本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是一種多種霉菌毒素同時檢測方法。

背景技術(shù)：

霉菌毒素是由產(chǎn)毒霉菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，從古至今一直 對人類、動物和植物具有巨大的潛在威脅。1960年，英國發(fā)生了10萬多只火雞中毒死亡事件，研究發(fā)現(xiàn)，飼料中有從巴西進(jìn)口的霉變的花生餅粉，用這種花生餅粉喂養(yǎng)大白鼠能誘發(fā)肝癌，誘發(fā)肝癌的物質(zhì)被證實為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，命名為黃曲霉毒素（Aflatoxins）。隨后引發(fā)了科技界對霉菌毒素廣泛、系統(tǒng)的研究。霉菌毒素目前已發(fā)現(xiàn)有200多種，對人類危害大的霉菌毒素有十幾種，一般由青霉屬、曲霉屬以及鐮刀菌屬的霉菌產(chǎn)生，具有毒性強和污染頻率高的特點，其中包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素、T-2毒素、HT-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、二乙酸鑣草鐮刀菌烯醇等。

由于霉菌毒素的低濃度高危害性，目前全世界很多國家都對霉菌毒素規(guī)定了其在食品中的殘留限量。我國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB2761-2011）規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、展青霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇等6類霉菌毒素的限量，限量范圍從0.5ug/kg到1000ug/kg不等。

目前常用的針對食品中霉菌毒素殘留量的檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）、薄層色譜（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）以及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）等。酶聯(lián)免疫法原理是利用抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測；薄層色譜法是根據(jù)與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，進(jìn)行含量測定的方法，這兩者均為半定量方法，多用于一種或少數(shù)幾種毒素的初步篩查；高效液相色譜法是采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析，此法定量準(zhǔn)確，但對于同時檢測多組分的霉菌毒素，以及對樣品基質(zhì)凈化不完全時，目標(biāo)化合物在色譜柱上無法實現(xiàn)基線分離，無法對目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜是在色譜分離的基礎(chǔ)上，利用質(zhì)譜的高靈敏性和高選擇性對化合物進(jìn)行定性和定量檢測，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

隨著儀器檢測技術(shù)的發(fā)展，前處理凈化技術(shù)也在不斷更新，目前受到廣泛研究的集中在免疫親和（Immunoaffinity）、固相萃?。⊿olidPhaseExtraction）以及分散固相萃?。≦uEChERS）方法。免疫親和層析技術(shù)是以抗原抗體中的一方作為配基親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，用此技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理，專一性強，樣品凈化程度高，但目前研制出的免疫親和抗體種類較少，除少數(shù)幾種化合物（黃曲霉毒素類）無法對多組分化合物同時進(jìn)行凈化，且成本高，目前有免疫親和抗體的毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素等少數(shù)幾種毒素；固相萃取技術(shù)是基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進(jìn)行富集、分離、凈化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡單的色譜過程，此技術(shù)選擇性吸附和凈化程度不如免疫親和技術(shù)，可用于一種或幾種結(jié)構(gòu)相似毒素的同時凈化，但無法對復(fù)雜基質(zhì)中多種毒素進(jìn)行同時進(jìn)行吸附和凈化，常用于食品中伏馬霉素、黃曲霉毒素B1以及赭曲霉素A檢測的前處理。分散固相萃取方法（QuEChERS）是由英文快速（Quick）、簡便（Easy）、低廉（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）以及安全（Safe）的首字母縮寫，此技術(shù)由提取，鹽析、凈化、濃縮等及步驟組成，最先由美國科學(xué)家發(fā)明，用于多農(nóng)藥殘留的檢測，后擴大應(yīng)用于獸藥殘留以及生物毒素檢測的前處理。該方法的優(yōu)點正如所組成的縮寫詞一樣，靈活性強，可以進(jìn)行改進(jìn)后對不同結(jié)構(gòu)極性的多種毒素進(jìn)行同時提取和凈化。用現(xiàn)有技術(shù)方法無法全部檢測多種霉菌毒素，且目前尚未有同時檢測多種霉菌毒素的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多種霉菌毒素同時檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種多種霉菌毒素同時檢測方法，該方法包括以下步驟：（1）對樣品進(jìn)行提取，先后用含酸的不同濃度的乙腈-水溶液對樣品分三次進(jìn)行振蕩提取、離心，合并三次提取液，得樣品提取液；（2）對樣品提取液進(jìn)行鹽析、除脂，在所述樣品提取液中加入甲醇和0.2%氨水進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂；（3）對鹽析、除脂后的樣品進(jìn)行凈化、濃縮、復(fù)溶，將鹽析、除脂后的樣品離心，在所得的下層乙腈層加入100%甲醇旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，對所得上清液進(jìn)行真空濃縮后，先用甲醇對殘渣復(fù)溶，再用水對剩余的殘渣復(fù)溶，合并兩次復(fù)溶所得的復(fù)溶液，進(jìn)行濾膜過濾，得樣品分析液；（4）采用質(zhì)譜儀對樣品分析液進(jìn)行定性定量檢測。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：在所述步驟（3）之前還能夠?qū)}析、除脂后的樣品過固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：將對鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（2）中的鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能同時檢測多種霉菌毒素，完善了食品的安全監(jiān)控的手段，避免消費者的健康受到損害。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實施例中，一種多種霉菌毒素同時檢測方法，該方法包括以下步驟：（1）對樣品進(jìn)行提取，先后用含酸的不同濃度的乙腈-水溶液對樣品分三次進(jìn)行振蕩提取、離心，合并三次提取液，得樣品提取液；（2）對樣品提取液進(jìn)行鹽析、除脂，在所述樣品提取液中加入甲醇和0.2%氨水進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂；（3）對鹽析、除脂后的樣品進(jìn)行凈化、濃縮、復(fù)溶，將鹽析、除脂后的樣品離心，在所得的下層乙腈層加入100%甲醇旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，對所得上清液進(jìn)行真空濃縮后，先用甲醇對殘渣復(fù)溶，再用水對剩余的殘渣復(fù)溶，合并兩次復(fù)溶所得的復(fù)溶液，進(jìn)行濾膜過濾，得樣品分析液；（4）采用質(zhì)譜儀對樣品分析液進(jìn)行定性定量檢測。在所述步驟（3）之前還能夠?qū)}析、除脂后的樣品過固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。將對鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱。所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述步驟（2）中的鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。

