本發(fā)明涉及分析檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種血清中25-羥基維生素D的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：維生素D是一種脂溶性維生素，是固醇類(lèi)衍生物，是維持人類(lèi)身體健康必需的一種化合物。維生素D包括5種化合物，與健康密切相關(guān)的是維生素D2和維生素D3。維生素D2和維生素D3經(jīng)肝臟的單氧化酶(25-羥基氧化酶)氧化形成25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3。25-羥基維生素D在血液中的濃度高、循環(huán)周期長(zhǎng)，因此成為維生素D在人體內(nèi)的濃度指示劑，是人體維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)。維生素D3可由動(dòng)物性維生素原(7-脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線270-300nm激活形成，維生素D2是由植物性維生素原(麥角固醇)經(jīng)紫外線270-300nm激活形成的。因此維生素D2多存在于植物性食物中，維生素D3多存在于動(dòng)物性食物中。維生素D2和D3長(zhǎng)期被認(rèn)為是生物學(xué)等價(jià)的，然而最近的報(bào)道表明這兩種形式的維生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差異(Armasetc，(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)。人體血液中25-羥基維生素D的濃度較低一般為ppb級(jí)別，主要以蛋白DBP結(jié)合的形式存在，且人體血液組成復(fù)雜存在大量的高親和力結(jié)合蛋白，因此直接檢測(cè)存在嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，特異性差，靈敏度低等缺點(diǎn)。為了降低基質(zhì)干擾，提高特異性、靈敏度等，目前常采用方法有：方法1：離線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀，再經(jīng)過(guò)液液萃取或者液固萃取后進(jìn)行氮吹濃縮得到待測(cè)樣本，樣本經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進(jìn)行檢測(cè)；方法2：在線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀后經(jīng)過(guò)在線萃取裝置得到待測(cè)物，再經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進(jìn)行檢測(cè)。但是這兩種方法存在如下的問(wèn)題：方法1：前處理復(fù)雜、處理時(shí)間長(zhǎng)(一個(gè)樣本約2小時(shí))、通量低、試劑成本高、對(duì)操作人員要求高；方法2：儀器投入大，且在線萃取的耗材成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題，提供一種血清中25-羥基維生素D的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單并能有效去除基質(zhì)干擾，可以同時(shí)快速檢測(cè)并準(zhǔn)確定量25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，靈敏度高、通量高。具體技術(shù)方案如下。一種血清中25-羥基維生素D的檢測(cè)方法，包括以下步驟：樣品前處理：在血清樣品中加入含有25-羥基維生素D內(nèi)標(biāo)物的乙腈溶液進(jìn)行蛋白沉淀，離心，取上清液用乙腈稀釋?zhuān)吹么郎y(cè)樣品；所述血清樣品與所述乙腈溶液的體積比為1：1-4；所述上清液與所述乙腈的體積比為1：1-4倍；富集、分離和檢測(cè)：對(duì)所述待測(cè)樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行富集、分離和檢測(cè)。在其中一些實(shí)施例中，所述富集、分離和檢測(cè)的步驟包括：先用流動(dòng)相1洗脫富集柱中的待測(cè)樣品，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行富集、純化，再將富集柱與分析柱連通，用流動(dòng)相2將待測(cè)物依次從富集柱洗脫至分析柱，再斷開(kāi)富集柱與分析柱，用流動(dòng)相2將待測(cè)物從分析柱洗脫、分離至四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)；其中，富集柱為C6-Phenyl(4×2.0mm)，分析柱為C18(100×2.0mm，3μm)；流動(dòng)相1：A相為甲醇，B相為水，流速為1.0-2.0mL/min；流動(dòng)相2：C相為含0.09-0.11％甲酸的甲醇，D相為含0.09-0.11％甲酸的水，流速為0.2-1.0mL/min。本發(fā)明所述的二維液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配置了兩套泵，兩套泵通過(guò)六通閥(或者其它可實(shí)現(xiàn)切換的方式)實(shí)現(xiàn)切換。