本發(fā)明涉及一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，屬于生物醫(yī)用材料制備技術領域。

背景技術：

家蠶絲素蛋白分子由后部絲腺分泌，經中部絲腺分泌的絲膠蛋白包被，再經由前部絲腺和紡絲管而成絲纖維，又稱繭絲。繭絲經過加工成為廠絲，廠絲是最常見的天然絲纖維形式。廠絲經過編織、機織或針織即可形成紗線或絲織物，再經過脫膠即可用于人體服用或醫(yī)用。蠶絲編織縫合線應用臨床已有上百年歷史，絲素蛋白纖維人工血管、人工肌腱和人工韌帶的研究也已經取得了初步成果。再生絲素蛋白是廠絲經過脫膠、溶解、透析和干燥之后獲得的絲素蛋白。在過去的30年時間里，再生絲素蛋白生物材料得到了迅猛的發(fā)展。在生物醫(yī)學領域的應用主要集中在組織工程支架、傷口敷料、人工皮膚、神經導管、藥物緩釋材料、生物傳感器等方面。

中國生絲年產量近10萬噸，約占世界總產量的70-80％。然而，目前用于醫(yī)學領域的比例極低。最主要的原因之一就是，缺少規(guī)?；?、標準化、快速、節(jié)能、綠色環(huán)保、成本較低的生產方法，缺少批量化、質量穩(wěn)定、純度高、分子量可控的再生絲素蛋白原材料。而目前文獻報道中可查證的再生絲素蛋白的制備方法，多為實驗室小量試驗所用。而且，文獻中描述的關于脫膠、溶解、透析或干燥的方法多達幾十種，不一而足。因此，所制備的再生絲素蛋白結構與性能多樣、穩(wěn)定性與可比性較差。這就極大地制約了再生絲素蛋白生物材料更深入的研發(fā)和更廣泛的推廣應用。而且，所述脫膠過程耗時長、效率低、不易精確控制。

經檢索，目前再生絲素蛋白的脫膠方法中，均要添加鹽、酶、酸、堿或尿素等，且僅通過加熱的方法進行脫膠。這些方法成本高、有污水排放、效率低、耗時長、耗能，而且屬于非標準化操作。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述存在的關鍵問題，提出一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，以彌補該不足。本發(fā)明實現(xiàn)了蠶絲脫膠工藝中物理和化學作用的有機融合、多場疊加，包括機械力、熱能、化學能、紅外線、超聲波等，從而實現(xiàn)了零添加，綠色環(huán)保、節(jié)能高效。而且，該工藝容易實現(xiàn)自動化、標準化，大大縮短了工藝流程時間，可精準調控再生絲素蛋白分子量及分布，特別適用于批量生產再生絲素蛋白且對再生絲素蛋白的分子量及其分布有嚴格要求的情形。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，其特征在于，包括：

第1步：脫膠：將繭絲或廠絲和蒸餾水按照1g∶50-150ml蒸餾水的比例投入絲素蛋白脫膠裝備中在超聲條件下進行脫膠，脫膠溫度控制在60-90℃，超聲波頻率范圍控制在20-100khz，超聲波功率范圍控制在300-1800w，脫膠時間為30-90min，將脫膠后的絲素纖維進行干燥；

第2步：溶解：將脫膠且干燥后的絲素纖維按照1g∶5-15ml溶劑的比例進行攪拌溶解，溶解溫度25-85℃，溶解時間30-60min；

第3步：透析：用150-250目濾網(wǎng)對溶解后的絲素蛋白溶液進行過濾，再灌裝到透析袋中，溶液體積占透析袋容積的1/2-1/4，將透析袋置入再生絲素蛋白透析裝置，室溫下先用自來水透析6-18h，再用蒸餾水透析6-18h；

