本發(fā)明涉及食品加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測馬鈴薯主食粉或馬鈴薯主食中馬鈴薯粉含量的方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯是世界上僅次于小麥、水稻、玉米的第四大糧食作物。我國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，2014年全國馬鈴薯產(chǎn)量約為9613萬噸(FAO，2014)，居世界首位。馬鈴薯熱量低，營養(yǎng)全面，被稱為“十全十美的食物”。然而，馬鈴薯在我國主要作為鮮食菜用、淀粉加工、飼料原料等，人均消費(fèi)量偏低，發(fā)展參差不齊，難以實(shí)現(xiàn)跨越式發(fā)展。此外，長期以來以米制、面制為主的精細(xì)的飲食結(jié)構(gòu)使我國居民高血糖、高血脂、高血壓、超重、肥胖等“現(xiàn)代文明病”的發(fā)病幾率大大增加。但是，與小麥、大米等主食相比，馬鈴薯主食熱量低，脂肪少，且富含蛋白質(zhì)、氨基酸、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等，可有效地促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，預(yù)防血管中脂肪沉積、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等。

2015年1月，農(nóng)業(yè)部宣布實(shí)施馬鈴薯主食化戰(zhàn)略。2016年，中央一號文件明確提出“積極推進(jìn)馬鈴薯主食開發(fā)”，將馬鈴薯與我國傳統(tǒng)主食如饅頭、面條、面包等相結(jié)合，與菜用和零食消費(fèi)相比，“馬鈴薯主食化”更符合我國居民的消費(fèi)習(xí)慣，此舉不僅可以提高馬鈴薯在我國居民飲食中的比例、推進(jìn)馬鈴薯主食化的發(fā)展速度，而且對突破馬鈴薯發(fā)展瓶頸、延長馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)鏈、改善居民營養(yǎng)膳食結(jié)構(gòu)等具有十分重要的意義。

然而，隨著馬鈴薯主食推進(jìn)速度的加快，消費(fèi)者對馬鈴薯主食接受程度的提高，馬鈴薯主食專用粉及馬鈴薯主食的摻假也引起人們的廣泛關(guān)注。目前，有關(guān)鑒定馬鈴薯主食專用粉及馬鈴薯主食真假的研究報(bào)道尚屬空白。因此，采用一定的方法檢測馬鈴薯主食專用粉以及相關(guān)主食產(chǎn)品，如饅頭、面包、面條等主食中是否添加馬鈴薯粉，以及添加馬鈴薯粉的比例，不僅可以鑒別馬鈴薯主食專用粉及馬鈴薯主食的真假，而且可以防止不法商販虛假宣傳、維護(hù)良好的市場秩序和消費(fèi)者利益，從而推動(dòng)馬鈴薯主食化的健康發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測馬鈴薯主食粉或馬鈴薯主食中馬鈴薯粉含量的方法，包括如下步驟：

(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

(1)將小麥粉和馬鈴薯粉按照(0-10)：(10-0)的重量比例混合，得若干馬鈴薯主食粉樣品，備用；以所述馬鈴薯主食粉為原料，將其制作成若干個(gè)馬鈴薯主食樣品，備用；

(2)取所述馬鈴薯主食粉樣品和馬鈴薯主食樣品，分別加入中性緩沖溶液，使蛋白溶出，取含有蛋白的溶液，得不同濃度梯度的主食粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和主食標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(3)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別對所述主食粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和主食標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，對所得電泳圖中的馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量分析，以小麥粉和馬鈴薯粉的混合比例為橫坐標(biāo)，馬鈴薯糖蛋白量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別得馬鈴薯主食粉回歸方程和馬鈴薯主食回歸方程；

(二)檢測待測樣品中馬鈴薯粉的添加量

取待測樣品，按照步驟(2)和(3)的操作對所述待測樣品進(jìn)行處理，得到所述待測樣品中馬鈴薯糖蛋白的含量，依據(jù)回歸方程，計(jì)算得到待測樣品中馬鈴薯粉的添加量。

優(yōu)選地，小麥粉和馬鈴薯粉的重量比例分別為10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，0:10。

