本發(fā)明涉及代謝組學，屬于測量測試領域，具體涉及生物樣本中小分子代謝物的定性、定量分析及作為代謝標志物在診斷鑒別甲狀腺良惡性病變中的應用。

背景技術：

甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性內分泌性腫瘤之一。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，在過去的幾十年中，世界各地很多城市均出現(xiàn)甲狀腺癌發(fā)病率升高的現(xiàn)象。在上海，調查發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌在男性和女性中發(fā)病率分別上升了3.1％和3.8％；在香港，發(fā)病率分別上升了2.2％和2.7％；在澳大利亞的昆士蘭則出現(xiàn)男性發(fā)病率上升5.5％，女性發(fā)病率上升6.1％的現(xiàn)象【文獻1：Time trends and age-period-cohort analyses on incidence rates of thyroid cancer in Shanghai and Hong Kong,BMC Cancer,2014；文獻2：Increasing thyroid cancer incidence in Queensland,Australia1982-2008-true increase or over-diagnosis？Clinical Endocrinology,2016】。文獻2中，作者對如此高的發(fā)病率提出了疑問，究竟是發(fā)病率真正上升了還是過度診斷了。

甲狀腺超聲檢查和超聲輔助下細針穿刺活檢(FNAB)是目前公認的甲狀腺癌輔助診斷技術，尤其是FNAB，它被稱為甲狀腺癌診斷的金標準。但是有研究發(fā)現(xiàn)這兩種檢查手段存在較高的誤診率，其診斷效果并不讓人滿意。超聲的檢查結果很大程度上依賴于檢查者的經驗和技術水平等主觀因素，易將良性甲狀腺結節(jié)誤診為甲狀腺癌。誤診的結果就是增加了非必要的甲狀腺手術治療的概率，對很多B超發(fā)現(xiàn)但是不需手術處理的良性甲狀腺結節(jié)進行了不必要的有創(chuàng)性治療，增加了患者的醫(yī)療成本和心理負擔。由于采樣精確性的限制，F(xiàn)NAB很難診斷微小甲狀腺癌。FNAB也難以區(qū)分濾泡性腫瘤的良惡性，導致30％以上的甲狀腺結節(jié)不能通過FNAB方法鑒別其良惡性，只能通過手術確診。

因此，現(xiàn)有技術在診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)存在明顯的缺陷和不足。

研究者們在很多領域都進行了甲狀腺癌特異性生物標志物的探索。Nikiforov,Y.E.等對1056個FNAB診斷結果為性質不確定的甲狀腺樣本進行基因突變位點檢測，包括BRAF V600E、NRAS codon 61、HRAS codon 61等，結果發(fā)現(xiàn)存在任一基因突變的樣本其結節(jié)惡性概率達到88％以上。實驗得出的結論是對于FNAB檢查未能定性的甲狀腺穿刺結節(jié)，通過基因突變位點的檢測有利于對結節(jié)性質進行診斷【Impact of mutational testing on the diagnosis and management of patients with cytologically indeterminate thyroid nodules:a prospective analysis of 1056FNA samples.J Clin Endocrinol Metab,2011】。Chia,S.Y.等在對分化型甲狀腺癌研究中發(fā)現(xiàn)對患者循環(huán)血液中的促甲狀腺激素受體(TSHR)信使RNA(mRNA)含量的測定 具有輔助FNAB診斷的價值。對于FNAB無法分辨的甲狀腺結節(jié)，利用TSHR mRNA可對其進行鑒別，診斷靈敏度和特異性達90％和80％。此外，還可用該指標預測術后患者是否有癌化殘余和轉移【Thyroid-stimulating hormone receptor messenger ribonucleic acid measurement in blood as a marker for circulating thyroid cancer cells and its role in the preoperative diagnosis of thyroid cancer.The Journal ofClinical Endocrinology and Metabolism,2007】。