實施例1

（1）稱量2.5g待測樣品，先用20ml含0.1%（體積比）甲酸的80%（體積比）的乙腈-水溶液對樣品進(jìn)行振蕩提取30min、離心，得提取液1，再對提取后的剩余物用5ml含0.1%（體積比）甲酸的20%（體積比）的乙腈-水溶液進(jìn)行振蕩提取30min、離心，得提取液2，合并所述提取液1和所述提取液2，得樣品提取液；（2）在所述樣品提取液中加入1.0g檸檬酸鈉、4.0g硫酸鎂、1.0g氨水、0.5g檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心后轉(zhuǎn)移上清液，向其中加入20mL正己烷，旋渦振蕩1min除去脂肪；（3）將鹽析、除脂后的樣品離心，轉(zhuǎn)移下層乙腈層至離心管中，加入150mg甲醇和50mg 0.2%氨水硫酸鎂后旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，用5mL乙腈洗滌，離心，合并所述凈化、所述洗滌兩次離心后的上清液，進(jìn)行真空濃縮；先用1.5mL甲醇復(fù)溶殘渣，再用大于等于1mL的水復(fù)溶殘渣，合并兩次復(fù)溶所得的復(fù)溶液，用0.22um濾膜進(jìn)行過濾后得樣品分析液；（4）利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測樣品分析液中的多種霉菌毒素。優(yōu)選所述步驟（4）的高效液相色譜條件為：流動相A為含0.1%甲酸的甲醇，流動相B為含0.1%甲酸的水，流動相A和流動相B的體積比為：70-20:30-80，梯度洗脫，或者流動相A為甲醇，流動相B為水，流動相A和流動相B的體積比為：90-10:10-90，梯度洗脫；色譜柱以十八烷基硅烷建和硅膠為填料。進(jìn)一步優(yōu)選所述步驟（4）的質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）進(jìn)行掃描后，利用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測。

還能夠?qū)}析、除脂后的樣品過固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。將對鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱。所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。

所述的流動相為含0.1%甲酸的甲醇和含0.1%甲酸的水時，所對應(yīng)的電離模式為正離子模式；流動相為甲醇和水時，所對應(yīng)的電離模式為負(fù)離子模式。在正離子模式下，樣品中可檢出的霉菌毒素包括：新茄病鐮刀菌烯醇(NEO)、黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）、伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）、二乙酰蔗草鐮刀菌烯醇(DAS)、雜色曲霉（ST）、HT2毒素（HT2）、膠霉毒素(GLT)、T2毒素（T2）、煙曲霉素(FUM)。

在負(fù)離子模式下，樣品中可檢出的霉菌毒素包括：疣孢漆斑菌原（VER）、赭曲霉素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（DON）、鐮刀菌烯酮（FUS-X）、去環(huán)氧-脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（DOM-1）、微囊藻毒素（PAX）、3-乙?；撗蹒牭堆└┐迹?-ADON）、15-乙?；撗蹒牭堆└┐迹?5-ADON）。

霉菌毒素采用多反應(yīng)監(jiān)控模式（MRM）對毒素進(jìn)行定性和定量。根據(jù)歐盟關(guān)于分析方法要求的法令2002/657/EU，采用液相色譜質(zhì)譜方法分析，必須達(dá)到4分的要求，本方法選擇1個母離子（2分），2個子離子（1分）對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，滿足了4分的要求。定量方式采用了基質(zhì)曲線定量，每條曲線由5個點構(gòu)成，線性相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.995，滿足了定量的要求。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。