起始模式下，富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測(cè)樣品經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入富集柱進(jìn)行富集、純化后，0.25min切換六通閥使富集柱與分析柱連通，將待測(cè)樣品洗脫至分析柱，1.9min六通閥切回起始模式，斷開(kāi)富集柱與分析柱，待測(cè)物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫至分離后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫至廢液瓶中。在其中一些實(shí)施例中，二維液相色譜的進(jìn)樣量為30-100μL，柱溫為35-50℃。在其中一些實(shí)施例中，所述進(jìn)樣量為40-60μL，所述柱溫為35-45℃。在其中一些實(shí)施例中，流動(dòng)相采用梯度洗脫的模式：0分時(shí)，流動(dòng)相1中A相與B相的體積比為50:50，流動(dòng)相2中C相與D相的體積比為70:30，用流動(dòng)相1洗脫富集柱中的待測(cè)樣品，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行富集、純化；0.25min后將富集柱與分析柱連通，用流動(dòng)相2將待測(cè)物依次從富集柱洗脫至分析柱，1.5min時(shí)流動(dòng)相2中C相與D相的體積比為85:15；1.9min時(shí)斷開(kāi)富集柱與分析柱，用流動(dòng)相1將富集柱中的殘留雜質(zhì)梯度洗脫至廢液瓶中，用流動(dòng)相2將待測(cè)物從分析柱洗脫、分離至四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，5.5min時(shí)流動(dòng)相2中C相與D相的體積比為90:10，5.6min時(shí)流動(dòng)相2中C相與D相的體積比為95:5，6.6min時(shí)流動(dòng)相2中C相與D相的體積比為70:30；整個(gè)梯度時(shí)間為7.0-9.0min。在其中一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相1的流速為1.2-1.3mL/min，所述流動(dòng)相2的流速為0.4-0.6mL/min。在其中一些實(shí)施例中，所述血清樣品與所述乙腈溶液的體積比為1：1.5-2.5；所述上清液與所述乙腈的體積比為1：1.5-2.5倍。在其中一些實(shí)施例中，所述25-羥基維生素D內(nèi)標(biāo)物為25-羥基維生素D的C13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物。在其中一些實(shí)施例中，所述離心的條件為：溫度0-5℃，轉(zhuǎn)速11000-13000r/min，時(shí)間4-8min。在其中一些實(shí)施例中，四級(jí)桿質(zhì)譜條件為：正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描MRM；所述正離子模式中，目標(biāo)定量離子對(duì)包括25-羥基維生素D2定量離子對(duì)和/或25-羥基維生素D3定量離子對(duì)；目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描MRM的質(zhì)/荷比條件包括：25-羥基維生素D2的母離子的質(zhì)/荷比為413.0-413.8，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為394.8-395.5；25-羥基維生素D3的母離子的質(zhì)/荷比為401.0-401.8，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為383.3-383.6。在其中一些實(shí)施例中，所述四級(jí)桿質(zhì)譜條件還包括以下離子源參數(shù)：電離源為電噴霧電離ESI源，氣簾氣壓力為38-42psi，加熱氣壓力為48-52psi，輔助加熱氣壓力為48-52psi，加熱氣溫度為445-455℃，碰撞氣為氮?dú)?，碰撞氣壓力?.5-8.5psi，電噴霧針電壓為5400-5600V。在其中一些實(shí)施例中，所述四級(jí)桿質(zhì)譜條件還包括：25-羥基維生素D3定量離子對(duì)的去簇電壓為104-106V，入口電壓為9-11V，碰撞電壓為16-18V，出口電壓為12-14V；25-羥基維生素D3內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)的去簇電壓為114-116V，入口電壓為9-11V，碰撞電壓為14-15V，出口電壓為11-13V；25-羥基維生素D2定量離子對(duì)的去簇電壓為114-116V，入口電壓為9-11V，碰撞電壓為14-16V，出口電壓為12-14V；25-羥基維生素D2內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)的去簇電壓為114-116V，入口電壓為9-11V，碰撞電壓為14-16V，出口電壓為12-14V本發(fā)明的血清中25-羥基維生素D的檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)本發(fā)明檢測(cè)方法前處理簡(jiǎn)單，不需要萃取，氮吹濃縮，復(fù)溶等，處理時(shí)間短，處理單個(gè)樣本只需1.5-3min，處理一批(20個(gè))也只需要5-8min，而常用的萃取法處理單個(gè)樣本至少需120min，處理一批(20個(gè))也至少需要150min。即本發(fā)明的檢測(cè)方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了樣本的檢測(cè)通量。(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法在儀器投入方面比普通的液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀僅增加了一個(gè)富集柱和一組泵，并且采用的富集柱簡(jiǎn)單、成本低且可重復(fù)使用數(shù)千次以上。