霉菌的檢測(cè)方法、pcr用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體的制作方法
【專利摘要】在確認(rèn)霉菌是否存在的檢查中，能夠高精度且特異性地檢測(cè)廣泛種類的霉菌。一種霉菌的檢測(cè)方法，包括使包含霉菌的DNA中的靶區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)的工序，作為所述靶區(qū)域，使用ITS區(qū)域以及β-微管蛋白基因。另外，在用于進(jìn)行靶區(qū)域的擴(kuò)增的PCR用反應(yīng)液中，用于使β-微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組與用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組的濃度比為1：0.9～1：0.1。
【專利說(shuō)明】霉菌的檢測(cè)方法、PCR用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及霉菌的檢測(cè)方法，特別涉及用于高精度且特異性地檢測(cè)廣泛種類的霉菌的霉菌檢測(cè)方法、PCR用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，在食品制造現(xiàn)場(chǎng)或臨床現(xiàn)場(chǎng)、文化財(cái)產(chǎn)保護(hù)環(huán)境等中，檢查是否存在霉菌等微生物來(lái)確認(rèn)安全性，并且防止其繁殖變得很重要。
[0003]這樣的霉菌檢查中，通常，從環(huán)境中采集試樣，進(jìn)行前期培養(yǎng)，接著，在對(duì)各菌種最佳的培養(yǎng)基中進(jìn)行約20天的培養(yǎng)后，觀察形態(tài)的特征，由此，進(jìn)行鑒定霉菌的形態(tài)觀察法(培養(yǎng)法)(參照專利文獻(xiàn)I)。 [0004]但是，該方法中，需要對(duì)每個(gè)霉菌種類進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此，存在檢查工序變煩雜的問(wèn)題。另外，培養(yǎng)需要長(zhǎng)時(shí)間，因此，具有例如對(duì)于人生活的室內(nèi)的檢查或食物的檢查等要求迅速性的檢查而言不適合的問(wèn)題。另外，也存在如沒(méi)有形成表示形態(tài)特征的胞子則無(wú)法鑒定，有時(shí)浪費(fèi)勞力的問(wèn)題。
[0005]另外，最近，在霉菌的檢查中，也進(jìn)行使用了基因的鑒定法。例如，將從環(huán)境中采集的試樣培養(yǎng)后，從培養(yǎng)細(xì)胞中提取DNA，通過(guò)PCR (聚合酶鏈反應(yīng))法使靶區(qū)域擴(kuò)增，對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，由此，進(jìn)行試樣中的霉菌鑒定。作為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的方法，提出了例如通過(guò)電泳來(lái)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的尺寸的方法、使用將與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)結(jié)合的探針固定的DNA芯片來(lái)鑒定在試樣中存在的霉菌的方法等(參照專利文獻(xiàn)2~6)。
[0006]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2007-195454號(hào)公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-35773號(hào)公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2008-278848號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi)2008-278861號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)5:日本特開(kāi)2010-4879號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2009-284832號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0013]但是，即使通過(guò)這樣的使用基因的鑒定法，在霉菌種類內(nèi)的類似性高的情況下，僅由單一的靶基因的有無(wú)和尺寸來(lái)特定種類也極困難，存在例如不適于要求種群水平的鑒定準(zhǔn)確度的檢查的問(wèn)題。
[0014]在此，專利文獻(xiàn)2~4中，以各種霉菌的基因中的ITS(Intemal TranscribedSpacer)區(qū)域作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域，進(jìn)行鑒定。在基于這樣的ITS區(qū)域的霉菌的鑒定中，隨著霉菌的種類增加，假陽(yáng)性反應(yīng)也增加，存在檢查精度降低的問(wèn)題。
[0015]另一方面，在專利文獻(xiàn)5、6中記載了以微管蛋白基因作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域來(lái)進(jìn)行鑒定。這些文獻(xiàn)中公開(kāi)了，通過(guò)以β_微管蛋白基因作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域，能夠檢測(cè)特定種類的霉菌。
[0016]但是，如僅以β_微管蛋白基因作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域，則與僅以ITS區(qū)域作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域的情況同樣，存在有時(shí)發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)的問(wèn)題。
[0017]本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者作為擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域使用，能夠高精度地檢測(cè)廣泛種類的霉菌，從而完成了本發(fā)明。另外，也發(fā)現(xiàn)了用于能夠使ITS區(qū)域與β -微管蛋白基因同時(shí)在反應(yīng)系統(tǒng)中有效擴(kuò)增的條件。
[0018]但是，如上所述，進(jìn)行形態(tài)鑒定的方法中，為了發(fā)現(xiàn)形態(tài)的特征，需要對(duì)每個(gè)菌種而言的最佳培養(yǎng)基和長(zhǎng)期的培養(yǎng)，另外，鑒定需要熟練，因此，存在不適于迅速檢查和檢查的簡(jiǎn)易化的問(wèn)題。
[0019]另外，在基于PCR及序列分析的方法中，為了對(duì)各菌種分別培養(yǎng)，需要約14天的比較長(zhǎng)的檢查期間，另外，由于需要對(duì)各菌種分別分析，因此，存在不適于要求多檢體處理的情況的問(wèn)題。
[0020]相對(duì)于此，根據(jù)基于DNA芯片的新型檢測(cè)方法，理論上，能夠一次檢測(cè)多種霉菌，被期待作為迅速并且簡(jiǎn)易的檢查方法。
[0021]另一方面，基于適于生長(zhǎng)的濕度，霉菌被分成嗜干性霉菌(喜好干燥狀態(tài))、耐干性霉菌(能耐受干燥)、及嗜濕性霉菌(喜好濕潤(rùn)狀態(tài))，它們需要通過(guò)各自適合的不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。另外，在上述的以往通常進(jìn)行的第一及第二方法中，需要對(duì)各菌種分別培養(yǎng)，因此，并不存在，將多種霉菌混合培養(yǎng)、再在此基礎(chǔ)上分別檢測(cè)各個(gè)霉菌這樣的概念。因此，以往不存在將嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌同時(shí)培養(yǎng)而能夠特異地檢測(cè)各個(gè)霉菌的技術(shù)。
[0022]本發(fā)明是鑒于上述情況進(jìn)行的，其目的在于，提供霉菌的檢測(cè)方法、在該檢測(cè)方法中使用的PCR用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體，所述霉菌的檢測(cè)方法中，將試樣中的霉菌的基因組DNA中的ITS區(qū)域及β_微管蛋白基因擴(kuò)增，通過(guò)確認(rèn)該擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)進(jìn)行霉菌的鑒定。
[0023]另外，其目的在于，提供一種霉菌的檢查方法，其中，不是對(duì)多種霉菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，而是在相同的培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)多種霉菌，并且將它們混合而一次提取基因組DNA，通過(guò)DNA芯片能夠特異地檢測(cè)各霉菌。
[0024]用于解決問(wèn)題的方法
[0025]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法為如下方法:包括使包含霉菌DNA中的靶區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增并確認(rèn)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的工序，其中，作為靶區(qū)域，使用ITS區(qū)域以及β_微管蛋白基因。
[0026]這樣作為擴(kuò)增的靶區(qū)域，如并用ITS區(qū)域以及β_微管蛋白基因，則與僅使用它們中的任一種作為靶區(qū)域的情況相比較，能夠降低假陽(yáng)性反應(yīng)。因此，能夠更高精度地檢測(cè)廣泛的霉菌。
[0027]另外，本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法中，通過(guò)PCR法進(jìn)行靶區(qū)域的擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選將PCR用反應(yīng)液中的用于使β -微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組與用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組的濃度比設(shè)為1:0.9~1:0.1。
[0028]如果這樣設(shè)定引物組的濃度比，則通過(guò)使用含有這些引物組的PCR用反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，能夠同時(shí)將ITS區(qū)域與β_微管蛋白基因二者有效擴(kuò)增。因此，通過(guò)同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)，能夠以更高的精度進(jìn)行霉菌的檢查。需要說(shuō)明的是，如果將用于使β-微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組與用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組的濃度比設(shè)為1:0.5~1:0.25，則能夠使這兩者的擴(kuò)增效率最有效，因此更優(yōu)選。
[0029]另外，本發(fā)明的PCR用反應(yīng)液為用于進(jìn)行靶區(qū)域的擴(kuò)增的PCR用反應(yīng)液，包含:具備正向引物及反向引物的引物組作為用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組，其中，所述正向引物含有序列號(hào)I所不的喊基序列，所述反向引物含有序列號(hào)2所不的喊基序列；和具備正向引物及反向引物的引物組作為用于使β_微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組，其中，所述正向引物含有序列號(hào)3所不的喊基序列,所述反向引物含有序列號(hào)4所不的喊基序列。
[0030]如果這樣設(shè)定PCR用反應(yīng)液，則能夠使各種霉菌中的ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者擴(kuò)增。因此，能夠基于這兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物判定霉菌的有無(wú)，從而能夠高精度地檢測(cè)更廣泛的霉菌。
[0031]另外，也優(yōu)選使本發(fā)明的PCR用反應(yīng)液還包含含有序列號(hào)5所示的堿基序列的引物作為用于使支孢屬菌特異性擴(kuò)增的正向引物。
[0032]如果這樣設(shè)定PCR用反應(yīng)液，則能夠?qū)H通過(guò)使用包含含有序列號(hào)I~4所示的堿基序列的引物的PCR用反應(yīng)液而無(wú)法有效擴(kuò)增的支孢屬菌的DNA片段擴(kuò)增，能夠?qū)υ摼m當(dāng)?shù)剡M(jìn)行檢測(cè)。
[0033]另外，本發(fā)明的霉菌檢測(cè)用載體針對(duì)一種或二種以上霉菌中的每一種固定了具有選自ITS區(qū)域的喊基序列的探針以及具有選自β _微管蛋白基因的喊基序列的探針。