盡管對于甲狀腺癌輔助診斷標志物的研究很多，但是目前尚未找到診斷靈敏度和特異性均高的單一標志物或聯(lián)合標志物應用于臨床診斷。發(fā)明人所在課題組通過代謝組學的方法尋找到了用于對冠心病診斷分型的診斷標志物，相關研究成果獲得國際認可，已發(fā)表在國際心血管領域排名第一的期刊JAm Coll Cardiol.(影響因子17.759)上(Comprehensive Metabolomic Characterization ofCoronaryArtery Diseases.JAm Coll Cardiol.2016Sep 20；68(12):1281-93)。本課題試圖利用代謝組學的研究方法來尋找可用于診斷鑒別甲狀腺良惡性病變的生物標志物，以克服現(xiàn)有技術在診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)方面的缺陷和不足。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組代謝標志物在診斷鑒別甲狀腺良惡性病變中的應用，以克服現(xiàn)有技術在診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)方面的缺陷和不足。

上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：

代謝標志物在診斷鑒別甲狀腺良惡性病變中的應用，甲狀腺惡性病變指甲狀腺癌，甲狀腺良性病變指甲狀腺良性結節(jié)，所述代謝標志物為1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿或1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿。與甲狀腺良性結節(jié)患者相比，這兩個差異代謝物在甲狀腺癌患者血漿中的表達水平均下調0.6～0.7倍。受試者工作曲線法(ROC)證明，1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿單獨用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有一定的準確度(AUC＞0.8)。

優(yōu)選地，所述代謝標志物為1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿的組合。受試者工作曲線法(ROC)證明，1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿聯(lián)合用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有較高的準確度(訓練集中AUC＞0.9；測試集中AUC＞0.85)，比單獨應用時準確度高。

所述甲狀腺癌為乳頭狀甲狀腺癌。

所述代謝標志物源于血漿。

含有1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和/或1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿的試劑盒或診斷試劑在診斷鑒別甲狀腺良惡性病變中的應用；甲狀腺惡性病變指甲狀腺癌，甲狀腺良性病變指甲狀腺良性結節(jié)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明證明1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿單獨用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有一定的準確度；二者聯(lián)合用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有較高的準確度。1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿及其組合可以作為診斷鑒別甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的代謝標志物。

具體實施方式

下面結合實施例具體介紹本發(fā)明的技術方案。

一、對象和方法

1、樣本臨床特點和采集

經患者同意后，收集江蘇省人民醫(yī)院2014年9月～2015年10月145例甲狀腺良性結節(jié)患者和285例甲狀腺癌患者的外周靜脈血血漿。甲狀腺良性結節(jié)患者包括結節(jié)性甲狀腺腫患者和甲狀腺良性腫瘤患者，甲狀腺癌患者為乳頭狀甲狀腺癌患者，均經術后病理確診。甲狀腺良性結節(jié)患者與甲狀腺癌患者的年齡、性別相匹配。所有標本采血時間均為清晨空腹。

2、訓練集與測試集

隨機選擇83個甲狀腺良性結節(jié)和148個甲狀腺癌患者血漿作為訓練集，以尋找甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的差異代謝物；其余62個甲狀腺良性結節(jié)和137個甲狀腺癌患者血漿作為測試集，用于驗證差異代謝物作為代謝標志物診斷甲狀腺癌的能力。

3、主要試劑

乙腈及甲酸(UPLC純)購于美國ROE公司；色譜級別甲醇和氯仿購于江蘇漢邦科技有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)購于美國Sigma-Aldrich公司；去離子水由美國密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超純水系統(tǒng)制備；標準品購于美國Sigma-Aldrich。

4、血漿差異代謝物的表征(UPLC-Q/TOF-MS法)

4.1樣品制備

樣品處理：取100μL血漿于1.5mL離心管中，加入400μL甲醇，渦旋30秒后混勻，13000rpm×10min離心(4℃)，取200μL上清于1.5mL離心管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得殘渣用300μL的20％乙腈水溶液溶解，即得。

樣本質控溶液：取每個樣本10μL混勻，按上述方法進行前處理，即得。樣本分析前連續(xù)檢測9次質控溶液，待儀器穩(wěn)定后開始分析樣本，每隔9個樣本檢測一次質控溶液。每9個樣本檢測后均插入空白，避免交叉污染。