相對(duì)于在線固相萃取，本方法的耗材成本至少降低10倍。即本發(fā)明的檢測(cè)方法成本低。(3)本發(fā)明的檢測(cè)方法通過(guò)對(duì)前處理的參數(shù)以及富集、分離和檢測(cè)的各參數(shù)(比如富集柱的選擇、流動(dòng)相的選擇、流速等條件)進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行優(yōu)化，使最后得到的檢測(cè)方法可以有效去除基質(zhì)干擾，特異性、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。定量限低(1.2μg/L)，靈敏度高，精密度RSD小于10％，可以準(zhǔn)確的定性或定量檢測(cè)出人血清中極低濃度的25-羥維生素D含量。即與常用的檢測(cè)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度高、精密度高、特異性強(qiáng)。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1人血清樣品中25-羥基維生素D及其內(nèi)標(biāo)物的TIC圖；圖2為25-羥基維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為25-羥基維生素D2的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為25-羥基維生素D2的線性回歸曲線圖；圖5為25-羥基維生素D3的線性回歸曲線圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的血清中25-羥基維生素D的檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1本實(shí)施例的25-羥基維生素D的檢測(cè)方法，包括以下步驟：一、樣品前處理將200μL人血清樣品倒入到潔凈的離心管中，加入400μL含有內(nèi)標(biāo)物(112μg/L6d-25羥基維生素D3和50μg/L3d-25羥基維生素D2)的乙腈溶液，漩渦混勻60s后，于離心機(jī)12000r/min，4℃離心分離5min，取200μL上清液至棕色進(jìn)樣瓶中，再加入400μL乙腈，漩渦混勻60s后，即得待測(cè)樣品，將其加載至液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器中。二、富集、分離和檢測(cè)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)將50μL待測(cè)樣品加載到二維液相色譜系統(tǒng)中，對(duì)所述待測(cè)樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀LC-MS/MS進(jìn)行富集、分離與檢測(cè)。其中，富集柱為C6-Phenyl(4×2.0mm)；分析柱為C18(100×2.0mm,3μm)；柱溫為40℃。該系統(tǒng)配置了兩套泵，兩套泵通過(guò)一個(gè)六通閥實(shí)現(xiàn)切換(也可以通過(guò)兩個(gè)六通閥或者其它的方式進(jìn)行切換)，六通閥3號(hào)位連接FLOW1(流動(dòng)相1)，1號(hào)和4號(hào)位連接富集柱，5號(hào)位連接FLOW2(流動(dòng)相2)，6號(hào)位連接分析柱，2號(hào)位連接廢液瓶。FLOW1流動(dòng)相：A相為甲醇、B相為水，流速為1.2mL/min；FLOW2流動(dòng)相：C相為含有0.1％甲酸的甲醇、D相為含有0.1％甲酸的水，流速0.5mL/min。六通閥的起始模式為0，即富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測(cè)樣品經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入富集柱進(jìn)行富集、純化，此過(guò)程中富集柱用FLOW1流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；0.25min切換六通閥為1，即富集柱與分析柱連通，將待測(cè)樣品洗脫至分析柱，此過(guò)程中富集柱與分析柱中的洗脫流動(dòng)相均為FLOW2流動(dòng)相；1.9min六通閥切回起始模式0，斷開(kāi)富集柱與分析柱，待測(cè)物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫(流動(dòng)相為FLOW2流動(dòng)相)至分離后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫(流動(dòng)相為FLOW1流動(dòng)相)至廢液瓶中。流動(dòng)相的梯度洗脫如表1所示。表1流動(dòng)相的洗脫梯度上述梯度下，25-羥維生素D2和25-羥維生素D3的保留時(shí)間分別為4.12min和4.28min。本實(shí)施例LC-MS/MS采用具有電噴霧電離源(ESI)的AppliedBiochemistryAPI4500plus串聯(lián)質(zhì)譜分析儀作為檢測(cè)器進(jìn)行分析。其中，氣簾氣壓力為40.0psi；加熱氣壓力為50psi；輔助加熱氣壓力為50psi；加熱氣溫度為450℃；碰撞氣為高純氮?dú)?，壓力?psi；電噴霧針電壓為5500V。其它質(zhì)譜條件：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描MRM，其條件參見(jiàn)表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描MRM條件待測(cè)物隨流動(dòng)相流出分析柱后，在壓力的作用下進(jìn)入質(zhì)譜儀離子源，由六通閥控制進(jìn)入離子源的樣品通道，和進(jìn)入切換時(shí)間。