[0034]如果這樣設(shè)定霉菌檢測(cè)用載體，則通過(guò)向該霉菌檢測(cè)用載體中滴加將ITS區(qū)域與 β_微管蛋白基因同時(shí)擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠檢測(cè)具有與探針的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的DNA的霉菌。在該霉菌檢測(cè)用載體上，針對(duì)每個(gè)霉菌種類固定化有具有選自ITS區(qū)域的喊基序列的探針以及具有選自β _微管蛋白基因的喊基序列的探針二者，因此，能夠基于這二者來(lái)確認(rèn)霉菌是否存在。另外，在檢測(cè)出ITS區(qū)域和β-微管蛋白基因二者的情況下判斷存在霉菌，由此，能夠降低基于假陽(yáng)性而判定存在的情況，能夠進(jìn)行更高精度的霉菌檢測(cè)。
[0035]另外，本發(fā)明的霉菌的檢查方法為如下方法:培養(yǎng)多種霉菌，將該培養(yǎng)后的多種霉菌混合，一次性提取基因組DNA，使用DNA芯片，同時(shí)并且特異性地對(duì)多種霉菌分別進(jìn)行檢測(cè)。
[0036]如果將本發(fā)明的霉菌的檢查方法設(shè)定為這樣的方法，則即使不按菌種單個(gè)地分開(kāi)培養(yǎng)，而是在混在的狀態(tài)下培養(yǎng)，也能夠特異性地檢測(cè)培養(yǎng)后的菌種。即，在培養(yǎng)后的多種霉菌混合的狀態(tài)下，即使一起進(jìn)行各個(gè)霉菌的基因組DNA的提取，也能夠通過(guò)DNA芯片檢測(cè)各霉菌。
[0037]需要說(shuō)明的是，作為使用DNA芯片檢測(cè)提取出的基因組DNA的方法，可以使用通常的方法。
[0038]具體而言，例如使用包含用于將檢測(cè)對(duì)象霉菌的特定區(qū)域擴(kuò)增的引物組的PCR反應(yīng)液，通過(guò)PCR法將基因組DNA的特定區(qū)域擴(kuò)增。將預(yù)先選自基于該引物組的擴(kuò)增區(qū)域的探針事先固定化到DNA芯片。此時(shí)，需要針對(duì)每個(gè)檢測(cè)對(duì)象霉菌的特定區(qū)域預(yù)先制作引物組及探針。另外，在該DNA芯片上滴加通過(guò)PCR法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物，由此，能夠分別特異性地檢測(cè)混合物中包含的各種霉菌。[0039]另外，上述本發(fā)明的霉菌的檢查方法中，也優(yōu)選如下方法:將至少選自嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌中的2種以上的霉菌在規(guī)定的一個(gè)培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)，同時(shí)并且特異性地檢測(cè)該培養(yǎng)后的各霉菌。
[0040]如果使本發(fā)明的霉菌的檢查方法為這樣的方法，則能夠?qū)⑼ǔ１环謩e培養(yǎng)的、要求不同的濕度環(huán)境的霉菌在規(guī)定的一個(gè)培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)。另外，能夠從這些混合物中特異性地檢測(cè)各個(gè)霉菌。因此，可以不用考慮霉菌的性質(zhì)等而一次性同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)霉菌檢查的簡(jiǎn)易化。
[0041]另外，上述本發(fā)明的霉菌的檢查方法中，使多種霉菌的水分活性值優(yōu)選低于1.0且0.90以上、并且使糖濃度優(yōu)選為5~50%、進(jìn)一步優(yōu)選10%~40%。作為糖的種類，具體而言，優(yōu)選使用葡萄糖、蔗糖。
[0042]根據(jù)這樣的水分活性值、糖濃度的固體培養(yǎng)基，也能夠適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌中的任一種，能夠一次性同時(shí)培養(yǎng)所有霉菌，進(jìn)行其檢測(cè)。
[0043]另外，上述本發(fā)明的霉菌的檢查方法中，也優(yōu)選如下方法:將多種霉菌在25 0C ±2°C的溫度下培養(yǎng)。
[0044]如果為這樣的溫度范圍，則也能夠充分地繁殖嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌中的任一種。
[0045]另外，上述本發(fā)明的霉菌的檢查方法中，也優(yōu)選將培養(yǎng)后的多種霉菌裝入收納有用于將霉菌的細(xì)胞壁物理性破碎的微珠的容器中并混合，一次性提取基因組DNA。
[0046]如果使本發(fā)明的霉菌的檢查方法為這樣的方法，則能夠從同時(shí)培養(yǎng)后的多種霉菌中集中提取基因組DNA。
[0047]另外，上述本發(fā)明的霉菌的檢查方法中，也優(yōu)選多種霉菌為在大氣中浮游或附著的霉菌胞子及菌絲。
[0048]如果使本發(fā)明的霉菌的檢查方法為這樣的方法，則采集環(huán)境中的霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，能夠?qū)⑺鼈兒?jiǎn)單地同時(shí)檢測(cè)。
[0049]發(fā)明效果
[0050]通過(guò)本發(fā)明，能夠高精度地檢測(cè)廣泛種類的霉菌。
[0051]另外，通過(guò)本發(fā)明，能夠?qū)⒍喾N霉菌在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行同時(shí)培養(yǎng)，并且將它們混合而一次提取基因組DNA，通過(guò)DNA芯片特異性地檢測(cè)各霉菌。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1是表示通過(guò)含有序列號(hào)3和序列號(hào)4的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的β_微管蛋白基因內(nèi)的種或者屬特異的區(qū)域及霉菌共同區(qū)域的圖。
[0053]圖2是表示在本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法中使用的引物的圖。
[0054]圖3是表示在本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法中使用的探針的圖。
[0055]圖4是表示在從施設(shè)環(huán)境采集的樣品A~H中分別包含的菌種的圖。
[0056]圖5是表示在同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中用于探測(cè)能夠檢測(cè)出ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者的引物組濃度的范圍的試驗(yàn)I的結(jié)果(樣品Α)的圖。
[0057]圖6是表示在同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中用于探測(cè)能夠檢測(cè)出ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者的引物組濃度的范圍的試驗(yàn)I的結(jié)果(樣品B)的圖。[0058]圖7是表示在同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中用于探測(cè)能夠檢測(cè)出ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者的引物組濃度的范圍的試驗(yàn)I的結(jié)果(樣品C)的圖。
[0059]圖8是表示在同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中用于探測(cè)能夠檢測(cè)出ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者的引物組濃度的范圍的試驗(yàn)I的結(jié)果(樣品D)的圖。
[0060]圖9是表示關(guān)于試驗(yàn)I的樣品A的各引物組濃度比及各探針的熒光強(qiáng)度的圖。
[0061]圖10是表示關(guān)于試驗(yàn)I的樣品B的各引物組濃度比及各探針的熒光強(qiáng)度的圖。
[0062]圖11是表示關(guān)于試驗(yàn)I的樣品C的各引物組濃度比及各探針的熒光強(qiáng)度的圖。
[0063]圖12是表示關(guān)于試驗(yàn)I的樣品D的各引物組濃度比及各探針的熒光強(qiáng)度的圖。
[0064]圖13是表示用于確認(rèn)DNA芯片分析中的熒光強(qiáng)度與基于PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量的相關(guān)關(guān)系的試驗(yàn)2的結(jié)果的圖。
[0065]圖14是表示在同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中用于探測(cè)能夠檢測(cè)出ITS區(qū)域和微管蛋白基因二者的引物組濃度的范圍的試驗(yàn)3的結(jié)果的圖。
[0066]圖15是表不用于確認(rèn)在從施設(shè)環(huán)境集米的樣品A~H中不包含的各種霉菌是否能夠通過(guò)使用了多重PCR的DNA芯片分析來(lái)檢測(cè)的試驗(yàn)4的結(jié)果的圖。
[0067]圖16是表示關(guān)于試驗(yàn)4的樣品的各引物組濃度比及各探針的熒光強(qiáng)度的圖。
[0068]圖17是表示用于確認(rèn)支孢屬菌是否能夠通過(guò)使用了多重PCR的DNA芯片分析來(lái)檢測(cè)的試驗(yàn)5的結(jié)果的圖。
[0069]圖18是表示用于確認(rèn)向PCR用反應(yīng)液中添加支孢屬菌特異性正向引物對(duì)其他菌種的檢測(cè)帶來(lái)的影響的試驗(yàn)6的結(jié)果的圖。
[0070]圖19是表示基于各種培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)試驗(yàn)的培養(yǎng)評(píng)價(jià)的圖。
[0071]圖20是表示將嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的菌落的直徑的圖。
[0072]圖21是表示將嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌在各種溫度下培養(yǎng)時(shí)的菌落的直徑的圖。
[0073]圖22是表示將嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌在各種溫度下培養(yǎng)時(shí)的菌落的照片的圖。
[0074]圖23是表示檢體1-20中的菌種的DNA芯片分析及序列分析結(jié)果的圖。
[0075]圖24是表示檢體21-40中的菌種的DNA芯片分析及序列分析結(jié)果的圖。
[0076]圖25是表示檢體45-60中的菌種的DNA芯片分析及序列分析結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0077]以下，對(duì)本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法、PCR用反應(yīng)液及霉菌檢測(cè)用載體的一個(gè)實(shí)施方式詳細(xì)進(jìn)行說(shuō)明。但是，本發(fā)明不限于以下的本實(shí)施方式及后述的實(shí)施例的具體的內(nèi)容。
[0078][霉菌的檢測(cè)方法]
[0079]本實(shí)施方式的霉菌的檢測(cè)方法，包括使包含霉菌的DNA中的靶區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)的工序，其特征在于，作為靶區(qū)域，使用ITS區(qū)域以及β-微管蛋白基因。
[0080]霉菌的種類沒(méi)有特別限定，可以將例如散囊屬菌(EuiOtium sp.)、帚狀曲霉種菌(Aspergillus penicillioides)、局限曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Restricti) >西比小尖霉(Wallemia sebi)、唯特里庫(kù)拉曲霉種菌(Aspergillus vitricola)、青霉屬菌(Penicillium sp.)、煙曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Fumigati)、黃曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Flavi)、構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Nidulantes)、尼格里復(fù)合種菌(Aspergillus Section Nigri)、黑葡萄穗霉種菌(Stachybotryschartarum)、腐皮鍵抱種菌(Fusarium solani)、支抱屬菌(Cladosporium sp.)等霉菌設(shè)定為基于本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法、PCR用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體的檢測(cè)對(duì)象霉菌。另外，除此之外，還可將尖孢鐮刀菌種菌(Fusarium oxysporum),禾谷鐮刀種菌(Fusarium graminiarum)、輪狀鍵刀霉菌種菌(Fusarium verticillioides)、終極腐霉菌種菌(Pythium ultimum)、膠抱炭疽菌種菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖抱炭疽菌(Colletotrichum acutatum)、大_輪枝菌種菌(Verticillium dahiae)、黑白輪枝菌種菌(Verticillium albo-atrum)、互隔交鏈抱霉種菌(Altemaria alternate)、紅色毛癖菌種菌(Trichophyton rubrum)、斷發(fā)毛癖菌種菌(Trichophyton tonsurans)、綠色木霉種菌(Trichoderma viride)等霉菌作為檢測(cè)對(duì)象。[0081]本實(shí)施方式的霉菌的檢測(cè)方法中的靶區(qū)域是霉菌的DNA中的擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域，可以使用特定的隔離物或基因等作為這樣的區(qū)域。