本發(fā)明涉及藥材質(zhì)量檢測方法，具體涉及檢測三葉青葉中多種化學成分的RRLC-Q-TOF-MS方法。

背景技術(shù)：

三葉青是我國特有的珍稀藥用植物，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，以塊根或者全草入藥，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛的功效，其主要活性成分為有機酸類、黃酮類及揮發(fā)油類成分等。

已有報道針對三葉青的塊根進行了質(zhì)量評價，但對于三葉青另外重要的藥用部位——葉的質(zhì)量評價研究較少，三葉青葉也廣泛用于多種國藥準字中成藥和保健食品，如結(jié)石康膠囊、排石利膽膠囊、三葉青茶等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種檢測三葉青葉中多種化學成分的RRLC-Q-TOF-MS方法，包括以下步驟

a、對照品溶液的制備：

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對照品，加入甲醇，制備得到對照品溶液；

b、對照品溶液的檢測：

將對照品溶液注入快速液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀進行檢測；

色譜條件如下：

色譜柱：C₁₈色譜柱；

流動相：流動相A：乙腈-0.1％甲酸，流動相B為水；

梯度洗脫條件為：0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A；1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A；

質(zhì)譜條件如下：

離子源：電噴霧離子源；

檢測方式：正離子模式；

c、供試品溶液的制備：

取待測三葉青葉樣品，加甲醇超聲或回流提取，過濾得供試品溶液；

d、供試品溶液的檢測：

取供試品溶液，注入快速液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，以步驟b相同的條件進行檢測，即可同時定性或定量檢測出三葉青葉中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷和葒草素鼠李糖苷。

進一步地，所述色譜柱的規(guī)格為2.1mm×100mm，1.6μm。

進一步地，所述色譜柱為Waters CORTECS C₁₈色譜柱。

進一步地，所述色譜條件中，流動相的流速為0.25～0.4mL/min。

進一步地，所述色譜條件中，柱溫為30～45℃。

進一步地，所述色譜條件中，進樣量為1～5μL。

進一步地，所述質(zhì)譜條件中：毛細管電壓：3500V；噴霧器壓力：0.2Mpa；干燥氣體氮氣流速：4.0L·min^-1，干燥氣體氮氣溫度：180℃，離子漏斗funnel 1：200.0Vpp,funnel2：200.0Vpp，六級桿射頻：100.0Vpp，四級桿離子能量:3.0eV，碰撞射頻：150.0Vpp，離子傳輸時間：80μs，前脈沖存儲時間：5μs，碰撞氣體：氬氣，碰撞能量：20～30eV。

進一步地，所述所述步驟c的提取是超聲提取，超聲提取的溫度為50～80℃；超聲的時間15～45分鐘，優(yōu)選30分鐘。

進一步地，所述步驟c中，所述甲醇為80％甲醇，其與待測三葉青葉樣品的體積重量比為250mL：1g。

進一步地，所述三葉青葉為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥葉。

本發(fā)明的方法，可以通過RRLC-Q-TOF-MS法快速定性鑒定或定量檢測三葉青葉中主要黃酮成分，為三葉青葉的開發(fā)利用和質(zhì)量評價提供了可靠的實驗依據(jù)。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為三葉青的RRLC-Q-TOF-MS總離子流圖。

圖2為各化學成分的結(jié)構(gòu)。

圖3為不同色譜柱篩選的色譜圖，Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm2.1x100mm(1)，Waters ACQUITY UPLC HSS T3C18 1.8μm 2.1x100mm(2)，Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm(3)，Phenomenex Kinetex C18 1.7μm(4)。

圖4為不同流動相篩選的色譜圖，乙腈-0.1％甲酸水(5)，甲醇-0.1％甲酸水(6)，乙腈-0.5％醋酸水(7)，甲醇-0.5％醋酸水(8)。

圖5為提取方法篩選的結(jié)果。

圖6為提取溶劑篩選的結(jié)果。

圖7為提取時間篩選的結(jié)果。

圖8為料液比篩選的結(jié)果。

具體實施方式

實施例1

1儀器與試藥

1290型超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；MicrOTOF飛行時間質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型500克搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(德國MERCK公司)；Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

對照品牡荊苷(批號：111687-200602)購自中國食品藥品檢定研究院；其他對照品新綠原酸(批號：SH906332)、隱綠原酸(批號：SH905997)、綠原酸(批號：SH327979)購自北京賽百草科技有限公司；牡荊素鼠李糖苷、葒草苷、異葒草苷、異牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對照品由參照文獻(林婧,紀明妹,黃澤豪,等.三葉青的化學成分及其體外抗腫瘤活性研究[J].中國藥學雜志,2015,50(8):658)的方法制備。三葉青葉樣品采自福建省10個不同地方，分別為順昌、閩侯、南安、光澤、霞浦、福安、泰寧、寧化、建陽和仙游，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥用植物實驗室范世明高級實驗師及生藥教研室黃澤豪副教授鑒定為葡萄科植物三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥葉。樣本存放于福建中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物標本室。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Waters CORTECS C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm,1.6μm)，流動相乙腈(A)-(0.1％甲酸)水(B)，梯度洗脫(0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A)，流速0.25mL·min^-1，柱溫45℃，進樣量2μL。

2.2質(zhì)譜條件

飛行時間質(zhì)譜采用電噴霧正、負離子模式：毛細管電壓:4.5kV(-)和3.5kV(+)，毛細管電壓:4.5kV，噴霧器壓力：0.2Mpa，干燥氣體(N₂)流速：4.0L·min^-1，干燥氣體溫度：180℃，離子漏斗funnel 1：200.0Vpp,funnel 2：200.0Vpp，六級桿射頻(hexapole Rf)：100.0Vpp，四級桿離子能量:3.0eV，碰撞射頻(collision Rf)：150.0Vpp，離子傳輸時間：80μs，前脈沖存儲時間：5μs，碰撞氣體：氬氣，碰撞能量：20～30eV。質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)采用全掃描模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 50～1 000。