第4步：干燥：透析后的絲素蛋白溶液冷凍干燥，得到再生絲素蛋白；

第5步：將再生絲素蛋白包裝和滅菌。

優(yōu)選地，所述第1步中的繭絲，在投入之前剪成寬1cm的條帶。

優(yōu)選地，所述第1步中的絲素蛋白脫膠裝備為絲素蛋白纖維規(guī)?；a的全自動脫膠裝備。

優(yōu)選地，所述第1步中的干燥為將脫膠后的絲素纖維放入80℃的電熱鼓風干燥箱中1.5h進行干燥。

優(yōu)選地，所述第2步中的溶劑為cacl2∶c2h5oh∶h2o摩爾比為1∶2∶8的混合溶液或5m的libr溶液。

優(yōu)選地，所述第2步中采用超聲波輔助溶解。

更優(yōu)選地，所述第2步中的超聲波頻率范圍控制在20-50khz，超聲波功率范圍控制在300-800w。

優(yōu)選地，所述第3步中的透析袋的截留分子量范圍為8-12kda。

優(yōu)選地，所述第4步中的冷凍干燥為將透析后的絲素蛋白溶液裝入大口徑容器中，在-80℃冷凍8h，在-60℃冷凍干燥器中干燥8h，得到再生絲素蛋白。

優(yōu)選地，所述第4步所述的大口徑容器的材料為玻璃、塑料或金屬。

優(yōu)選地，所述第4步所述的大口徑容器的形狀為帶蓋子的立方體。

優(yōu)選地，所述第4步所述的大口徑容器的高度為0.8-2.5cm，長度為40-50cm，寬度為25-35cm。

優(yōu)選地，所述的第5步中的包裝和滅菌為將再生絲素蛋白真空密封、避光包裝，以γ-射線滅菌后-20℃保存。

優(yōu)選地，如第5步所述的γ-射線，其劑量為(1.5-5)×10⁴gy。

本發(fā)明制備再生絲素蛋白共包括脫膠、溶解、透析、干燥和包裝滅菌五個關鍵步驟，而且這些步驟都是環(huán)環(huán)相扣、層層推進的關系。脫膠的目的在于去除蠶絲表面的絲膠，溶解的目的是將固態(tài)的絲素纖維變?yōu)橐簯B(tài)的溶液，透析的目的是將溶解過程中摻入的離子去除，干燥的目的是去除水分，包裝滅菌的目的是殺滅絲素蛋白中的微生物，保持蛋白質不會變質或延長存貯期。由此可見，五個步驟對于制備純度高、質量穩(wěn)定的再生絲素蛋白都是缺一不可的。

本發(fā)明的目的在于提出一種完整的、分子量可控、純度高、質量穩(wěn)定、存貯期長、綠色無污染、標準化、規(guī)?；脑偕z素蛋白生產工藝，該工藝包含了五個關鍵步驟的所有步驟。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明所述的生產方法，是一種家蠶再生絲素蛋白標準化、規(guī)?；a方法。

2、本發(fā)明所述的生產方法，可對家蠶再生絲素蛋白的分子量及分布進行有效控制。

3、本發(fā)明所述的生產方法，極大地降低了化學試劑的使用，綠色環(huán)保，節(jié)能高效。

4、本發(fā)明所述的生產方法，流程短、耗時少，自動化程度高，人力成本極低。家蠶再生絲素蛋白的制備效率得到了成倍的提高。

5、運用本發(fā)明所述生產方法制備的家蠶再生絲素蛋白，質量穩(wěn)定，無菌，耐貯運。

6、脫膠過程零添加。本發(fā)明在脫膠過程中不使用添加劑。這是一個質的改變，綠色環(huán)保。不使用添加劑的脫膠效果雖然不及使用添加劑時那么徹底，但是結合后面的溶解和透析步驟，完全可以彌補該不足。因為絲膠蛋白是水溶性的。

7、繭絲的精確處理。經過長期試驗探索，繭絲脫膠前，將繭剪為1cm的帶狀，可大大提高脫膠效率、去除絲膠而不破壞絲素蛋白纖維。

8、溶劑使用量減半?？梢姷奈墨I報道中，溶解絲素蛋白纖維使用的libr溶液濃度高達9.3m，而本發(fā)明所用libr溶液濃度低至5m。原因在于與脫膠步驟的有機結合，有超聲波輔助作用。這既實現(xiàn)了絲素蛋白纖維的良好溶解，又大大降低了溶劑使用量，綠色環(huán)保。