本發(fā)明中，作為該靶區(qū)域，同時(shí)使用ITS (Internal Transcribed Spacer)區(qū)域和 β-微管蛋白基因二者。[0082]使包含靶區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增的方法沒(méi)有特別限定，但可以優(yōu)選使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法。[0083]PCR法中，使用包含用于使靶區(qū)域擴(kuò)增的引物組的PCR反應(yīng)液，將霉菌的DNA中的特定區(qū)域擴(kuò)增。作為PCR裝置，可以使用通常的熱循環(huán)儀等，例如可以在如下的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。[0084](a) 95 °C 10 分鐘、(b) 95 V (DNA 改性工序)30 秒、(C) 56 °C (退火工序)3O 秒、(d) 72 0C (DNA合成工序)60秒(將(b)~⑷循環(huán)40次)、(e) 72 °C 10分鐘[0085]作為確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)的方法，可以優(yōu)選使用利用電泳的方法或使用DNA芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法等。[0086]利用電泳的方法，使用例如MultiNA(R)(株式會(huì)社島津制作所制)，通過(guò)微毛細(xì)管電泳，使PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)，基于條帶的位置來(lái)確認(rèn)其大小，由此，可以判定是否得到正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。[0087]利用DNA芯片的方法是將與靶區(qū)域特異性雜交的探針預(yù)先固定化到DNA芯片，在該DNA芯片上滴加PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)識(shí)等，可以判定是否得到正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。標(biāo)識(shí)的檢測(cè)可以使用熒光掃描裝置等通常的標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置來(lái)進(jìn)行，可以通過(guò)使用例如東洋鋼鈑株式會(huì)社的B10SH0T，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。[0088]另外，標(biāo)識(shí)不限于熒光，也可以使用其他。[0089]本實(shí)施方式中，作為引物，使用用于使霉菌的DNA中的ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組、和用于使β_微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組。[0090]ITS區(qū)域是轉(zhuǎn)印成RNA后被剪切的部分。因此，與編碼區(qū)域相比時(shí)，保存性低，富于變化，但霉菌種間的類似性高，發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)的情況比較多。因此，在DNA芯片上固定多種霉菌的探針而用于霉菌的識(shí)別的情況下，作為該探針，僅使用選自ITS區(qū)域的探針時(shí)，有可能導(dǎo)致檢測(cè)精度的降低。[0091]另一方面，驗(yàn)證多種霉菌中的β_微管蛋白基因的類似性時(shí)，如圖1所示，各霉菌種獨(dú)特的序列比較多地存在，可以認(rèn)為這些區(qū)域最適于特異性高的探針設(shè)計(jì)。
[0092]使用ITS區(qū)域和β_微管蛋白基因二者作為靶區(qū)域，將廣泛種類的霉菌作為對(duì)象進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果可知，通過(guò)組合使用這些區(qū)域，能夠適當(dāng)降低假陽(yáng)性反應(yīng)。
[0093]本實(shí)施方式的霉菌的檢測(cè)方法中，作為這樣靶區(qū)域，通過(guò)使用ITS區(qū)域和β -微管蛋白基因二者，能夠高精度地檢測(cè)廣泛種類的霉菌。 [0094][PCR用反應(yīng)液]
[0095]本實(shí)施方式的PCR用反應(yīng)液，在上述的霉菌的檢測(cè)方法中用于通過(guò)PCR法進(jìn)行包含靶區(qū)域的DNA片段的擴(kuò)增的情況。作為該P(yáng)CR用反應(yīng)液，優(yōu)選使用例如含有以下的組成的反應(yīng)液。即，可以適當(dāng)使用含有核酸合成基質(zhì)(dNTPmixture(dCTP、dATP、dTTP、dGTP))、引物組、核酸合成酶(Nova Taq聚合酶等)、標(biāo)識(shí)成分(Cy5_dCTP等)、試樣的基因組DNA、緩沖液、及作為剩余的容量部分的水的PCR反應(yīng)液。需要說(shuō)明的是，作為緩沖液，可以使用例如Ampdirect (R)(株式會(huì)社島津制作所制)。
[0096]作為本實(shí)施方式的PCR用反應(yīng)液中的引物組，使用含有能夠使霉菌的DNA中的ITS區(qū)域擴(kuò)增的正向引物和反向引物的引物組、以及含有能夠使霉菌的DNA中的β -微管蛋白基因擴(kuò)增的正向引物和反向引物的引物組。
[0097]對(duì)于本實(shí)施方式的PCR用反應(yīng)液中的引物組而言，只要這樣是具有ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組和β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組的引物組，則沒(méi)有特別限定，具體而言例如可以使用以下的引物組。即，如圖2所示，作為ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組，可以適當(dāng)使用具備含有序列號(hào)I所不喊基序列的正向引物及含有序列號(hào)2所不喊基序列的反向引物的引物組。另外，作為β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組，可以適當(dāng)使用具備含有序列號(hào)3所示堿基序列的正向引物及含有序列號(hào)4所示堿基序列的反向引物的引物組。
[0098]另外，優(yōu)選使β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的濃度比為1:0.9~1:0.1。這是由于，如果這樣設(shè)定引物組的濃度比，則能夠使這些擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域同時(shí)適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增。
[0099]在此，霉菌的DNA中，ITS區(qū)域存在100個(gè)拷貝以上，相對(duì)于此，β-微管蛋白基因僅存在I個(gè)拷貝。另外，前者的利用PCR法的擴(kuò)增產(chǎn)物的尺寸為約250bp，相對(duì)于此，后者的利用PCR法的擴(kuò)增產(chǎn)物的尺寸為350~550bp。
[0100]因此，使β-微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組的濃度與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的濃度在PCR用反應(yīng)液中相同時(shí)，不能充分地得到β_微管蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，存在檢測(cè)精度降低的問(wèn)題。
[0101]相對(duì)于此，使PCR用反應(yīng)液中的ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的濃度過(guò)度降低時(shí)，本次ITS區(qū)域的擴(kuò)增效率降低。
[0102]因此，作為β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的濃度比，需要查找最佳的條件。
[0103]因此，本發(fā)明人通過(guò)驗(yàn)證各種濃度比，發(fā)現(xiàn)如果為上述濃度比，則能夠使ITS區(qū)域及β-微管蛋白基因二者適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增。特別是如果β-微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的濃度比為1:0.5~1:0.25，則將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)識(shí)，基于熒光強(qiáng)度進(jìn)行霉菌的檢測(cè)的情況下，均以大強(qiáng)度得到ITS區(qū)域與β -微管蛋白基因的熒光，因此更優(yōu)選。
[0104] 另外，在本實(shí)施方式的PCR用反應(yīng)液中，優(yōu)選包含用于使支孢屬菌特異性擴(kuò)增的引物。作為這樣的引物，可以使用含有圖2中序列號(hào)5所示堿基序列的正向引物。
[0105]在此，使用上述的ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組及β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組的情況下，關(guān)于支孢屬菌的β -微管蛋白基因，雖然通過(guò)PCR得到擴(kuò)增產(chǎn)物，但沒(méi)有充分地進(jìn)行基于從與β_微管蛋白基因互補(bǔ)的序列選擇的探針與該擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，無(wú)法適當(dāng)?shù)貦z測(cè)出支孢屬菌。
[0106]在此，關(guān)于支孢屬菌，在PCR用反應(yīng)液中追加能夠使其特異性地?cái)U(kuò)增的正向引物來(lái)進(jìn)行PCR，得到新型擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，實(shí)施例中，如后所述，將該新型擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體中進(jìn)行檢查，結(jié)果，能夠適當(dāng)?shù)貦z測(cè)出該菌種。
[0107]即，該用于使支孢屬菌特異性地?cái)U(kuò)增的正向引物，是用于擴(kuò)增β_微管蛋白基因的正向引物，與序列號(hào)4所示的反向引物成對(duì)，能夠使支孢屬菌的β_微管蛋白基因擴(kuò)增。
[0108]PCR用反應(yīng)液中的支孢屬菌特異的正向引物的終濃度優(yōu)選為0.5μ M以下，更優(yōu)選為0.125μΜ~0.5μΜ。這是由于，如果這樣設(shè)定支孢屬菌特異的正向引物的終濃度的范圍，則能夠適當(dāng)?shù)貦z測(cè)出支孢屬菌。
[0109]另外，如果使PCR用反應(yīng)液中的支孢屬菌特異的正向引物的終濃度為0.25 μ M~0.5μΜ,則能夠進(jìn)一步適當(dāng)?shù)貦z測(cè)出支孢屬菌。特別是如果使該終濃度為0.25 μ Μ，則能夠使對(duì)其他菌種的檢測(cè)帶來(lái)的影響幾乎最小，因此進(jìn)一步優(yōu)選。
[0110]上述引物組中的各引物的序列不限于上述堿基序列本身，可以使用在實(shí)現(xiàn)同一功能的范圍內(nèi)適當(dāng)變更的序列。即，可以為在各堿基序列中I個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失、被置換或加成后的序列。另外，可以為在嚴(yán)格的條件下能夠?qū)袑?duì)于各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段，進(jìn)行雜交的序列。
[0111]嚴(yán)格的條件是指形成特異的雜種、而沒(méi)有形成非特異的雜種的條件。可以列舉出例如:相對(duì)于上述引物組具有高相同性(，相同性為90%以上、優(yōu)選95%以上)的DNA與包含與上述引物組互補(bǔ)的堿基序列的DNA進(jìn)行雜交的條件。通常是指在比完全雜種的溶解溫度(Tm)低約5°C~約30°C、優(yōu)選低約10°C~約25°C的溫度下引起雜交的情況。關(guān)于嚴(yán)格的條件，可以使用 J.Sambrook 等，molecular Cloning, A Laboratory Mannual, SecondEditioN, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、特別是 11.45 節(jié) “Conditionsfor Hybridization of Oligonucleotide Probes” 中記載的條件等。
[0112][霉菌檢測(cè)用載體]
[0113]本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體，其特征在于，針對(duì)一種或二種以上霉菌中的每一種，固定了具有選自ITS區(qū)域的堿基序列的的探針以及具有選自β_微管蛋白基因的堿基序列的探針，可以使用DNA芯片等來(lái)構(gòu)成。
[0114]這樣，對(duì)于每種霉菌的種類具備與ITS區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的探針和與β_微管蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的探針二者，在這兩種探針中，通過(guò)將檢測(cè)到熒光的霉菌判定為陽(yáng)性，能夠適當(dāng)?shù)嘏懦诩訇?yáng)性反應(yīng)的判定的錯(cuò)誤。