2.3對照品溶液的制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇分別制備濃度為約0.2mg·mL^-1的單一對照品儲備液，稀釋到10μg·mL^-1供QTOF-MS定性比較用。

2.4供試品制備

取三葉青干燥葉粉碎，過60目篩，取100mg，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率80kHz)30min，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失重，搖勻，0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5三葉青葉中主要化學成分的鑒定

三葉青樣品在“2.1”色譜條件及“2.2”質(zhì)譜條件下分析得三葉青的RRLC-Q-TOF-MS總離子流圖，見圖1。

其化合物的鑒定方法：首先，根據(jù)總離子流色譜峰上所得到的精確化合物分子量信息，通過Compass DataAnalysis SmartFormula Manually軟件在5ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計算其精確分子式，對各化合物進行初步鑒定。其次，選擇合適分子離子峰進行碰撞誘導解離(CID)，通過二級質(zhì)譜的裂解，獲得化合物相應(yīng)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合質(zhì)譜相關(guān)文獻比對推測，共鑒定三葉青葉中11種成分，其中1，2和3，4與5，6與7，8與9，10與11均互為同分異構(gòu)體(見圖2)，不僅一級質(zhì)譜相似(分子式相同)，二級質(zhì)譜裂解碎片也較相似，為此為了進一步確認鑒定結(jié)果的準確性，通過相關(guān)標準品進行進一步的比對確認，最終通過與標品的色譜保留時間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的比對確認了三葉青主要的黃酮成分均為C-苷骨架型黃酮：8個黃酮由四對同分異構(gòu)體構(gòu)成，在負離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于正離子模式，其中，6個黃酮成分異葒草苷(4)、葒草苷(5)、葒草素鼠李糖苷(7)、異牡荊苷(9)、牡荊苷(8)、牡荊素鼠李糖苷(10)經(jīng)標品比對確認，而化合物6與葒草素鼠李糖苷質(zhì)譜一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜均相似，因此推斷為異葒草素鼠李糖苷，同樣化合物11與牡荊素鼠李糖苷的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜均相似，因此推斷為異牡荊素鼠李糖苷，另外1，2和3經(jīng)標品比對鑒定為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，鑒定結(jié)果見表1。

表1三葉青各化學成分的鑒定分析結(jié)果

并且，從圖1可以看出，正離子模式的效果優(yōu)于負離子模式。

實施例2本發(fā)明的工藝篩選

1、色譜條件的篩選

(1)色譜柱的篩選

比較了不同色譜柱，Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1x100mm(1),Waters ACQUITY UPLC HSS T3C18 1.8μm 2.1x100mm(2),Waters CORTECS C18 1.6μm2.1x100mm(3),Phenomenex Kinetex C18 1.7μm(4)。其他色譜條件如下：

流動相：乙腈(A)-0.1％甲酸(B)梯度洗脫，0-0.5min，5A ％-5％A；0.5-1.5min,5％A-9％A；1.5-8.5min,9％A-12％A；8.5-10min,12％A-20％A；10-13min 20％A-70％A。

結(jié)果如圖3所示，Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm峰容量多，分離度較好，優(yōu)選Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm色譜柱。

(2)流動相的篩選

比較了4種流動相系統(tǒng)：乙腈-0.1％甲酸水(5)，甲醇-0.1％甲酸水(6)，乙腈-0.5％醋酸水(7)，甲醇-0.5％醋酸水(8)。相對應(yīng)的梯度洗脫程序如下：

0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A(5)。

0～0.5min，7％A→7％A；0.5～1.5min，7％A→11％A，1.5～16min，11％A；16～17.5min，11％A→12％A；17.5～19min，12％A→35％A；19～22min，35％→80％A(6)。

0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A(7)。

0～0.5min，7％A→7％A；0.5～1.5min，7％A→11％A，1.5～16min，11％A；16～17.5min，11％A→12％A；17.5～19min，12％A→35％A；19～22min，35％→80％A(8)。

結(jié)果如圖4所示，使用乙腈-0.1％甲酸峰容量最佳，色譜分離度較好，優(yōu)于其他體系。

2、供試品制備方法的篩選

(1)提取方法的篩選

考察了超聲、回流、索氏、溫浸提取四種提取方法對11種酚類成分的影響，結(jié)果表明超聲和回流提取效果較佳，由于超聲提取制備樣品方便，因此選擇超聲提取。結(jié)果如下表2和圖5所示。

表2

(2)提取溶劑的篩選

考察不同提取溶劑(40％，60％，80％，100％甲醇)對三葉青提取率的影響，表明80％甲醇最佳。結(jié)果如下表3和圖6所示。

表3

(3)超聲提取時間的篩選

考察不同超聲提取時間(15，30，45，60min)，結(jié)果表明30、45min最佳，綜合來看，優(yōu)選30min。結(jié)果如下表4和圖7所示。

表4

(4)提取料液比的篩選

考察了不同提取料液比(1:50，1:100，1:250，1:500)，結(jié)果表明1:250，1:500較佳，因此選擇1:250作為提取料液比。結(jié)果如下表5和圖8所示。

表5

綜上所述，本發(fā)明的方法，可以通過RRLC-Q-TOF-MS法快速定性鑒定或定量檢測三葉青葉中主要黃酮成分，為三葉青葉的開發(fā)利用和質(zhì)量評價提供了可靠的實驗依據(jù)。