本發(fā)明涉及甘蔗內(nèi)源激素檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：甘蔗（Saccharumofficinarum)是我國(guó)最重要糖料作物，蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)92%。甘蔗中含有的植物激素幾乎參與了其生長(zhǎng)發(fā)育所有過(guò)程的生理調(diào)節(jié)，從細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂和分化，到種子的休眠、果實(shí)發(fā)育、性別分化和衰老過(guò)程等。對(duì)于甘蔗而言，它有2個(gè)非常重要的指標(biāo)直接影響著甘蔗的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，分別糖分和產(chǎn)量，但如果甘蔗受到病蟲害影響而不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，則會(huì)大大影響甘蔗的糖分和產(chǎn)量。如果能夠通過(guò)研究甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)源激素的變化趨勢(shì)，判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異，并建立對(duì)應(yīng)病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制，那么將對(duì)甘蔗經(jīng)濟(jì)價(jià)值的增長(zhǎng)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前，我國(guó)甘蔗梢腐病的發(fā)生有逐漸加重的趨勢(shì)，由于梢腐病逐漸表現(xiàn)出無(wú)區(qū)域性和無(wú)規(guī)律性等特點(diǎn)，導(dǎo)致該病對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。在巴西、印度、伊朗、馬來(lái)西亞以及我國(guó)等蔗區(qū)各類梢腐病癥狀層出不窮，尤其在高溫高濕季節(jié)容易暴發(fā)此病。據(jù)2012-2014年廣西甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)以及2013-2014年國(guó)家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)調(diào)查，參試品種發(fā)病率達(dá)到100%。此病害可導(dǎo)致甘蔗株高顯著降低，產(chǎn)量減少5%～20%，糖分降低達(dá)3%。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)來(lái)保護(hù)自己，與此同時(shí)，病原真菌也會(huì)通過(guò)改變自身毒性或產(chǎn)生變異，由此影響甘蔗正常生理生化進(jìn)程，從而感染甘蔗并導(dǎo)致發(fā)病。因此，對(duì)感染梢腐病病原后的內(nèi)源激素變化趨勢(shì)研究是十分緊迫的問(wèn)題。水楊酸作為一種重要的植物內(nèi)源激素，其參與甘蔗生理代謝過(guò)程一個(gè)突出特點(diǎn)是促使蔗莖的伸長(zhǎng)和蔗株增高。而甘蔗是以蔗莖作為收獲產(chǎn)品的作物，因此在生產(chǎn)中增加蔗株高度對(duì)于提高甘蔗產(chǎn)量是相當(dāng)重要的。但至今尚無(wú)建立高效、精確的葉片水楊酸含量檢測(cè)方法，鑒于此建立一套快速有效的甘蔗葉片水楊酸含量檢測(cè)方法，對(duì)及時(shí)判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異和研究水楊酸內(nèi)源激素介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)我國(guó)甘蔗葉片水楊酸含量檢測(cè)方法的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下：一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測(cè)方法，包括以下步驟：S1.將待測(cè)的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液在2~5℃下浸提1~3h，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容，過(guò)濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中水楊酸的含量。進(jìn)一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：流動(dòng)相是甲醇和乙酸按體積比1:99混合制成，柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)306nm。進(jìn)一步的，所述步驟S6中，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速1ml/min，進(jìn)樣量10μL。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，所述待測(cè)的甘蔗葉片預(yù)先從甘蔗上置于冰盒上剪下。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫氖求w積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岬臏囟葹?℃。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)甘蔗葉片采用甲醇水溶液進(jìn)行浸提，液固比為0.2~0.5g/mL。進(jìn)一步的，所述步驟S5中，加入流動(dòng)相溶解后，采用帶有0.45μm微孔濾膜的針頭式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。本發(fā)明還提供了以上所述的檢測(cè)方法在判斷甘蔗品種對(duì)梢腐病感性和抗性差異方面的應(yīng)用。。本發(fā)明的有益效果是：1）樣品前處理方法采用甲醇浸提法提取水楊酸，并通石油醚萃取，結(jié)合微孔濾膜過(guò)濾，與其他方法相比，提取有效成分完全，除雜效果好，待測(cè)樣品純凈度高。