[0115]具體而言，例如如圖3所示，各個(gè)霉菌的種類，可以使用以下的探針。
[0116]即，作為用于檢測(cè)散囊屬菌(EuiOtium sp.)的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)6或7所示的堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)8所的喊基序列的探針。
[0117]另外,作為用于檢測(cè)帚狀曲霉種菌(Aspergillus penicillioides)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)9~11所示的堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)12所示的堿基序列的探針。
[0118]另外，作為用于檢測(cè)唯特里庫(kù)拉曲霉種菌(Aspergillus vitricola)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)13或14所示的堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)15所示的堿基序列的探針。
[0119]另外，作為用于檢測(cè)局限曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Restricti)的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)16~20所示的堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)21所示的堿基序列的探針。
[0120]另外，作為用于檢測(cè)構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌(，Aspergillus Section Nidulantes)的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)22所示的堿基序列的探針以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)23所的喊基序列的探針。
[0121]另外，作為用于檢測(cè)煙曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Fumigati)的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)24所示的堿基序列的探針以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)25所的喊基序列的探針。
[0122]另外，用于檢測(cè)黃曲霉復(fù)合種菌(Aspergillus Section Flavi)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)26所示的堿基序列的探針以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)27所的喊基序列的探針。
[0123]另外,用于檢 測(cè)青霉屬菌(Penicillium sp.)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)28或29所示的堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)30~32所示的堿基序列的探針中的至少任一種。
[0124]另外,用于檢測(cè)黑葡萄穗霉種菌(Stachybotrys chartarum)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)33所示的堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)34所的喊基序列的探針。
[0125]另外，用于檢測(cè)腐皮鐮孢種菌(Fusarium solani)的探針,可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)35所示的堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)36所示的喊基序列的探針。
[0126]另外，用于檢測(cè)支孢屬菌(Cladosporium sp.)的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)37所示的堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)38或39所示的堿基序列的探針中的至少任一種。
[0127]另外，作為霉菌共同的探針，可以使用具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)40所示的堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)41所示的堿基序列的探針。
[0128]另外，可以使本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體成為分別固定了一組或二組以上的用于檢測(cè)上述各霉菌的各探針組的擔(dān)載物。
[0129]這樣，本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體通過(guò)將與各霉菌的ITS區(qū)域和β_微管蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分別結(jié)合的探針固定，使基于假陽(yáng)性反應(yīng)的判定錯(cuò)誤降低，能夠以高精度檢測(cè)廣泛的霉菌。
[0130]本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體，可以在通常的方法中使用，其方法沒(méi)有特別限定，例如可以如下使用。
[0131]首先，將添加了 0.3% SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖液(3 X SSC檸檬酸-生理鹽水)，混合到通過(guò)本實(shí)施方式的霉菌的檢測(cè)方法得到的PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物中，再滴加到本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體中。
[0132]將該霉菌檢測(cè)用載體在45°C下靜置I小時(shí)后，使用上述緩沖液從霉菌檢測(cè)用載體上沖洗沒(méi)有雜交的PCR產(chǎn)物。另外，將其置于標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置上測(cè)定熒光強(qiáng)度，由此，能夠進(jìn)行霉菌的檢測(cè)。
[0133]需要說(shuō)明的是，在本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體上固定的上述各探針，可以與上述的引物組中的各引物的序列的情況同樣地使用在實(shí)現(xiàn)同一功能的范圍內(nèi)適當(dāng)變更后的探針。即，能夠形成在各堿基序列中I個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失、被置換或被加成后的探針。另外，對(duì)于由相對(duì)于各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段而言，在嚴(yán)格的條件下能夠雜父。
[0134]另外，作為在本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體上固定的探針，也可以使用上述各探針；在各堿基序列中I個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失、被置換或被加成后的探針；或者具有對(duì)以下序列互補(bǔ)的堿基序列的探針，該序列是對(duì)于含有與各堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段而言在嚴(yán)格的條件下能夠雜交的序列。
[0135]在此，在本實(shí)施方式的霉菌的檢測(cè)方法中的通過(guò)PCR法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中，也包含具有相對(duì)于與上述探針雜交的核酸片段互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段。因此，含有相對(duì)于圖3所示的序列號(hào)6~41互補(bǔ)的堿基序列、及與它們同等的堿基序列的探針，能夠與具有相對(duì)于與上述探針雜交的核酸片段互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段雜交。
[0136]因此,將相對(duì)于圖3所不的序列號(hào)6~41互補(bǔ)的喊基序列，及含有與它們同等的堿基序列的探針固定在本實(shí)施方式的霉菌檢測(cè)用載體上時(shí)，也能夠檢測(cè)作為各自對(duì)象的霉菌。所述含有與它們同等的堿基序列的探針也就是在序列號(hào)6~41的各堿基序列中I個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失、被置換或加成后的探針、或者對(duì)于含有相對(duì)于各堿基序列相互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段而言在嚴(yán)格的條件下能夠雜交的探針
[0137]接著，對(duì)本發(fā)明的霉菌的檢查方法的一個(gè)實(shí)施方式詳細(xì)進(jìn)行說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，本實(shí)施方式的霉菌的檢查方法只要是培養(yǎng)多種霉菌，將培養(yǎng)后的多種霉菌混合，一次性提取基因組DNA，使用DNA芯片，同時(shí)并且特異性地檢出多種霉菌中的各個(gè)霉菌即可，不限于以下的實(shí)施方式及實(shí)施例的具體的內(nèi)容。
[0138]本實(shí)施方式的霉菌的檢查方法可以包括以下的工序。
[0139](I)霉菌的采集
[0140]首先，使用空氣取樣器，采集食品制造現(xiàn)場(chǎng)或臨床現(xiàn)場(chǎng)、文化財(cái)產(chǎn)的保護(hù)環(huán)境等的空氣。接著，將采集的空氣吹入在空氣取樣器用形成為條形狀的專用培養(yǎng)基等中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0141]作為該培養(yǎng)基，在實(shí)施例中，如后所述，優(yōu)選使用對(duì)嗜干性、耐干性、及嗜濕性中的任一種霉菌均能夠培養(yǎng)的M40Y、MY10G培養(yǎng)基、MY30G培養(yǎng)基等。其中，使用M40Y培養(yǎng)基時(shí)，對(duì)上述任一種性質(zhì)的霉菌均能夠高效地進(jìn)行培養(yǎng)，因此特別優(yōu)選。
[0142]另外，作為培養(yǎng)條件，優(yōu)選在23°C~27°C溫度的暗處?kù)o置約2日~7日。
[0143]需要說(shuō)明的是，通常M40Y培養(yǎng)基、MYlOG培養(yǎng)基、及MY30G培養(yǎng)基被認(rèn)為是嗜干性霉菌用的培養(yǎng)基，被認(rèn)為不適于嗜濕性霉菌培養(yǎng)。[0144]接著，一次性采集在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落，而沒(méi)有單獨(dú)地分離。另外，將采集的試樣放入裝有例如Φ0.5mm氧化鋯微珠的小瓶等中，將每個(gè)小瓶分別浸入液氮中，凍結(jié)試樣后，使用振蕩裝置等，將霉菌的細(xì)胞破碎。需要說(shuō)明的是，細(xì)胞的破壞以能夠提取DNA的方式進(jìn)行即可，也可以通過(guò)其他方法進(jìn)行。
[0145](2) DNA 的提取
[0146]作為從將霉菌的細(xì)胞破壞后的試樣中提取基因組DNA的方法，可以使用CTAB法(溴化十六烷基三甲銨，Cetyl trimethyl ammonium bromide)或使用DNA提取裝置的方法等通常的方法。
[0147](3)利用PCR法的ITS區(qū)域的擴(kuò)增
[0148]接著，在PCR反應(yīng)液中加入能夠?qū)⒏鞣N霉菌的rDNA的ITSl區(qū)域擴(kuò)增的引物組，通過(guò)PCR法，將上述試樣中的霉菌的基因組DNA中的特定區(qū)域擴(kuò)增。具體而言，作為正向引物及反向引物，可以使用序列號(hào)42、43分別所示的堿基序列的引物。另外，作為PCR裝置，也可以使用通常的循環(huán)變溫加熱器等。
[0149]作為本實(shí)施方式的PCR反應(yīng)液，優(yōu)選使用例如由以下的組成構(gòu)成的反應(yīng)液。即，可以適當(dāng)使用含有核酸合成基質(zhì)(dNTPmixture(dCTP、dATP、dTTP、dGTP)、引物組、核酸合成酶(Nova Taq聚合酶等)、標(biāo)識(shí)成分(Cy5_dCTP等)、試樣的基因組DNA、緩沖液、及作為剩余的容量部分的水的PCR反應(yīng)液。需要說(shuō)明的是，作為緩沖液，例如可以使用Ampdirect(R)(株式會(huì)社島津制作所)。
[0150]作為本實(shí)施方式的霉菌的檢查方法中的PCR反應(yīng)條件，例如優(yōu)選如下。
[0151](a) 95 °C 10 分鐘、(b)%°C (DNA 改性工序)3O 秒、(C) 56 °C (退火工序)3O 秒、(d) 72 0C (DNA合成工序)60秒(將(b)~⑷循環(huán)40次)、(e) 72 °C 10分鐘
[0152](4)利用DNA芯片的檢測(cè)
[0153]本實(shí)施方式的DNA芯片只要是將選自檢測(cè)對(duì)象的霉菌的DNA的探針固定了的芯片即可，在其他方面沒(méi)有特別限定。可以使用例如點(diǎn)型DNA芯片、合成型DNA芯片等。