9、溶解參數(shù)精確控制。本發(fā)明所述的兩套溶解參數(shù)精確地調控了再生絲素蛋白的分子量，高分子量的再生絲素蛋白和低分子量的再生絲素蛋白(圖2)。可見的文獻報道中，未見對分子量及分布進行精確調控。

10、高效透析。精確的灌裝體積對提高透析效率、縮短透析時間至關重要，本發(fā)明所述的透析方法及參數(shù)，可用較短的時間達到最佳的透析效果。這對于工業(yè)生產非常重要。

11、快速干燥。凍干步驟是整個工藝過程中的限速步驟。本發(fā)明提出的大口徑容器凍干法旨在擴大溶液與冷空氣的接觸面積，提高凍干效率，縮短凍干時間。冷凍、干燥分步進行，大大提高了工業(yè)生產的效率。

12、長存貯期。包裝和滅菌是非常關鍵的環(huán)節(jié)，然而常被忽略，文獻中少有報道。再生絲素蛋白的真空包裝隔絕了蛋白與氧氣與水蒸氣的接觸，防止了蛋白質氧化、降解，保證了質量穩(wěn)定和長的存貯期。劑量為(1.5-5)×104gy的γ-射線滅菌既不會破壞絲素蛋白的分子量，也達到了徹底滅菌的效果。劑量太小，會導致滅菌不充分。劑量太大，則會導致蛋白質分子鏈會被打斷。充分滅菌也是延長存貯期的有力保障。

13、節(jié)約時間，提高效率?？傮w而言，本發(fā)明所述的包括完整五個步驟的再生絲素蛋白制備方法，將常規(guī)制備時間壓縮至50％左右，大大提高了工作效率。蛋白質質量更加穩(wěn)定、存貯時間更長，更容易精確調控分子量。更適用于工業(yè)化生產。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法示意圖；

圖2為生產高分子量和低分子量家蠶再生絲素蛋白的工藝流程圖；

圖3為運用本發(fā)明所述的生產方法制備的不同分子量及分布的家蠶再生絲素蛋白電泳圖；圖3中m為蛋白質標準品，i區(qū)為高分子量家蠶再生絲素蛋白，ii區(qū)為低分子量家蠶再生絲素蛋白。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

本發(fā)明各實施例中所述的絲素蛋白纖維規(guī)?；a的全自動脫膠裝備采用申請?zhí)枮?01610912652.1、名稱為《絲素蛋白纖維規(guī)模化生產的全自動脫膠裝備及其使用方法》的中國專利中實施例1的絲素蛋白纖維規(guī)?；a的全自動脫膠裝備。

本發(fā)明各實施例中所述的再生絲素蛋白專用透析裝置采用申請?zhí)枮?01611061196.0、名稱為《再生絲素蛋白實驗室專用透析裝置及其使用方法》的中國專利中實施例1的再生絲素蛋白實驗室專用透析裝置。

本發(fā)明各實施例中所述的透析袋的截留分子量范圍為8-12kda。

實施例1

本發(fā)明提出了一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，實現(xiàn)了脫膠過程零添加、綠色環(huán)保、節(jié)能高效，實現(xiàn)了再生絲素蛋白的標準化制備，通過參數(shù)調節(jié)控制了再生絲素蛋白的分子量及分布。特別適用于批量生產再生絲素蛋白且對再生絲素蛋白的分子量及其分布有嚴格要求的情形。

如圖1和圖2所示，一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，具體步驟為：

第1步：脫膠：將繭絲剪成寬1cm的條帶，將繭絲和蒸餾水按照1g∶100ml蒸餾水的比例投入絲素蛋白纖維規(guī)?；a的全自動脫膠裝備中，脫膠溫度控制在60℃，超聲波頻率范圍控制在20khz，超聲波功率范圍控制在300w，脫膠時間為90min。脫膠后的絲素纖維放入80℃的電熱鼓風干燥箱中1.5h進行干燥。

第2步：溶解。將脫膠且干燥后的絲素纖維按照1g∶10ml5mlibr溶液的比例進行溶解，置于磁力攪拌器上攪拌，并采用頻率為20khz，功率為300w的超聲波輔助溶解，溶解溫度25℃，溶解時間60min。