4.2UPLC-Q/TOF-MS色譜條件：

色譜分離采用超高效液相色譜(UPLC，Agilent 1290，USA)。色譜柱為Waters BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱溫25℃，進樣室溫度為室溫，進樣量2μL。正、負離子模式流動相組成均是A為體積濃度0.1％甲酸水溶液，B為體積濃度0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～1min為0～30％B相，2min內B相線性增加到60％，3～8min線性變化至90％B相，然后在8～9min線性增加至100％B相并保持1min；流速0.3mL/min，柱后流出液不經分流直接導入質譜系統(tǒng)檢測。

質譜分析采用四級桿-飛行時間質譜(Agilent 6530Q-TOF/MS，USA)。以電噴霧離子源(ESI)正、負離子模式檢測；干燥氣流速為7L/min，干燥氣溫度為300℃，干燥氣和錐孔氣均為高純氮氣；離子源溫度100℃，正離子和負離子模式下毛細管電壓均為3000V，碰撞電壓為100V；采用全掃描模式每秒進行三次數據采集，掃描質量范圍：m/z 100-1000道爾頓。

5、數據處理和分析

將上述UPLC-Q/TOF-MS獲得的訓練集樣本數據轉化成mz.data格式后，以R平臺為運行環(huán)境，采用XCMS數據包提取數據，完成譜峰識別、濾躁等前處理程序，最后輸出三維矩陣，即由保留時間和質核比組成的譜峰索引(變量)、樣本名稱和峰強度/面積。將獲得的數據矩陣導入多變量統(tǒng)計軟件SIMCA(version 13.0.2，Umetrics)進行多元統(tǒng)計分析。通過建立正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型得到VIP值，并利用SPSS統(tǒng)計學軟件進行多重檢驗分析，尋找甲狀腺癌與甲狀腺良性結節(jié)之間代謝輪廓貢獻較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物即為表征甲狀腺癌的差異代謝物。

6、差異代謝產物的鑒定：由訓練集獲得的差異代謝物離子通過已經建立的覆蓋率達到2000個代謝物的質譜信息庫、HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metline(http://metlin.scripps.edu/)等數據庫進行物質結構的檢索，利用數據庫中提供的精確分子量和質譜所得的MS/MS圖譜初步鑒定上述差異代謝物的結構。最后利用代謝產物對照品庫，用標準品的分子量、色譜保留時間和相應的多級MS裂解譜比對，從而確證差異代謝物的結構。

7、差異代謝物診斷效能評價(基于訓練集)

在訓練集內，采用受試者工作曲線法(ROC)檢驗差異代謝物診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的準確度。受試者工作特征曲線評價方法中，ROC曲線下的面積(AUC)值在大于0.5的情況下，越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時有較低準確性，AUC在0.7～0.9時有一定準確性，AUC在0.9以上時有較高準確性。

8、差異代謝物診斷效能評價(基于測試集)

在測試集內，進一步采用受試者工作曲線法(ROC)檢驗差異代謝物診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的準確度。

二、結果

在訓練集內采用受試者工作曲線法檢驗差異代謝物診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的準確度時，有兩個獨立差異代謝物的AUC在0.8以上，分別為：1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿。與甲狀腺良性結節(jié)患者相比，這兩個差異代謝物在甲狀腺癌患者血漿中的表達水平均下調(通過標準品定量檢測證明下調0.6～0.7倍)。1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿單個用于診斷區(qū)分甲狀腺癌與甲狀腺良性結節(jié)的能力較強，1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿的曲線下面積(AUC)為0.899，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為68.9％和95.2％，1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿的AUC為0.879，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為79.7％和84.3％；二者聯(lián)合用于診斷時，AUC達0.906，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為77.7％和88.0％。AUC結果見表1。

在測試集內采用受試者工作曲線法檢驗差異代謝物診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的準確度時，1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿單個的AUC均大于0.83；1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿和1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿聯(lián)合的AUC達0.852，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為75.7％和84.2％。AUC結果見表2。

表1基于訓練集的AUC結果

表2基于測試集的AUC結果

上述實驗結果表明：1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰膽堿單獨用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有一定的準確度；二者聯(lián)合用于診斷區(qū)分甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)時，具有較高的準確度。1-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-sn- 甘油-3磷脂酰膽堿及其組合可以作為診斷鑒別甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)的代謝標志物。

上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。