本發(fā)明所述的馬鈴薯主食包括但不局限于馬鈴薯饅頭、馬鈴薯面包、馬鈴薯面條中的一種。它們可采用本領(lǐng)域公知的方法制備得到。

本發(fā)明提供了一種馬鈴薯饅頭的制備方法：將馬鈴薯粉與小麥粉按照上述比例混合均勻后，加入0.4％的糖、1％的羧丙基甲基纖維素(HPMC)、0.5％的谷朊粉、1％的蛋白(如乳清蛋白，大米蛋白，大豆蛋白，蛋清蛋白等)、0.5％的酵母，加入65％-75％的水，攪拌均勻后，揉制成面團(tuán)，經(jīng)壓片、成型、整型后，置于35-38℃、相對濕度為70％-80％的發(fā)酵箱中醒發(fā)1-1.5h，沸水蒸制30min，即得。

優(yōu)選地，步驟(2)的操作為：按照1g：(5-10)mL的固液比，分別將馬鈴薯主食粉樣品、馬鈴薯主食樣品與中性緩沖溶液混合，超聲提取，離心所得提取液，取上清液，即得。

進(jìn)一步優(yōu)選地，在將馬鈴薯主食樣品與中性緩沖溶液混合前，先對所述馬鈴薯主食樣品進(jìn)行冷凍干燥。

冷凍干燥能夠使馬鈴薯主食樣品中的水分直接由冰升華為蒸汽，從而得到干燥的并可保持原狀的馬鈴薯主食樣品，有助于保護(hù)馬鈴薯主食樣品中原有的化學(xué)組成和多孔結(jié)構(gòu)、膠體性質(zhì)等。重要的是，冷凍干燥處理不會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，有助于定量的精準(zhǔn)度。同時(shí)，冷凍干燥后的馬鈴薯主食樣品呈海綿狀的疏松多孔結(jié)構(gòu)，加入中性緩沖液后可迅速溶解，能夠進(jìn)一步確保測定結(jié)果的精準(zhǔn)度。

在具體的實(shí)施方式中，冷凍干燥的條件可為將馬鈴薯主食樣品在-30℃～-50℃(優(yōu)選-40℃)條件下進(jìn)行預(yù)冷凍，使其中的水凍結(jié)為冰的狀態(tài)，然后，置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行水分的升華，此階段的條件為：溫度-50℃～-70℃(優(yōu)選-60℃)，時(shí)間48-52h。此種條件下，具有最佳的冷凍干燥效果。

樣品中蛋白的溶出程度是影響檢測精準(zhǔn)度的關(guān)鍵，不同的蛋白提取液對蛋白的溶出程度有較大影響，發(fā)明人對蛋白提取液進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)以水提取時(shí)，蛋白溶解量低、提取時(shí)間較長；以NaCl提取液提取時(shí)，提取得到的樣品含鹽量高，電泳條帶易發(fā)生擴(kuò)散；以中性緩沖溶液(如磷酸鹽緩沖溶液)提取時(shí)，蛋白溶解性好，提取時(shí)間短，具有良好的提取效率，電泳效果較佳。進(jìn)一步地，在磷酸鹽緩沖溶液中加入NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸中的至少一種作為添加劑時(shí)，提取效率更好，電泳效果更佳。

因此，本發(fā)明優(yōu)選的蛋白提取液為磷酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽-NaCl緩沖溶液、磷酸鹽-NaCl-KCl緩沖溶液、磷酸鹽-NaCl-KCl-SDS緩沖溶液、Tris-HCl-蔗糖-SDS-甘氨酸緩沖溶液中的一種，最優(yōu)選為磷酸鹽-NaCl-KCl-SDS緩沖溶液。其中，“磷酸鹽-NaCl緩沖溶液”代表的含有為磷酸鹽緩沖溶液中添加有NaCl。其他提取液的理解與之相同。

NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸的添加量為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明優(yōu)選地，NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸在各緩沖溶液中的添加量各自獨(dú)立地為：NaCl為0.5％-1.0％(w/v)，KCl為0.01％-0.05％(w/v)，SDS為0.8％-2％(w/v)，蔗糖為15％-20％(w/v)，甘氨酸為1.2％-1.8％(w/v)。

