e)噬菌體SP；(f)噬菌體MS2；(g)噬菌體M11；(h)噬菌體MX1；(i)噬菌體NL95；(j)噬菌體f2；(k)噬菌體PP7；和(l)噬菌體AP205
41.權(quán)利要求1至38之任一的組合物，其中所述病毒樣顆粒包括RNA噬菌體的重組蛋白或其片斷，其中所述RNA噬菌體是噬菌體Qβ或噬菌體AP205。
42.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述病毒樣顆粒包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)，且其中所述抗原(c)還包括至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)，選自(a)抗原或抗原決定簇上非天然存在的附著位點(diǎn)；和(b)所述抗原或抗原決定簇上天然存在的附著位點(diǎn)；且其中所述第二附著位點(diǎn)能與所述第一附著位點(diǎn)締合。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中還包括氨基酸連接體，其中所述氨基酸連接體包括，或可選擇地由所述第二附著位點(diǎn)組成。
44.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述抗原(c)選自(a)多肽；(b)脂蛋白；和(c)糖蛋白。
45.前述權(quán)利要求之任一的組合物，其中所述抗原(c)是重組抗原。
46.權(quán)利要求1至44之任一的組合物，其中所述抗原(c)從天然來(lái)源中分離得到。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述天然來(lái)源選自(a)花粉提取物；(b)粉塵提取物；(c)塵螨提取物；(d)真菌提取物；(e)哺乳動(dòng)物表皮提取物；(f)羽毛提取物；(g)昆蟲(chóng)提取物；(h)食物提取物，(i)毛發(fā)提取物；(j)唾液提取物，和(k)血清提取物。
48.權(quán)利要求1至44之任一的組合物，其中所述抗原(c)衍生自(a)病毒；(b)細(xì)菌；(c)寄生蟲(chóng)；(d)朊病毒；(e)腫瘤；(f)自身分子；(g)非肽半抗原分子；(h)變態(tài)反應(yīng)原；和(i)荷爾蒙。
49.權(quán)利要求1至44中任一組合物，其中所述抗原(c)是腫瘤抗原。
50.權(quán)利要求49的組合物，其中所述腫瘤抗原選自(a)Her2；(b)GD2；(c)EGF-R；(d)CEA；(e)CD52；(f)人黑素瘤蛋白gp100；(g)人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1；(h)酪氨酸酶；(i)NA17-A nt蛋白；(j)MAGE-3蛋白；(k)p53蛋白；(l)HPV16 E7蛋白；(m)從(a)到(l)中任何抗原的類(lèi)似物；和(n)從(a)到(m)中的任何腫瘤抗原的抗原片斷。
51.權(quán)利要求1至44中任一組合物，其中所述抗原(c)是變態(tài)反應(yīng)原。
52.權(quán)利要求51的組合物，其中所述變態(tài)反應(yīng)原衍生自(a)花粉提取物；(b)粉塵提取物；(c)塵螨提取物；(d)真菌提取物；(e)哺乳動(dòng)物表皮提取物；(f)羽毛提取物；(g)昆蟲(chóng)提取物；(h)食物提取物，(i)毛發(fā)提取物；(j)唾液提取物，和(k)血清提取物。
53.權(quán)利要求51的組合物，其中所說(shuō)變態(tài)反應(yīng)原選自(a)樹(shù)；(b)草；(c)室內(nèi)粉塵；(d)室內(nèi)塵螨；(e)曲霉菌；(f)動(dòng)物毛發(fā)；(g)動(dòng)物羽毛；(h)蜂毒；(i)動(dòng)物產(chǎn)品；和(j)植物產(chǎn)品。
54.權(quán)利要求1至44中任一組合物，其中所述抗原(c)選自(a)蜂毒磷脂酶A2；(b)豕草花粉Amb a1；(c)樺樹(shù)花粉Bet vI；(d)白面大黃蜂毒5Dol mV；(e)室內(nèi)塵螨Der p1；(f)室內(nèi)塵螨Der f2；(g)室內(nèi)塵螨Der2；(h)塵螨Lep d；(i)真菌變態(tài)反應(yīng)原Alt a1；(j)真菌變態(tài)反應(yīng)原Aspf1；(k)真菌變態(tài)反應(yīng)原Aspf16；和(l)花生變態(tài)反應(yīng)原。
55.權(quán)利要求1至44之任一的組合物，其中所述抗原(c)是細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，Th細(xì)胞表位和所述表位中至少兩種的聯(lián)合，其中所述至少兩種表位直接連接或通過(guò)連接序列連接。
56.權(quán)利要求53的組合物，其中所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位選自(a)病毒表位；(b)腫瘤表位；和(c)變態(tài)反應(yīng)表位。
57.增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，包括在所述動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入組合物，該組合物包括權(quán)利要求1至56中任一組合物。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
59.權(quán)利要求57的方法，其中所述組合物通過(guò)皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)方式導(dǎo)入所述動(dòng)物，和直接導(dǎo)入淋巴結(jié)。
60.一種疫苗，包括免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求1至56之任一的組合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔料。
61.一種致免疫或治療動(dòng)物的方法，包括給予所述動(dòng)物免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求60的疫苗。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
63.根據(jù)權(quán)利要求1至56的任何組合物或根據(jù)權(quán)利要求要求60的疫苗在制備治療病癥或疾病的藥物中的用途，所述病癥或疾病包括且優(yōu)選變態(tài)反應(yīng)、腫瘤、慢性病和慢性的病毒性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答的組合物和方法，所述抗原與由免疫刺激核酸包裝的病毒樣顆粒(VLP)偶合或融合，所述免疫刺激核酸優(yōu)選含有至少一種非甲基化CpG序列和toll樣受體(TLR)配體的低聚核苷酸。本發(fā)明可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答，特別是用于治療變態(tài)反應(yīng)、腫瘤、慢性病毒性疾病和其它慢性病。
文檔編號(hào)A61K39/02GK1802173SQ200480015952
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者馬丁·F·巴克曼, 卡特林·施瓦茨 申請(qǐng)人:賽托斯生物技術(shù)公司