[0154]具體而言，將與通過(guò)本實(shí)施方式的霉菌的檢查方法的PCR反應(yīng)液中包含的引物組而擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)域相結(jié)合的探針預(yù)先合成，將其固定到DNA芯片的基板上。例如，作為唯特里庫(kù)拉曲霉(Aspergillus vitricola)檢測(cè)用的探針,可以使用含有序列號(hào)44所示的堿基序列的探針。另外，作為帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)檢測(cè)用的探針,可以使用含有序列號(hào)45所示的堿基序列的探針。另外，作為散囊屬菌(EuiOtium sp.)檢測(cè)用的探針，可以使用含有序列號(hào)46所示的堿基序列的探針。
[0155]接著，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到DNA芯片上，檢測(cè)上述霉菌檢測(cè)用探針上雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)識(shí)。具體而言，例如可以如下進(jìn)行。
[0156]首先，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混合規(guī)定的緩沖液，滴加到DNA芯片上。
[0157]接著，將DNA芯片在45°C下靜置I小時(shí)，然后，通過(guò)規(guī)定的緩沖液從DNA芯片上沖洗沒(méi)有雜交的PCR產(chǎn)物。
[0158]另外，將DNA芯片裝在標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置上進(jìn)行標(biāo)識(shí)的檢測(cè)，判定檢測(cè)對(duì)象霉菌是否存在。需要說(shuō)明的是，作為標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置，例如，可以使用熒光掃描裝置等通常的裝置。需要說(shuō)明的是，標(biāo)識(shí)及其檢測(cè)方法不限于熒光，也可以使用其他方法。 [0159]如以上所說(shuō)明，根據(jù)本實(shí)施方式的霉菌的檢查方法，使用對(duì)嗜干性、耐干性、及嗜濕性的任一種霉菌均能夠培養(yǎng)的培養(yǎng)基，能夠同時(shí)培養(yǎng)多種霉菌。另外，將培養(yǎng)后的霉菌混合，一次性提取基因組DNA，使用DNA芯片，能夠同時(shí)并且特異性地檢出多種霉菌中的各個(gè)霉菌。
[0160]因此，無(wú)需將采集的霉菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，能夠迅速地統(tǒng)一簡(jiǎn)便地檢測(cè)多種霉菌。
[0161]實(shí)施例
[0162]以下，對(duì)使用本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法、PCR用反應(yīng)液、及霉菌檢測(cè)用載體進(jìn)行的試驗(yàn)具體地進(jìn)行說(shuō)明。
[0163](試驗(yàn)1)
[0164]本發(fā)明的霉菌的檢測(cè)方法中，為了考查通過(guò)使用多重PCR的DNA芯片分析來(lái)檢測(cè)各種霉菌時(shí)能夠?qū)TS區(qū)域和β-微管蛋白基因二者同時(shí)擴(kuò)增的、PCR用反應(yīng)液中的各引物組的濃度范圍，進(jìn)行了試驗(yàn)I。
[0165]檢測(cè)對(duì)象霉菌使用從施設(shè)環(huán)境中采集的野生霉菌。即，使用空氣取樣器采集施設(shè)環(huán)境內(nèi)的空氣，將其吹入樣品A~D的各培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)在25°C的暗處?kù)o置7日來(lái)進(jìn)行。
[0166]接著，對(duì)每個(gè)樣品分別采集在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落的一部分，分別在25°C的暗處進(jìn)行7~10日分離培養(yǎng)，將各菌落用于DNA序列分析，確認(rèn)其菌種。將其結(jié)果示于圖4。需要說(shuō)明的是，DNA序列分析委托Takara-bio株式會(huì)社通過(guò)DNA測(cè)序儀進(jìn)行。以下也同樣。
[0167]另外，對(duì)每個(gè)樣 品統(tǒng)一米集在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落，放入裝有Φ0.5mm氧化鋯微珠的小瓶中，浸入液氮來(lái)凍結(jié)試樣后，使用振蕩裝置，將霉菌的細(xì)胞破碎。
[0168]接著，對(duì)每個(gè)樣品通過(guò)DNA提取裝置提取霉菌的基因組DNA，通過(guò)PCR法，將各霉菌的ITS區(qū)域與β-微管蛋白基因同時(shí)擴(kuò)增。
[0169]此時(shí)，作為ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組，使用圖2所示的由序列號(hào)I的堿基序列構(gòu)成的正向引物(F引物)及由序列號(hào)2的堿基序列構(gòu)成的反向引物(R引物)。另外，作為β-微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組，使用圖2所示的由序列號(hào)3的堿基序列構(gòu)成的正向引物及由序列號(hào)4的堿基序列構(gòu)成的反向引物。需要說(shuō)明的是，均使用由Operon Technologies株式會(huì)社合成的引物組。
[0170]另外,作為PCR用反應(yīng)液,關(guān)于樣品A~D分別使用Ampdirect(R)(株式會(huì)社島津制作所制)，制作如下組成的PCR用反應(yīng)液20 μ I。
[0171]1.Ampdirect (G / Crich) 4.0 μ I
[0172]2.Ampdirect (addition-4) 4.0 μ I
[0173]3.dNTPmixl.0μ I
[0174]4.Cy-5dCTP0.2 μ I
[0175]5.ITSl-Fw 引物(10μΜ)1.0μ I
[0176]6.ITSl-Rv 引物(10μΜ)1.0μ I
[0177]7.BtF 引物(10μΜ)1.0μ I
[0178]8.BtR 引物(10μΜ)1.0μ I
[0179]9.模板DNA (對(duì)每個(gè)樣品A~D分別)I.0 μ I
[0180]10.Nova Taq 聚合酶 0.2 μ I[0181]11.水(加水至整體達(dá)到20.0 μ I)
[0182]另外，作為ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物，制作分別以如下比例配合正向引物及反向引物、且其他方面與上述同樣的4種PCR用反應(yīng)液。
[0183]引物(9μΜ)0.9μ1
[0184]引物(8μΜ)0.8μ1
[0185]引物(5μΜ)0.5μ1
[0186]引物(2.5 μ Μ) 0.25 μ I
[0187]引物(1.25 μ Μ) 0.125 μ I
[0188]引物(1μΜ)Ο.ΙμΙ
[0189]引物(0.625 μ Μ) 0.0625 μ I
[0190]如上所述，作為β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的終濃度比，每個(gè)樣品A~D分別制作以下的5種，分別進(jìn)行試驗(yàn)。
[0191](?)0.5μΜ:0.5μΜ
[0192](ii)0.5μΜ:0.45μΜ
[0193](iii)0.5μΜ:0.40μΜ
[0194](iv)Ο.5 μ M:0.25 μ M
[0195](ν)0.5μΜ:0.125 μ M
[0196](νi) 0.5 μ M:0.0625 μ M
[0197](vii)0.5μΜ:0.050 μ M
[0198](viii)0.5μΜ:0.03125μΜ
[0199]使用上述各PCR用反應(yīng)液，通過(guò)核酸擴(kuò)增裝置(TaKaRa PCR Thermal CyclerDice (R)Gradient Takara-bio株式會(huì)公司制)，在如下條件下進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。
[0200](a) 95 °C 10 分鐘
[0201](b) % °C 3O 秒
[0202](C) 56 °C 3O 秒
[0203](d) 72 0C 60 秒(將(b)~(d)循環(huán) 40 次)
[0204](e) 72 °C 10 分鐘
[0205]在DNA芯片上，使用基因硅⑵(東洋鋼鈑株式會(huì)公司制)，將圖3所示的探針中的以下探針固定后使用。
[0206]〈選自ITS區(qū)域的探針>
[0207](I)散囊屬菌序列號(hào)6、7
[0208](2)帚狀曲霉種菌序列號(hào)9~11
[0209](3)唯特里庫(kù)拉曲霉種菌序列號(hào)13
[0210](4)局限曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)16~20
[0211](5)構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)22
[0212](7)黃曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)26
[0213](8)青霉屬菌序列號(hào)28
[0214](11)支孢屬菌序列號(hào)37
[0215](12)霉菌共同序列號(hào)40[0216]〈選自β_微管蛋白基因的探針〉
[0217](I)散囊屬菌序列號(hào)8
[0218](2)帚狀曲霉種菌序列號(hào)12
[0219](3)唯特里庫(kù)拉曲霉種菌序列號(hào)15
[0220](4)局限曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)21
[0221](5)構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)23
[0222](7)黃曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)27
[0223](8)青霉屬菌序列號(hào)30
[0224](12)霉菌共同序列號(hào)41
[0225]接著，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混合緩沖液(3 X SSC檸檬酸-生理鹽水+0.3 % SDS)，在94°C下加熱5分鐘，滴加到上述DNA芯片上。
[0226]將該DNA芯片在45°C下靜置I小時(shí)，使用上述緩沖液從DNA芯片上沖洗沒(méi)有雜交的PCR產(chǎn)物。
[0227]接著,將DNA芯片裝在標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置(GenePix4100A molecular Devices公司制)上，測(cè)定各探針中的熒 光強(qiáng)度，對(duì)每個(gè)引物組的濃度比計(jì)算出ITS區(qū)域用探針中的熒光強(qiáng)度、及β-微管蛋白基因用探針中的熒光強(qiáng)度的平均值。將其結(jié)果示于圖5~圖8。圖5示出了關(guān)于使用樣品A時(shí)的引物組的各種濃度比的熒光強(qiáng)度，圖6示出了關(guān)于使用樣品B時(shí)的引物組的各種濃度比的熒光強(qiáng)度，圖7示出了關(guān)于使用樣品C時(shí)的引物組的各種濃度比的熒光強(qiáng)度，圖8示出了關(guān)于使用樣品D時(shí)的引物組的各種濃度比的熒光強(qiáng)度。
[0228]另外，圖9~圖12分別示出了關(guān)于使用樣品A~D時(shí)的引物組的各種濃度比的每個(gè)探針的熒光強(qiáng)度。需要說(shuō)明的是，圖5~圖8中的“N”分別表示圖9~圖12中的探針數(shù)。圖15中也同樣。
[0229](試驗(yàn)2)
[0230]為了確認(rèn)DNA芯片分析中的熒光強(qiáng)度與利用PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)行了試驗(yàn)2。
[0231]具體而言，關(guān)于試驗(yàn)I的樣品B、C分別使用β_微管蛋白基因用引物組的終濃度與ITS區(qū)域用引物組的終濃度之比為如下的5種PCR用反應(yīng)液，與試驗(yàn)I同樣地進(jìn)行PCR。
[0232](泳道1)0.5μΜ:0.5μΜ
[0233](泳道2) 0.5 μ M:0.25 μ M
[0234](泳道3) 0.5 μ M:0.125 μ M
[0235](泳道4)0.5μ M:0.0625 μ M
[0236]Ο}^?5)0.5μΜ:0.03125μΜ
[0237]另外，使用MultiNA(R)(株式會(huì)社島津制作所制)對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。將其結(jié)果示于圖13。
[0238]如該圖所示，在樣品B中，關(guān)于β -微管蛋白基因，泳道I的條帶淺淺地顯示，泳道2條帶略濃顯示，泳道3~5的條帶濃顯示。另外，關(guān)于ITS區(qū)域，泳道1、2的條帶濃顯示，泳道3條帶略濃顯示，泳道4、5的條帶薄顯示。其結(jié)果，與圖6所示的樣品B的DNA芯片分析中的熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)。
[0239]另外，在樣品C中，關(guān)于β -微管蛋白基因，泳道1、2的條帶淺淺地顯示，泳道3~5的條帶相對(duì)于較濃地顯示。另外，關(guān)于ITS區(qū)域，泳道I~3的條帶濃顯示，泳道4、5的條帶淺淺地顯示。其結(jié)果，與圖7所示的樣品C的DNA芯片分析中的熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)。
[0240]由上確認(rèn)了，在DNA芯片分析中的熒光強(qiáng)度與利用PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量之間具有相關(guān)關(guān)系。