其中，所述“w/v”指的是質(zhì)量體積比，如1％(w/v)NaCl指的是每100mL磷酸鹽緩沖溶液中添加有1mg NaCl。

具體而言，所述中性緩沖溶液選自磷酸鹽-(0.5％-1.0％)NaCl緩沖溶液、磷酸鹽-(0.5％-1.0％)NaCl-(0.01％-0.05％)KCl緩沖溶液、磷酸鹽-(0.5％-1.0％)NaCl-(0.01％-0.05％)KCl-(0.8％-2％)SDS緩沖溶液、Tris-HCl-(15％-20％)蔗糖-(0.8％-2％)SDS-(1.2％-1.8％)甘氨酸緩沖溶液。

優(yōu)選地，所述中性緩沖溶液的pH值為6.5-7.4。進(jìn)一步優(yōu)選為7.0-7.4，最優(yōu)選為7.4。

作為本發(fā)明最佳的技術(shù)方案，采用pH值為7.4的磷酸鹽-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS緩沖溶液對樣品處理時(shí)，蛋白提取最充分，電泳條帶最清晰，定量最準(zhǔn)確，具有最佳的檢測效果。

優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠濃度為10-15％；進(jìn)一步優(yōu)選為10-12.5％，最優(yōu)為12.5％。

優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠濃度為4-5％。

發(fā)明人對恒流、恒壓、變壓等電泳條件進(jìn)行了試驗(yàn)，針對本發(fā)明的測定對象，當(dāng)采用恒壓或恒流方式時(shí)，由于電流或電壓逐漸增大，易造成目的條帶不清楚、條帶不整齊或條帶顏色較淺，不利于后期對馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量。變壓方式能夠較好地克服上述缺陷，且經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，先高壓再低壓電泳條件下，如先用120V，再用80V電泳時(shí)，則蛋白樣品不能很好地在濃縮膠中聚集，易造成目的條帶擴(kuò)散；而先低壓再高壓能夠很好克服上述缺陷，特別地，先用70-90V電壓電泳5-15min，再用110-130V電壓電泳0.8-1.2h，能夠使蛋白樣品很好地在上層濃縮膠中聚集，也可以在下層分離膠中逐漸被分離成不同分子量的條帶，具有目的條帶不彌散、不模糊、帶型整齊、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明優(yōu)選的電泳條件為先用70-90V電壓電泳5-15min，再用110-130V電壓電泳0.8-1.2h。進(jìn)一步優(yōu)選的電泳條件為先用80V電壓電泳10min，再用120V電壓電泳1h。

優(yōu)選地，采用如下方法制備上樣樣品：向所述主食粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和主食標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入上樣緩沖溶液，沸水浴加熱處理1-10min，離心，取上清液，即得。

其中，所述上樣緩沖溶液為還原型或非還原型上樣緩沖溶液，本發(fā)明優(yōu)選還原型上樣緩沖液。還原型上樣緩沖溶液中的巰基乙醇能夠破壞蛋白分子間的二硫鍵，有助于蛋白和SDS的結(jié)合；此外，加熱也可使蛋白樣品發(fā)生變性，從而促進(jìn)蛋白與SDS的充分結(jié)合，與直接上樣相比，此種上樣方式得到的電泳條帶更加清晰、干擾條帶更少、定量準(zhǔn)確度更高、相關(guān)性更好。

優(yōu)選地，電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)對電泳后的凝膠進(jìn)行染色。具體染色方法可為：將凝膠置于容器中，加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液，震蕩染色2-4h后，棄去染色液；加入脫色液，震蕩脫色1-3h，脫色期間更換脫色液3-4次。

作為本發(fā)明最佳的技術(shù)方案，包括如下步驟：

(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

(1)將小麥粉和馬鈴薯粉按照(0-10)：(10-0)的重量比例混合，得若干馬鈴薯主食粉樣品，備用；以所述馬鈴薯主食粉為原料，將其制作成若干個(gè)馬鈴薯主食樣品，備用；