2）通過(guò)本發(fā)明HPLC色譜條件測(cè)量樣品溶液中水楊酸的含量，水楊酸能與其他有效成分較好地進(jìn)行分離，且樣品保留時(shí)間穩(wěn)定，具有更好的峰形，重復(fù)性和準(zhǔn)確性好，在具備高效液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室均能通過(guò)此法開展水楊酸含量檢測(cè)工作。3）本發(fā)明尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中水楊酸含量的測(cè)定，通過(guò)上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，從而為判斷甘蔗品種對(duì)梢腐病感抗差異研究和水楊酸介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答生化機(jī)制提供科學(xué)有力的檢測(cè)技術(shù)；同時(shí)，本發(fā)明方法的推廣使用，對(duì)于篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種也具有重要意義和現(xiàn)實(shí)作用。附圖說(shuō)明圖1為水楊酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2a為標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖2b為樣品溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖3為不同生長(zhǎng)階段甘蔗接種樣品和甘蔗對(duì)照樣品中水楊酸含量的檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測(cè)方法S1.選取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗葉片作為待測(cè)樣品，取待測(cè)樣品2g加入液氮磨碎，加入10mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液，4℃浸提16h，8000r/min離心10min，取上清液，殘?jiān)偌尤?mL預(yù)冷至4℃體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液在4℃下浸提2h，離心后取出上清液，合并上清液，40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入15mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在40℃下減壓蒸干，加入0.5mLHPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容至2mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中水楊酸的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇和乙酸按體積比1:99混合制成；柱溫：35℃；走樣時(shí)間為20min；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2.稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品1.25mg，加入10mL水溶解，配置成125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液；然后用標(biāo)準(zhǔn)溶液母液再一次稀釋成濃度分別為25μg/mL、12.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，其對(duì)應(yīng)峰面積分別為5796.688、1090.4、532.551、53.174、25.604、9.717。然后以峰面積為縱坐標(biāo)、以水楊酸濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所述，由圖1可見，在所檢測(cè)范圍內(nèi)(0.25μg/mL～125μg/mL)，回歸方程式為y=46.469x-23.645，液相色譜峰面積與水楊酸濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9998)。S2-3.專屬性考察：分別取125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和樣品溶液注入液相色譜儀中，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，水楊酸的保留時(shí)間為20.77min，結(jié)果分別見圖2a和圖2b。S2-4.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：分別向同一樣品溶液中添加1mL的10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率。表1水楊酸回收率測(cè)定結(jié)果S2-5.方法精密度試驗(yàn)取濃度為1.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣5針觀察保留時(shí)間與峰面積，檢測(cè)結(jié)果見表2。表2方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)保留時(shí)間（min）峰面積（μvsec）120.77253.158220.78553.202320.77953.172420.76553.166520.72853.164標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0220.017相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1080.033S2-6.S1獲得的樣品溶液分析采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定三次，得樣品的中水楊酸的含量為3.224±0.031μg/g。由本實(shí)施例可以看出，本方法的靈敏度、檢出限和精密度能夠滿足甘蔗葉片中水楊酸含量的測(cè)定；尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中水楊酸含量的測(cè)定，通過(guò)上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。