[0241](試驗(yàn)3)
[0242]為了確認(rèn)能夠同時(shí)檢測(cè)ITS區(qū)域和微管蛋白基因二者的引物組濃度，使用試驗(yàn)I和單獨(dú)的樣品，再次進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。 [0243]檢測(cè)對(duì)象霉菌與試驗(yàn)I同樣地使用將從施設(shè)環(huán)境中采集的野生霉菌吹入樣品E~H的各培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)后的霉菌。將該樣品E~H的培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落分離培養(yǎng)，將各菌落用于DNA序列分析，確認(rèn)其菌種。將其結(jié)果示于圖4。
[0244]另外，對(duì)每個(gè)樣品一次性采集在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落，將霉菌的細(xì)胞破碎，提取基因組DNA，通過(guò)PCR法將各霉菌的ITS區(qū)域與微管蛋白基因擴(kuò)增。
[0245]此時(shí)，引物與試驗(yàn)I同樣地使用:圖2所示的由序列號(hào)I及序列號(hào)2的堿基序列構(gòu)成的ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組、和由序列號(hào)3及序列號(hào)4的堿基序列構(gòu)成的β -微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組。
[0246]另外，作為PCR用反應(yīng)液,對(duì)于樣品E~H分別使用Ampdirect(R)(株式會(huì)社島津制作所制)，制作如下組成的反應(yīng)液20 μ I。
[0247]1.Ampdirect (G / Crich) 4.0 μ I
[0248]2.Ampdirect (addition-4) 4.0 μ I
[0249]3.dNTPmixl.0 μ I
[0250]4.Cy-5dCTP0.2 μ I
[0251]5.ITSl-Fw 引物(5μΜ)0.5μ I
[0252]6.ITSl-Rv 引物(5μΜ)0.5μ I
[0253]7.BtF 引物(10μΜ)1.0μ I
[0254]8.BtR 引物(10μΜ)1.0μ I
[0255]9.模板DNA (對(duì)每個(gè)樣品E~H分別)1.0 μ I
[0256]10.Nova Taq 聚合酶 0.2 μ I
[0257]11.水(加水至整體達(dá)到20.0ul)
[0258]另外，作為PCR用反應(yīng)液，對(duì)于樣品E~H分別制作使ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物如如下、其他組成與上述相同的反應(yīng)液20 μ I。
[0259]ITSl-Fw 引物(2.5μ Μ) 2.5μ M
[0260]ITSl-Rv 引物(2.5μΜ)2.5μΜ
[0261]這樣，作為β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的終濃度比，對(duì)每個(gè)樣品制作0.5μΜ:0.25μΜ和0.5μΜ:0.125μΜ這2種PCR用反應(yīng)液，分別進(jìn)行試驗(yàn)。PCR的反應(yīng)條件與試驗(yàn)I同樣。
[0262]另外，在DNA芯片上固定圖3所示的探針中的以下的探針后使用。關(guān)于其他方面，與試驗(yàn)I同樣操作，測(cè)定探針中的熒光強(qiáng)度，對(duì)每個(gè)引物組的濃度比計(jì)算出ITS區(qū)域用探針中的熒光強(qiáng)度、及β-微管蛋白基因用探針中的熒光強(qiáng)度的平均值。將其結(jié)果示于圖14。需要說(shuō)明的是，該圖中的“N”分別表示探針數(shù)Χ3次(試驗(yàn)次數(shù))。[0263]〈選自ITS區(qū)域的探針>
[0264](1)散囊屬菌序列號(hào)6
[0265](2)帚狀曲霉種菌序列號(hào)9
[0266](8)青霉屬菌序列號(hào)29
[0267](11)支孢屬菌序列號(hào)37
[0268](12)霉菌共同序列號(hào)40
[0269]〈選自微管蛋白基因的探針〉
[0270](1)散囊屬菌序列號(hào)8
[0271](2)帚狀曲霉種菌序列號(hào)12
[0272](4)局限曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)21
[0273](12)霉菌共同序列號(hào)41
[0274]參照?qǐng)D14中的樣品E~H時(shí)，與β -微管蛋白基因用引物組的終濃度與ITS區(qū)域用引物組的終濃度之比為0.5μΜ:0.25μΜ(1:1 / 2)的情況相比，0.5 μ M:0.125 μ M(1:1 / 4)的情況下ITS區(qū)域和β_微管蛋白基因二者的探針的熒光強(qiáng)度均增大。
[0275]因此，為了基于這兩者的檢測(cè)結(jié)果判定霉菌是否存在，可以認(rèn)為將β_微管蛋白基因用引物組終濃度與ITS區(qū)域用引物組終濃度之比設(shè)為0.5 μ M:0.125 μ M是最佳的。
[0276](試驗(yàn)4)
[0277]檢驗(yàn)以從施設(shè)環(huán)境集采的樣品A~H中包含的不是野生霉菌的各種霉菌作為對(duì)象的情況下，是否能夠通過(guò)本發(fā)明的將ITS區(qū)域及β-微管蛋白基因作為靶區(qū)域的霉菌的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)。
[0278]作為檢測(cè)對(duì)象霉菌，將以下的4種菌株I~4混合使用。
[0279]1.煙曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株 N0.JCM10253
[0280]2.腐皮鍵抱霉菌(Fusarium solani)菌株 N0.NBRC5232
[0281]3.黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)菌株 N0.NBRC5369
[0282]4.球抱枝抱(Cladsoporium sphaerospermum)菌株 N0.JCM11787 需要說(shuō)明的是，上述菌株從以下的機(jī)關(guān)獲得。
[0283]JCM:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所生物資源中心微生物材料開(kāi)發(fā)室(JapanCollection of Microorganisms)
[0284]NBRC:獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物工程本部生物遺傳資源部門(NITE Biological Resource Center)
[0285]將這些菌株接種在培養(yǎng)基上，在25°C的暗處?kù)o置7日培養(yǎng)后，一次性采集各菌株的霉菌的菌落，與試驗(yàn)I同樣地提取霉菌的基因組DNA，通過(guò)PCR法將各霉菌的ITS區(qū)域與β-微管蛋白基因同時(shí)擴(kuò)增。
[0286]此時(shí)，與試驗(yàn)3同樣地制作β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的終濃度比為0.5μΜ:0.25μΜ、和0.5μΜ:0.125μΜ這2種PCR用反應(yīng)液。另外，在各PCR用反應(yīng)液中，對(duì)于試樣的DNA而言，分別含有菌株I~4各1.0 μl合計(jì)4.0 μl。另外，通過(guò)各個(gè)PCR用反應(yīng)液將各霉菌的ITS區(qū)域與β -微管蛋白基因擴(kuò)增。
[0287]另外，在DNA芯片上固定圖3所示的探針中的以下的探針后使用。
[0288]另外，使利用PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交，測(cè)定探針中的熒光強(qiáng)度，對(duì)每個(gè)引物組的濃度比計(jì)算出ITS區(qū)域用探針中的熒光強(qiáng)度、及β-微管蛋白基因用探針中的熒光強(qiáng)度的平均值。關(guān)于其他方面，與試驗(yàn)I同樣地進(jìn)行。將其結(jié)果示于圖15。另外，圖16中示出了每個(gè)引物組的濃度比以及每個(gè)探針的熒光強(qiáng)度。
[0289]選自ITS區(qū)域的探針>
[0290](6)煙曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)24
[0291](9)黑葡萄穗霉種菌序列號(hào)33
[0292](10)腐皮鐮孢種菌序列號(hào)35
[0293](11)支孢屬菌序列號(hào)37
[0294](12)霉菌共同序列號(hào)40
[0295]〈選自微管蛋白基因的探針〉
[0296](6)煙曲霉復(fù)合種菌序列號(hào)25
[0297](9)黑葡萄穗霉種菌序列號(hào)34
[0298](10)腐皮鐮孢種菌序列號(hào)36
[0299](12)霉菌共同序列號(hào)41
[0300]參照?qǐng)D15時(shí)，關(guān)于β -微管蛋白基因用引物組的濃度與ITS區(qū)域用引物組的終濃度之比為0.5“]?:0.254]\1(1:1 / 2)及0.5μ M:0.125μΜ(1:1 / 4)的任一種情況，ITS 區(qū)域用探針和β_微管蛋白基因用探針二者中的熒光強(qiáng)度顯示出對(duì)檢測(cè)充分的值。
[0301]因此確認(rèn)了，對(duì)于上述4種菌株I~4，能夠通過(guò)本發(fā)明的將ITS區(qū)域及β -微管蛋白基因作為靶區(qū)域的霉菌的檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定。
[0302]需要說(shuō)明的是，關(guān)于球孢枝孢菌，在β_微管蛋白基因用探針中，無(wú)法測(cè)定熒光。因此，對(duì)能夠檢測(cè)支孢屬菌的方法進(jìn)行研究，進(jìn)行以下的試驗(yàn)5、6。
[0303](試驗(yàn)5)
[0304]試驗(yàn)4中，如上所述，在使用β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組(序列號(hào)3、4)的情況下，關(guān)于球孢枝孢菌，在β_微管蛋白基因用探針中，沒(méi)有檢測(cè)到熒光。
[0305]另外，試驗(yàn)4中，在DNA芯片上固定能夠與β -微管蛋白基因互補(bǔ)結(jié)合的探針，在該探針中，沒(méi)有檢測(cè)到熒光的理由不明確。
[0306]另外，設(shè)計(jì)支孢屬菌專用的新型β_微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物(序列號(hào)5)，使用包括該引物和上述反向引物(序列號(hào)4)的引物組，將球孢枝孢菌的β_微管蛋白基因擴(kuò)增，進(jìn)行用于確認(rèn)在β_微管蛋白基因用探針中是否檢測(cè)到熒光的試驗(yàn)。
[0307]作為檢測(cè)對(duì)象霉菌，將與試驗(yàn)4相同的4種菌株I~4混合使用。
[0308]另外，作為PCR用反應(yīng)液，制作β_微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的終濃度比為0.5 μ M:0.25 μ M和0.5 μ M:0.125 μ M的反應(yīng)液，并且對(duì)它們分別制作以終濃度達(dá)到O μ Μ、0.5 μ Μ、0.25 μ Μ、0.125 μ M的方式添加了支孢屬菌專用的β -微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物的8種PCR用反應(yīng)液。
[0309]具體而言，使用Ampdirect (R)(株式會(huì)社島津制作所制)，制作如下組成的反應(yīng)液20 μ 1，與試驗(yàn)I同樣操作，將各霉菌的ITS區(qū)域與β-微管蛋白基因擴(kuò)增。
[0310]1.Ampdirect (G / Crich) 4.0 μ I[0311 ] 2.Ampdirect (addition-4) 4.0 μ I[0312] 3.dNTPmixl.0 μ I[0313]4.Cy-5dCTP0.2 μ I
[0314]5.1TSl-Fw 引物(5 μ Μ, 2.5 μ Μ) 0.5 μ 1,0.25 μ I
[0315]6.1TSl-Rv 引物(5 μ Μ, 2.5 μ Μ) 0.5 μ 1,0.25 μ I
[0316]7.BtF 引物(10μΜ)1.0μ I
[0317]8.BtR 引物(ΙΟμΜ)Ι.Ομ I
[0318]9.ClaS-beta2 (O μ Μ, 10 μ Μ, 5 μ Μ, 2.5 μ Μ) O μ I, 1.0 μ 1,0.5 μ 1,0.25 μ I
[0319]10.模板 DNA (菌株 I ~4 各 1.0 μ I) 4.0 μ I
[0320]11.NovaTaq 聚合酶 0.2 μ I
[0321]12.水(加水至整體達(dá)到20.0 μ I)
[0322]在DNA芯片上僅固定圖3所示的探針中對(duì)的球孢枝孢菌特異性的探針(序列號(hào)39)后使用。另外，關(guān)于其他方面，與試驗(yàn)I同樣操作，使利用PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交，測(cè)定該探針中的熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖17。
[0323]如圖17所示可知，在微管蛋白基因用引物組的濃度與ITS區(qū)域用引物組的終濃度之比為 0.5μΜ :0.25 μ M(1:1 / 2)~0.5μΜ:0.125μΜ(1:1 / 4)的情況下，并且特別是將支孢屬菌專用正向引物的終濃度設(shè)為0.5 μ M~0.25 μ M的情況下，對(duì)于支孢屬菌得到高熒光強(qiáng)度。
[0324](試驗(yàn)6)