(2)取所述馬鈴薯主食粉樣品和馬鈴薯主食樣品，分別加入pH值為6.5-7.4的中性緩沖溶液，超聲，離心，取上清液，得不同濃度梯度的主食粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和主食標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(3)向所述主食粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和主食標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入上樣緩沖溶液，采用10-12.5％的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，先用70-90V電壓電泳5-15min，轉(zhuǎn)用110-130V電壓電泳0.8-1.2h；對所得電泳圖中的馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量分析，以小麥粉和馬鈴薯粉的混合比例為橫坐標(biāo)，馬鈴薯糖蛋白量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別得馬鈴薯主食粉回歸方程和馬鈴薯主食回歸方程；

(二)檢測待測樣品中馬鈴薯粉添加量

取待測樣品，按照步驟(2)和(3)的操作對所述待測樣品進(jìn)行處理，當(dāng)所述待測樣品為馬鈴薯主食粉時(shí)，依據(jù)馬鈴薯主食粉回歸方程，計(jì)算得到待測樣品中馬鈴薯粉的添加量；當(dāng)所述待測樣品為馬鈴薯主食時(shí)，依據(jù)馬鈴薯主食回歸方程，計(jì)算得到待測樣品中馬鈴薯粉的添加量。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中含有的馬鈴薯糖蛋白(Patatin)與馬鈴薯粉在主食粉和主食中的添加量呈線性關(guān)系，且得到的回歸方程的R²在0.97-0.99之間，說明本發(fā)明的方法可通過Patatin的含量對主食粉或主食中的馬鈴薯粉進(jìn)行定性和定量分析。

其中，本發(fā)明對所得電泳圖中的馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量分析可采用Image J軟件進(jìn)行。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明涉及到的原料和試劑均可市購獲得。

本發(fā)明取得了如下積極效果：本發(fā)明不僅可以快速檢測出馬鈴薯主食專用粉及馬鈴薯主食中是否添加馬鈴薯粉，而且可以計(jì)算出馬鈴薯粉的具體添加量；本發(fā)明只需要離心機(jī)、電泳儀等裝置，操作簡單，可以廣泛推廣；本發(fā)明所得結(jié)果清晰可見，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中馬鈴薯主食專用粉中Patatin的含量；

圖2為實(shí)施例2中馬鈴薯饅頭中Patatin的含量。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中涉及的操作如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。

實(shí)施例1 檢測馬鈴薯主食專用粉中馬鈴薯粉的添加量

包括如下步驟：

(1)配制混合粉：按照小麥粉與馬鈴薯粉的重量比例分別為10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，0:10配制混合粉，備用；

(2)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：將步驟(1)的7個(gè)混合粉分別與pH 7.4的磷酸鹽-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS緩沖溶液以1:8(固液比)混合搖勻后，超聲波輔助提取80min，將所得提取液置于高速離心機(jī)中，10000-12000g離心10-15min，棄去沉淀，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或凍干后，用pH 7.4的磷酸鹽-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS緩沖溶液復(fù)溶，即得；

(3)制備上樣溶液：向步驟(2)得到的溶液中加入還原型上樣緩沖溶液，沸水浴加熱處理5min，離心，取上清液，即得；

(4)電泳：采用12.5％的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(濃縮膠濃度5％)，先用80V電壓電泳10min，轉(zhuǎn)用120V電壓電泳1h；

(5)染色及脫色：凝膠置于保鮮盒中，加入50mL考馬斯亮藍(lán)R250染色液，震蕩染色3h后，棄去染色液；加入50mL脫色液，震蕩脫色2h，脫色期間需更換脫色液3-4次。

(6)定量分析：采用Image J軟件對所得電泳圖中的馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量分析，以小麥粉和馬鈴薯粉的重量比例為橫坐標(biāo)，馬鈴薯糖蛋白量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為y＝0.19x+0.59，R²＝0.97(如圖1所示)。