第3步：透析。用200目不銹鋼濾網(wǎng)對溶解后的絲素蛋白溶液進行過濾，再灌裝到透析袋中，溶液體積占透析袋容積的1/3。將透析袋(截留分子量為12kda)置入再生絲素蛋白專用透析裝置，室溫下自來水透析12h，蒸餾水透析12h。

第4步：干燥。透析后的絲素蛋白溶液裝入大口徑容器(塑料材質的帶蓋子的立方體，高度為0.8cm，長度為40cm，寬度為25cm)中，-80℃冷凍8h，在-60℃冷凍干燥器中干燥8h，得到再生絲素蛋白。

第5步：包裝和滅菌。將再生絲素蛋白真空密封、避光包裝，以γ-射線滅菌后-20℃保存，γ-射線劑量為(1.5-5)×10⁴gy。

如圖3所示，采用常規(guī)sds-page法測量再生絲素蛋白分子量及其分布，得到的再生絲素蛋白分子量分布范圍主要在460kda-208kda之間，屬于高分子量再生絲素蛋白(i區(qū))。

該工藝實現(xiàn)了家蠶再生絲素蛋白標準化、規(guī)模化生產，對家蠶再生絲素蛋白的分子量及分布進行了有效控制，極大地降低了化學試劑的使用，綠色環(huán)保，節(jié)能高效。流程短、耗時少，自動化程度高，人力成本極低。所制備的家蠶再生絲素蛋白，質量穩(wěn)定，無菌，耐貯運。

實施例2

本發(fā)明提出了一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，實現(xiàn)了脫膠過程零添加、綠色環(huán)保、節(jié)能高效，實現(xiàn)了再生絲素蛋白的標準化制備，通過參數(shù)調節(jié)控制了再生絲素蛋白的分子量及分布。特別適用于批量生產再生絲素蛋白且對再生絲素蛋白的分子量及其分布有嚴格要求的情形。

如圖1和圖2所示，一種分子量可控的家蠶再生絲素蛋白綠色快速標準化生產方法，具體步驟為：

第1步：脫膠。將廠絲按照1g∶100ml蒸餾水的比例投入絲素蛋白纖維規(guī)?；a的全自動脫膠裝備中，脫膠溫度控制在90℃，超聲波頻率范圍控制在100khz，超聲波功率范圍控制在1800w，脫膠時間為30min。脫膠后的絲素纖維放入80℃的電熱鼓風干燥箱中1.5h進行干燥。

第2步：溶解。將脫膠且干燥后的絲素纖維按照1g∶10mlcacl2∶c2h5oh∶h2o摩爾比為1∶2∶8的混合溶液的比例進行溶解，置于磁力攪拌器上攪拌，并采用頻率為50khz，功率為800w的超聲波輔助溶解，溶解溫度85℃，溶解時間30min。

第3步：透析。用200目不銹鋼濾網(wǎng)對溶解后的絲素蛋白溶液進行過濾，再灌裝到透析袋中，溶液體積占透析袋容積的1/3。將透析袋(截留分子量為8kda)置入再生絲素蛋白專用透析裝置，室溫下自來水透析12h，蒸餾水透析12h。

第4步：干燥。透析后的絲素蛋白溶液裝入大口徑容器(塑料材質的帶蓋子的立方體，高度為2.5cm，長度為50cm，寬度為35cm)中，-80℃冷凍8h，在-60℃冷凍干燥器中干燥8h，得到再生絲素蛋白。

第5步：包裝和滅菌。將再生絲素蛋白真空密封、避光包裝，以γ-射線滅菌后-20℃保存，γ-射線劑量為(1.5-5)×10⁴gy。

如圖3所示，采用常規(guī)sds-page法測量再生絲素蛋白分子量及其分布，得到的再生絲素蛋白分子量分布范圍主要在50kda-31kda之間，屬于低分子量的再生絲素蛋白(ii區(qū))。

該工藝實現(xiàn)了家蠶再生絲素蛋白標準化、規(guī)?；a，對家蠶再生絲素蛋白的分子量及分布進行了有效控制，極大地降低了化學試劑的使用，綠色環(huán)保，節(jié)能高效。流程短、耗時少，自動化程度高，人力成本極低。所制備的家蠶再生絲素蛋白，質量穩(wěn)定，無菌，耐貯運。