[0325]針對(duì)試驗(yàn)5中使用的支孢屬菌專用正向引物(序列號(hào)5)對(duì)球孢枝孢菌特異性的探針(序列號(hào)39)以外的探針中的熒光強(qiáng)度帶來(lái)的影響進(jìn)行驗(yàn)證。
[0326]作為檢測(cè)對(duì)象霉菌，將與試驗(yàn)4相同的4種菌株I~4混合使用。
[0327]另外，作為PCR用反應(yīng)液，制作使β-微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組與ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組的終濃度比為0.5μΜ:0.125 4 1、并且以終濃度達(dá)到0 4 1、0.5 4 11、0.25 μ M的方式添加了支孢屬菌專用的β -微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物的3種PCR用反應(yīng)液。
[0328]具體而言，使用Ampdirect (R)(株式會(huì)社島津制作所制)，制作如下組成的反應(yīng)液20 μ 1，與試驗(yàn)I同樣操作，將各霉菌的ITS區(qū)域與β-微管蛋白基因擴(kuò)增。
[0329]1.Ampdirect (G / Crich) 4.0 μ I
[0330]2.Ampdirect (addition-4) 4.0 μ I
[0331]3.dNTPmixl.0 μ I
[0332]4.Cy-5dCTP0.2 μ I
[0333]5.1TSl-Fw 引物(2.5 μ Μ) 0.25 μ I
[0334]6.ITSl-Rv 引物(2.5 μ Μ) 0.25 μ I
[0335]7.BtF 引物(ΙΟμΜ)Ι.Ομ I
[0336]8.BtR 引物(ΙΟμΜ)Ι.Ομ I
[0337]9.ClaS-beta2 (O μ Μ, 10 μ Μ, 5 μ Μ) O μ I, 1.0 μ 1,0.5 μ I
[0338]10.模板 DNA (菌株 I ~4 各 1.0 μ I) 4.0 μ I
[0339]11.NovaTaq 聚合酶 0.2 μ I
[0340]12.水(加水至整體達(dá)到20.0ul)
[0341]另外，在DNA芯片上固定圖3所示的探針中的與試驗(yàn)4相同的菌株I~4的探針后使用。關(guān)于其他方面，與試驗(yàn)I同樣操作，使利用PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交。[0342]另外，測(cè)定各探針中的熒光強(qiáng)度，對(duì)支孢屬菌專用的β_微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物的每個(gè)濃度，計(jì)算出ITS區(qū)域用探針中的熒光強(qiáng)度、及β-微管蛋白基因用探針中的熒光強(qiáng)度的平均值。將其結(jié)果示于圖18。
[0343]如圖18所示，通過(guò)將支孢屬菌專用β_微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物加入多重PCR用反應(yīng)液中，球孢枝孢菌特異性的探針以外的選自β_微管蛋白的探針的熒光強(qiáng)度降低。關(guān)于該熒光強(qiáng)度的降低的程度，與支孢屬菌專用β_微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物的濃度為0.5μ M的相比，0.25 μ M的更輕微。因此可知，支孢屬菌專用微管蛋白基因擴(kuò)增用正向引物的濃度為0.25 μ M是適當(dāng)?shù)摹?br> [0344]接著，對(duì)基于本發(fā)明的霉菌的檢查方法的霉菌檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0345](試驗(yàn)7:基于各種培養(yǎng)基組成的水分活性值的培養(yǎng)試驗(yàn))
[0346]在PDA(PotatoDextrose Agar)培養(yǎng)基和MY(Malt+Yeast)培養(yǎng)基中添加糖等，制作由示出了各種水分活性值的培養(yǎng)基組成構(gòu)成的各種培養(yǎng)基，培養(yǎng)嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 [0347]1.培養(yǎng)基的制作方法
[0348](I)PDA 培養(yǎng)基
[0349]在PDA (DIFC0公司制)中以各種比例添加葡萄糖(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)和/或者蔗糖(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)，在IL的離子交換水中混懸，在高壓釜中熔解后，分注到培養(yǎng)皿中來(lái)制作。需要說(shuō)明的是，在培養(yǎng)皿分注前，為了防止細(xì)菌增殖，添加氯霉素(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)以達(dá)到最終濃度50ppm。關(guān)于MY培養(yǎng)基也同樣。
[0350]⑵MY培養(yǎng)基
[0351]在以下的MY中以各種比例添加蔗糖(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)、葡萄糖、瓊脂(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)及甘油中的至少任一種，在100ml的離子交換水中混懸，在高壓釜中熔解后，分注到培養(yǎng)皿中來(lái)制作。
[0352]MY:麥芽(Malt Extract, DIFCO 公司制)+酵母(Yeast Extract, DIFCO 公司制)
[0353]2.培養(yǎng)基的水分活性值的測(cè)定
[0354]關(guān)于用于實(shí)際培養(yǎng)的培養(yǎng)基的規(guī)定量，使用R0TR0NIC水分活性測(cè)定裝置(GSICreos公司制)，在專用密閉容器內(nèi)測(cè)定其水分活性值。
[0355]3.培養(yǎng)評(píng)價(jià)
[0356]使用通過(guò)上述制作方法制作的各種培養(yǎng)基(圖19的實(shí)施例1-10、參考例1-6)，將嗜干性霉菌(Eurotium herbariorum)、耐干性霉菌(A.niger)、嗜濕性霉菌(Fusarium sp.)在25°C下在暗處培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定得到的菌落的直徑。將培養(yǎng)后的菌落的直徑為IOmm以上設(shè)為〇，將低于IOmm設(shè)為X。將其結(jié)果示于圖19。
[0357]如該圖所示可知，使用實(shí)施例1-10的各種培養(yǎng)基的情況下，嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌均充分地繁殖。另一方面可知，使用參考例1-6的各種培養(yǎng)基的情況下，存在沒(méi)有充分繁殖的菌種。因此可知，為了同時(shí)培養(yǎng)多種菌種，優(yōu)選水分活性值低于1.0且0.90以上、并且糖濃度為5%~50%的范圍。
[0358](試驗(yàn)8:基于各種培養(yǎng)基的培養(yǎng)試驗(yàn))
[0359]使用圖19所示的參考例1、2、4_6及實(shí)施例7的6種培養(yǎng)基，將各種霉菌在25°C、暗處培養(yǎng)168小時(shí)，測(cè)定得到的菌落的直徑。[0360]作為供試菌種，使用以下的14種菌種。將結(jié)果示于圖20。其中，1-4的供試菌種為嗜干性的霉菌，5-10的供試菌種為耐干性的霉菌，11-14的供試菌種為嗜濕性的霉菌。需要說(shuō)明的是，這些供試菌種是從環(huán)境中單獨(dú)采集并鑒定而得到的，為了方便提供其編號(hào)。
[0361]1.帚狀曲霉(A.penicillioides, K-7-4)
[0362]2.局限曲霉(A.restrictus, 1-2-1)
[0363]3.臘葉散囊菌(Eurotium herbariorum, \ 2-1)
[0364]4.西比小尖霉(Wallemia sebi，KSS-1127)
[0365]5.黃曲霉(A.flavus, B-3-3)
[0366]6.煙曲霉(A.fumigatus，KSS-1126)
[0367]7.黑曲霉(A.niger, A-1-1)
[0368]8.雜色曲霉(A.versicolor, 4 3-1)
[0369]9.光抱青霉(Penicillium glabrum, B-4-3)
[0370]10.皺裙青霉(P.rugulosum, E-2-3)
[0371]11.球抱枝抱 菌(Cladosporium.sphaerospermum, 1-4-2)
[0372]12.枝狀枝抱菌(C.cladosporioides, A-2-1)
[0373]13.鍵刀菌屬菌(Fusarium sp., B5-3-C)
[0374]14.葡萄穗霉屬菌(Stachybotrys sp., KSS-1125)
[0375]如圖20所示可知，根據(jù)實(shí)施例7的培養(yǎng)基(M40Y)，能夠形成適于生長(zhǎng)的濕度不同的多種霉菌的菌落，上述1-14的所有菌種充分地繁殖。
[0376]這樣可知，如果使用實(shí)施例7的培養(yǎng)基，則能夠?qū)㈥P(guān)于最佳濕度的性質(zhì)不同的多種霉菌在相同的培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)。
[0377](試驗(yàn)9:基于各種溫度的培養(yǎng)試驗(yàn))
[0378]使用實(shí)施例7中使用的M40Y培養(yǎng)基，在各種溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定得到的菌落的直徑。供試菌種與試驗(yàn)I同樣地使用包含嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌的14種，在暗處培養(yǎng)168小時(shí)。將其結(jié)果示于圖21。另外，關(guān)于3、8、13的菌種，圖22中示出了菌落的照片。
[0379]如圖21的實(shí)施例11-13所示可知，培養(yǎng)溫度為23°C~27°C的范圍時(shí)，嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜濕性霉菌均充分地繁殖。另一方面，如參考例7-9所示可知，培養(yǎng)溫度為30°C~35°C的范圍時(shí)，存在不能生長(zhǎng)的菌種。因此可知，為了同時(shí)培養(yǎng)多種菌種，優(yōu)選將培養(yǎng)溫度設(shè)為25°C ±2°C的范圍。
[0380](試驗(yàn)10=DNA芯片分析試驗(yàn))
[0381]使用實(shí)施例7中使用的M40Y培養(yǎng)基，培養(yǎng)各種霉菌，將得到的菌落混合，一次性提取基因組DNA，通過(guò)PCR法將ITSl區(qū)域擴(kuò)增，通過(guò)DNA芯片檢查擴(kuò)增產(chǎn)物中是否包含檢測(cè)對(duì)象霉菌。另外，為了驗(yàn)證利用DNA芯片的檢查結(jié)果，進(jìn)行了 DNA序列分析。具體而言，如下進(jìn)行。
[0382]首先，作為實(shí)施例7中使用的使用了 M40Y培養(yǎng)基的檢體，準(zhǔn)備N0.1至N0.60的60個(gè)檢體。接著，使用空氣取樣器，從通常環(huán)境中采集空氣，吹入上述各檢體進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)在25°C的暗處?kù)o置7日來(lái)進(jìn)行。
[0383]接著，對(duì)于每個(gè)檢體將在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落用于DNA序列分析，因此，單獨(dú)地采集各菌落的一部分，分別在25°C的暗處進(jìn)行分離培養(yǎng)7-10日。
[0384] 另外，對(duì)每個(gè)檢體一次性采集在培養(yǎng)基上生成的各種霉菌的菌落，放入裝有Φ 0.5mm氧化鋯微珠的小瓶中，浸入液氮中凍結(jié)試樣后，使用振蕩裝置，將霉菌的細(xì)胞破碎。
[0385]接著，對(duì)每個(gè)檢體通過(guò)DNA提取裝置提取霉菌的基因組DNA，通過(guò)PCR法將各霉菌的ITS區(qū)域擴(kuò)增。
[0386]具體而言,作為PCR反應(yīng)液,使用Ampdirect (R)(株式會(huì)社島津制作所制)，制作如下組成的反應(yīng)液20 μL。
[0387]1.Ampdirect addition (G / Crich) 4.0 μ I
[0388]2.Ampdirect (addition-4) 4.0 μ I
[0389]3.dNTPmixturel.0 μ I
[0390]4.Cy5-dCTP0.2 μ I
[0391]5.1TSl區(qū)域擴(kuò)增用正向引物(10 μ Μ,序列號(hào)42,由Sigma-Aldrich公司合成)1.0μ I
[0392]6.1TSl區(qū)域擴(kuò)增用反向引物(10 μ Μ,序列號(hào)43,由Sigma-Aldrich公司合成)1.0μ I
[0393]7.試樣的基因組DNA1.0 μ I
[0394]8.NovaTaq 聚合酶 0.2 μ I
[0395]9.水(加水至整體達(dá)到20.0 μ I)
[0396]使用該P(yáng)CR反應(yīng)液，通過(guò)核酸擴(kuò)增裝置(TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R)Gradient Takara-bio株式會(huì)公司制)，在如下條件下進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。
[0397]1.95℃ 10 分鐘
[0398]2.95℃ 30 秒
[0399]3.56℃ 30 秒
[0400]4.72 °C 60 秒(將 2 ~4 循環(huán) 40 次)
[0401]5.72 °C 10 分鐘