(7)待測樣品檢測：自制馬鈴薯粉與小麥粉重量比為11:9的馬鈴薯主食專用粉(待測樣品)；采用與步驟(2)-(6)相同的方法，僅將混合粉替換為所述待測樣品，并將得到的Patatin數(shù)值帶入回歸方程，得馬鈴薯粉的添加量為54.56％。

實(shí)施例2 檢測馬鈴薯主食專用粉中馬鈴薯粉的添加量

(1)配制混合粉：按照小麥粉與馬鈴薯粉的重量比例分別為10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，0:10配制混合粉，備用；

(2)制備馬鈴薯饅頭：取上述7種混合粉，分別向其中加入0.4％的糖、1％的羧丙基甲基纖維素(HPMC)、0.5％的谷朊粉、1％的大豆蛋白、65％-75％的水，倒入和面機(jī)中，將0.5％的酵母用水溶解混勻后，也倒入和面機(jī)內(nèi)，在120rpm下攪拌10min，于室溫下放置10min，形成生面團(tuán)；將生面團(tuán)壓成5mm的薄面片，并將薄面片反復(fù)折疊輥壓8次，使面片厚薄均勻、形態(tài)平整、質(zhì)地細(xì)膩；將面片切割成150g左右的面團(tuán)，揉捏成橢圓形；將橢圓形的面團(tuán)放入37℃、相對濕度為80％的發(fā)酵箱中醒發(fā)1h；醒發(fā)后的面團(tuán)用沸水蒸制30min，即得7種馬鈴薯饅頭。

(3)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：各取7種馬鈴薯饅頭樣品，冷凍干燥后，分別與pH 7.4的磷酸鹽-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS緩沖溶液以1:8(固液比)比例混合搖勻后，超聲波輔助提取80min，將所得提取液置于高速離心機(jī)中，于10000-12000g離心10-15min，棄去沉淀，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或凍干后，用pH 7.4的磷酸鹽-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS緩沖溶液復(fù)溶，即得；

(4)制備上樣溶液：向步驟(3)得到的溶液中加入還原型上樣緩沖溶液，沸水浴加熱處理5min，離心，取上清液，即得；

(5)電泳：采用12.5％的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(濃縮膠濃度5％)，先用80V電壓電泳10min，轉(zhuǎn)用120V電壓電泳1h；

(6)染色及脫色：凝膠置于保鮮盒中，加入50mL考馬斯亮藍(lán)R250染色液，震蕩染色3h后，棄去染色液；加入50mL脫色液，震蕩脫色2h，脫色期間需更換脫色液3-4次。

(7)定量分析：采用Image J軟件對所得電泳圖中的馬鈴薯糖蛋白進(jìn)行定量分析，以小麥粉和馬鈴薯粉的重量比例為橫坐標(biāo)，馬鈴薯糖蛋白量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為y＝0.23x+0.67，R²＝0.99，如圖2所示。

(8)待測樣品檢測：采用與步驟(2)相同的方法，自制小麥粉和馬鈴薯粉的比例為11:9的馬鈴薯饅頭(待測樣品)，采用與步驟(3)-(7)相同的方法，對所述待測樣品進(jìn)行檢測，并將得到的Patatin數(shù)值帶入回歸方程，得馬鈴薯粉的添加量為55.23％。

實(shí)施例3 檢測市售產(chǎn)品中馬鈴薯粉的添加量

采用與實(shí)施例2相同的方法，對市售海樂達(dá)有限公司生產(chǎn)的兩種海達(dá)馬鈴薯饅頭(馬鈴薯粉添加量分別為30％和55％)進(jìn)行檢測，將Patatin的數(shù)值帶入回歸方程，得30％和55％馬鈴薯饅頭中馬鈴薯粉的添加量分別為30.79％和55.08％。

可以看出，采用本發(fā)明所述的方法，可實(shí)現(xiàn)對馬鈴薯主食專用粉和馬鈴薯主食中的馬鈴薯粉含量的定量檢測，具有定量準(zhǔn)確，操作簡便的優(yōu)勢。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，采用本領(lǐng)域常規(guī)的面包或面條制作方法，采用與上述實(shí)施例相同的蛋白提取方法，電泳條件，能夠?qū)崿F(xiàn)基本相同的定量效果。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。