在離子源內(nèi)液體樣品被汽化并且電離為帶電分子，帶電分子在電壓和真空作用下，進(jìn)入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3為質(zhì)量過(guò)濾器，只允許根據(jù)25-羥基維生素D及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)荷比選擇的母離子和子離子通過(guò)，Q2為碰撞單元，母離子在此處與惰性氣體原子碰撞，產(chǎn)生特定的碎片離子。質(zhì)譜儀的第一個(gè)四極(Q1)選擇具有25-羥維生素D及其內(nèi)標(biāo)物的特定質(zhì)荷比m/z的母離子，具有這些m/z比的母離子被允許進(jìn)入Q2，Q2產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)入到Q3，其中25-羥維生素D及其內(nèi)標(biāo)物的碎片離子(子離子)被選擇通過(guò)，而其它離子被除去。參見(jiàn)表3，示出了被用于鑒別和定量的25-羥基維生素D的離子對(duì)的質(zhì)荷比m/z。表325-羥基維生素D的質(zhì)量轉(zhuǎn)變表隨著離子與檢測(cè)器碰撞，它們將捕獲到的離子數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計(jì)算機(jī)，其將所收集的離子數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，即得總離子流圖(TIC圖)(如圖1所示)。三、定性判斷和定量計(jì)算(1)依據(jù)25-羥基維生素D、內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)保留時(shí)間和檢測(cè)的定量離子對(duì)的豐度比判斷25-羥基維生素D的存在。在相同試驗(yàn)條件下，檢測(cè)樣品中被測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致；檢測(cè)樣品的色譜圖中所選擇的檢測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子對(duì)相對(duì)豐度比的偏差(即表4中的最大允許誤差)不超過(guò)表4規(guī)定的范圍，則可以判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。表4定性判斷相對(duì)豐度的最大允許誤差相對(duì)豐度(K)K≥50％20％≤K≤50％10％≤K≤20％K≤10％最大允許誤差±20％±25％±30％±50％(2)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，以25-羥基維生素D與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值計(jì)算樣品中的25-羥基維生素D的含量。配置系列濃度的含有25-羥基維生素D的血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，用本實(shí)施例的上述方法進(jìn)行樣品前處理以及分離檢測(cè)，以血清標(biāo)準(zhǔn)樣品中25-羥基維生素D和內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值構(gòu)建內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，25-羥基維生素D3的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，曲線的方程Y＝0.00409X+0.00337，R＝0.9999；25-羥基維生素D2的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，曲線的方程為Y＝0.00124X+0.000663,R＝0.9999，然后利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品或質(zhì)量控制物中的25-羥基維生素D3或25-羥基維生素D2的濃度。本實(shí)施例測(cè)得25-羥基維生素D3的峰面積為3.41×105，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為3.66×106，計(jì)算得到本實(shí)施例的人血清樣品中25-羥基維生素D3的濃度為21.96ug/L；25-羥基維生素D2的峰面積為4.14×104，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為1.45×106，計(jì)算得到25-羥基維生素D2的濃度為22.49ug/L。實(shí)施例2方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1中的25-羥基維生素D的檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。1、精密度(Precision)實(shí)驗(yàn)1.1批內(nèi)精密度(Intra-assay)a.取實(shí)際血清樣本分別加標(biāo)至低、中、高三水平，得到的樣本進(jìn)行批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)；b.每個(gè)濃度水平的樣本平行處理20個(gè)，每個(gè)進(jìn)樣1次；c.計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，要求RSD小于20％；d.