實(shí)施例2判斷甘蔗品種感染梢腐病后的感性和抗性差異研究。（1）接種體的制備：將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化3天，挑取PDA培養(yǎng)基邊緣菌絲接種在滅菌的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，離心、用滅菌的脫脂棉過(guò)濾、收集所獲得的菌體，用無(wú)菌水與菌體配制成濃度為1×106CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液。（2）接種材料的處理：選取甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37為接種材料，溫室條件下每個(gè)品種種植30桶，每桶4個(gè)芽，下種前用0.3%多菌靈浸種20min，出苗后正常管理，長(zhǎng)出5～6片完全葉時(shí)進(jìn)行接種。（3）注射接種：取長(zhǎng)勢(shì)相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，使用1ml醫(yī)用注射器分別將100μl甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液到甘蔗+1葉位，作為甘蔗接種樣品；再另外取長(zhǎng)勢(shì)相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，以注射無(wú)菌水為對(duì)照，作為甘蔗對(duì)照樣品；甘蔗接種結(jié)束后保持室內(nèi)溫度28-30℃，濕度80%。（4）樣品選取:選擇相同株齡+1葉位上相同位置有近似病癥的甘蔗葉片，在冰盒上將其剪成1cm×1cm的葉片進(jìn)行備樣。（5）檢測(cè)方法與結(jié)果S1.取各生長(zhǎng)階段（2、4、8、16d）的甘蔗接種樣品YT94-128、GT37和甘蔗對(duì)照樣品YT94-128、GT37葉片2g分別加入液氮磨碎，加入10mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液，4℃浸提16h，8000r/min離心10min，取上清液，殘?jiān)偌尤?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液在4℃下浸提2h，離心后取出上清液，合并上清液，40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入15mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在40℃下減壓蒸干，加入0.5mLHPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容至2mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)，作為研究樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中水楊酸的含量。S2-1色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇和乙酸按體積比1:99混合制成；柱溫：35℃；走樣時(shí)間為20min；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2取不同生長(zhǎng)階段（0、4、8、16d）的甘蔗接種樣品和甘蔗對(duì)照樣品制成的研究樣品溶液，進(jìn)行水楊酸含量的測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見表3。表3不同生長(zhǎng)階段甘蔗接種樣品中水楊酸的含量S2-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析水楊酸（SA）在植物受到活體營(yíng)養(yǎng)型病原侵染后，其合成急劇增加，這是激活植物對(duì)病原產(chǎn)生抗性反應(yīng)所必不可少的細(xì)胞信號(hào)響應(yīng)。經(jīng)接種鑒定，YT94-128對(duì)梢腐病表現(xiàn)出抗性，GT37對(duì)梢腐病表現(xiàn)出感性。由上述表3獲得的數(shù)據(jù)制得水楊酸含量的趨勢(shì)變化圖，其中，A為對(duì)照樣品YT94-128的水楊酸含量變化趨勢(shì)，B為對(duì)照樣品GT37的水楊酸含量變化趨勢(shì)，C為接種樣品YT94-128的水楊酸含量變化趨勢(shì)，D為接種樣品GT37的水楊酸含量變化趨勢(shì)，結(jié)合圖3所示，對(duì)照樣品中的水楊酸含量隨甘蔗生長(zhǎng)而逐漸上升，抗病品種YT94-128的水楊酸含量變化趨勢(shì)高于感病品種GT37；病原菌接種處理的甘蔗葉片中水楊酸含量表現(xiàn)出先上升后下降的規(guī)律，變化規(guī)律幾近一致，其含量差異并不顯著。本試驗(yàn)說(shuō)明，空白處理下，抗病品種YT94-128葉片合成水楊酸的速率要高于感病品種GT37；在接種病原菌后，感病品種GT37梢腐病病情指數(shù)不斷加重，其葉片合成水楊酸的能力并未受到顯著影響，可能是蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（針刺）脅迫后發(fā)生水楊酸次生合成反應(yīng)，彌補(bǔ)其自身合成受阻效應(yīng)?？共∑贩NYT94-128在接種病原菌后，盡管其病情指數(shù)并不嚴(yán)重，但可能是YT94-128葉片本身合成水楊酸速率并不是很突出，從而出現(xiàn)感性和抗性品種中水楊酸含量變化趨勢(shì)接近的現(xiàn)象。結(jié)論：甘蔗在受到生物脅迫（病原菌）和非生物脅迫（針刺）后，其體內(nèi)產(chǎn)生抗御反應(yīng)合成水楊酸，通過(guò)抑制梢腐病病原菌所分泌的植物細(xì)胞壁降解酶活性來(lái)延緩病情發(fā)生。接種處理后的YT94-128要比GT37含量高，這說(shuō)明水楊酸含量與病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與抗性呈正相關(guān)。這一試驗(yàn)結(jié)果為水楊酸抗逆性生理生化機(jī)制研究、篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種提供了重要的技術(shù)參考。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3