表5和6即為批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)，批內(nèi)精密度均小于5％，滿(mǎn)足要求。表525-羥基維生素D2的批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表625-羥基維生素D3批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2批間精密度(Inter-assay)a.取預(yù)先配制好的低、中、高三水平的質(zhì)控品，進(jìn)行批間精密度實(shí)驗(yàn)；b.每個(gè)水平的樣本分別做4個(gè)平行，即檢測(cè)得4組數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)定5天；c.計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),要求RSD小于20％；d.表7和8即為批間精密度數(shù)據(jù)，批間精密度均小于11％，滿(mǎn)足要求。表725-羥基維生素D2批間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表825-羥基維生素D3批間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果2、分析靈敏度和線性范圍(AnalyticalSensitivityandAnalyticalM--easurementRangeandLinearityStudy)2.1方法定量限與線性范圍(LimitofQuantitationandLinearity)a.配制空白基質(zhì)；b.配置標(biāo)準(zhǔn)曲線；c.每個(gè)濃度的樣本平行處理6個(gè)，分別檢測(cè)一次；d.計(jì)算各濃度樣本的平均值、RSD和回收率；e.方法定量限的確定標(biāo)準(zhǔn)：RSD小于20％且回收率在85％-115％范圍內(nèi)的最低濃度點(diǎn)視為定量限濃度，即LOQ；f.線性范圍的確定標(biāo)準(zhǔn)：RSD小于20％，回收率在85％-115％范圍內(nèi)，且以理論濃度比率與實(shí)際信號(hào)響應(yīng)峰面積比率繪制成的回歸曲線R2>0.98，即滿(mǎn)足線性范圍的要求；g.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表10和表11與圖4和圖5所示，25-羥基維生素D2的LOQ為2.08ug/L，線性范圍為2.08-100ug/L；25-羥基維生素D3的LOQ為2.08ug/L，線性范圍為2.08-100ug/L。表9回歸曲線中的曲線點(diǎn)濃度表1025-羥基維生素D2定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1125-羥基維生素D3定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2方法檢出限(LimitofDetection)a.收集濃度均在定量限LOQ附近的病人樣本；b.平行處理此病人樣本20個(gè)，分別檢測(cè)1次；c.計(jì)算各濃度樣本的平均值、SD和方法檢出限(LOD)；d.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12和表13所示，25-羥基維生素D2的LOD為0.48ug/L，25-羥基維生素D3的LOD為0.54ug/L。表1225-羥基維生素D2方法檢出限試驗(yàn)結(jié)果表1325-羥基維生素D3方法檢出限試驗(yàn)結(jié)果2.3結(jié)論(SummaryoftheAMRstudy)表1425-羥基維生素D2分析靈敏度與線性范圍結(jié)果匯總表1525-羥基維生素D3分析靈敏度與線性范圍結(jié)果匯總3.方法準(zhǔn)確度-回收率(Recovery)a.收集一批混合血清樣本，測(cè)得基礎(chǔ)濃度，分別加標(biāo)至高、中、低三水平的樣本，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)；b.未加標(biāo)及加標(biāo)樣品，每個(gè)平行處理3個(gè)，分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)樣品的回收率結(jié)果，回收率在85-115％范圍內(nèi)，認(rèn)為方法準(zhǔn)確；c.回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表16和表17所示。由結(jié)果可知，方法的回收率在95.42-105％之間，滿(mǎn)足要求。表1625-羥基維生素D2加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表1725-羥基維生素D3加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果由上述的檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明的25-羥基維生素D的檢測(cè)方法檢測(cè)血清樣品或者質(zhì)控物質(zhì)結(jié)果準(zhǔn)確，定量限為2.08μg/L，檢測(cè)限為0.48-0.54μg/L，精密度RSD<5％，加標(biāo)回收率在95％-105％之間，前處理時(shí)間約1.5min，檢測(cè)效率高。說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠，精密度高、靈敏度高、檢測(cè)通量高、成本低。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3