[0402]在DNA芯片上使用基因硅(R)(東洋鋼鈑株式會(huì)公司制)而在其上固定含有序列號(hào)44、序列號(hào)45、序列號(hào)46所示的堿基序列的探針后使用。這些分別為唯特里庫(kù)拉曲霉(Aspergillus vitricola)檢測(cè)用的探針、帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)檢測(cè)用的探針、及散囊屬菌(EuiOtium sp.)檢測(cè)用的探針。
[0403]接著，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混合緩沖液(3 X SSC檸檬酸-生理鹽水+0.3 % SDS)，滴加到上述DNA芯片上。
[0404]將該DNA芯片在45°C下靜置I小時(shí)，使用上述緩沖液從微陣列上沖洗沒(méi)有雜交的PCR產(chǎn)物。
[0405]接著，將DNA芯片裝在標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置(基因硅專用掃描B10SH0T東洋鋼鈑株式會(huì)公司制)中，測(cè)定各探針的熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖23-25。
[0406]另外，進(jìn)行每個(gè)檢體中包含的菌種的DNA序列分析，因此，如上所述從將每個(gè)菌落分離培養(yǎng)而得到的菌種中提取基因組DNA，通過(guò)PCR法得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0407]此時(shí)，引物組使用含有序列號(hào)42及43所示的堿基序列的引物組，并且核酸合成酶中使用TAKARA ExTaq聚合酶。另外，核酸擴(kuò)增裝置使用TaKaRa PCR Thermal CyclerDice (R) Gradient (Takara-bio株式會(huì)公司制)，此外與上述同樣地操作，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0408]將通過(guò)該P(yáng)CR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物、和含有序列號(hào)47及48所示的堿基序列的引物組作為序列用引物，委托Takara-bio株式會(huì)社，通過(guò)DNA測(cè)序儀進(jìn)行ITSl區(qū)域的序列分析。其結(jié)果，如圖23-25所示，由各檢體最大確認(rèn)4個(gè)菌種。
[0409]在圖23-25的“DNA芯片分析(探針熒光強(qiáng)度)”中，將被認(rèn)為是陽(yáng)性的部分用粗框包圍。這些在“通過(guò)ITS序列分析確認(rèn)的檢體中包含的菌種”中分別表示相同的菌種。
[0410]需要說(shuō)明的是，基于通過(guò)ITS序列分析可知包含耐干性霉菌(Penicillium sp.)、及嗜濕性霉菌(Cladosporium sp.)的檢體N0.3，使用將Penicillium sp檢測(cè)用探針及Cladosporium sp檢測(cè)用探針固定的DNA芯片，與上述同樣操作，通過(guò)標(biāo)識(shí)檢測(cè)裝置測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果確認(rèn)檢測(cè)出這些菌種(Penicillium sp., Cladosporium sp.)。
[0411]因此可知，通過(guò)本發(fā)明的霉菌的檢查方法，將多種霉菌在相同的培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)的情況下，能夠?qū)⒏髅咕禺愋缘貦z測(cè)。
[0412]本發(fā)明不限于以上的實(shí)施方式和實(shí)施例，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，當(dāng)然可以實(shí)施各種變更。
[0413]例如，關(guān)于上述試驗(yàn)的PCR用反應(yīng)液中的ITS區(qū)域擴(kuò)增用引物組及β-微管蛋白基因擴(kuò)增用引物組以外的成分，可以適當(dāng)變更。另外，只要為使用這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)象霉菌的檢測(cè)的方法，可以不是使用如上所述的DNA芯片進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法，而是通過(guò)基于電泳的檢測(cè)、電流檢測(cè)方式等其他檢測(cè)方式的DNA芯片來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法等。
[0414]另外，上述實(shí)施例中，作為培養(yǎng)基使用Μ40y等，但不限于這些，可以進(jìn)行使用水分活性值低于1.0且0.90以上、并且糖濃度為5%~50%的固體培養(yǎng)基以外的固體培養(yǎng)基等適當(dāng)變更。
[0415]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0416]本發(fā)明在環(huán)境檢查、食品檢查、免疫學(xué)的環(huán)境檢查、臨床試驗(yàn)、家畜衛(wèi)生等中特異性并且多重地檢測(cè)多種霉菌的情況下能夠適當(dāng)?shù)乩?。另外，可以適用于食品制造現(xiàn)場(chǎng)、臨床現(xiàn)場(chǎng)、文化財(cái)產(chǎn)的保護(hù)環(huán)境等中的霉菌的檢查。
【權(quán)利要求】
1.一種霉菌的檢測(cè)方法，包括使霉菌的DNA中的包含靶區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增，確認(rèn)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的工序，其特征在于， 使用ITS區(qū)域以及β-微管蛋白基因作為所述靶區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的霉菌的檢測(cè)方法，其特征在于，在用于進(jìn)行所述靶區(qū)域的擴(kuò)增的PCR用反應(yīng)液中，用于使β_微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組與用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組的濃度比為1:0.9~1:0.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的霉菌的檢測(cè)方法，其特征在于，在用于進(jìn)行所述靶區(qū)域的擴(kuò)增的PCR用反應(yīng)液中，使用具備含有序列號(hào)I所示堿基序列的正向引物及含有序列號(hào)2所示堿基序列的反向引物的引物組，來(lái)作為用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組，并且使用具備含有序列號(hào)3所不喊基序列的正向引物及含有序列號(hào)4所不喊基序列的反向引物的引物組，來(lái)作為用于使β_微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的霉菌的檢測(cè)方法，其特征在于，在用于進(jìn)行所述靶區(qū)域的擴(kuò)增的所述PCR用反應(yīng)液中，使用含有序列號(hào)5所示堿基序列的引物作為用于使支孢屬菌特異性地?cái)U(kuò)增的正向引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1~4中任一項(xiàng)所述的霉菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述霉菌為散囊屬菌Eurotium sp.、帚狀曲霉種菌Aspergillus penicillioides、唯特里庫(kù)拉曲霉種菌 Aspergillus vitricola、局限曲霉復(fù)合種菌 Aspergillus Section Restrict1、構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌 Aspergillus Section Nidulantes、煙曲霉復(fù)合種菌 Aspergillus SectionFumigat1、黃曲霉復(fù)合種菌 Aspergillus Section Flav1、青霉屬菌 Penicillium sp.、黑葡萄穗霉種菌Stachybotrys chartarum、腐皮鐮孢種菌Fusarium solan1、支孢屬菌Cladosporium sp.中的至少任一種。
6.一種PCR用反應(yīng)液，其是用于進(jìn)行霉菌的DNA中的靶區(qū)域的擴(kuò)增的PCR用反應(yīng)液，其特征在于，包含: 作為用于使ITS區(qū)域擴(kuò)增的引物組的、具備含有序列號(hào)I所示堿基序列的正向引物及含有序列號(hào)2所不喊基序列的反向引物的引物組；和 作為用于使β_微管蛋白基因擴(kuò)增的引物組的、具備含有序列號(hào)3所示堿基序列的正向引物及含有序列號(hào)4所示堿基序列的反向引物的引物組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PCR用反應(yīng)液，其特征在于，還包含含有序列號(hào)5所示堿基序列的引物作為用于使支孢屬菌特異性地?cái)U(kuò)增的正向引物。
8.—種霉菌檢測(cè)用載體，其特征在于，針對(duì)一種或兩種以上霉菌中的每一種，固定了具有從ITS區(qū)域選擇的堿基序列的探針以及具有從微管蛋白基因選擇的堿基序列的探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的霉菌檢測(cè)用載體，其特征在于，固定有選自下述探針組中的一組或二組以上的探針，所述探針組為: 用于檢測(cè)散囊屬菌Eurotium sp.的第一探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)6或7所示堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)8所示喊基序列的探針； 用于檢測(cè)帚狀曲霉種菌Aspergillus penicillioides的第二探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)9~11所示堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)12所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)唯特里庫(kù)拉曲霉種菌Aspergillus vitricola的第三探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)13或14所示堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β-微管蛋白基因的序列號(hào)15所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)局限曲霉復(fù)合種菌Aspergillus Section Restricti的第四探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)16~20所示堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)21所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)構(gòu)巢曲霉復(fù)合種菌Aspergillus Section Nidulantes的第五探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)22所示堿基序列的探針以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)23所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)煙曲霉復(fù)合種菌Aspergillus Section Fumigati的第六探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)24所示堿基序列的探針以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)25所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)黃曲霉復(fù)合種菌Aspergillus Section Flavi的第七探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)26所示堿基序列的探針以及具有選自β_微管蛋白基因的序列號(hào)27所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)青霉屬菌Penicillium sp.的第八探針組，其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)28或29所示堿基序列的探針中的至少任一種以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)30~32所示堿基序列的探針中的`至少任一種； 用于檢測(cè)黑葡萄穗霉種菌Stachybotrys chartarum的第九探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)33所示堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)34所不喊基序列的探針； 用于檢測(cè)腐皮鐮孢種菌Fusarium solani的第十探針組,其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)35所示堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)36所示堿基序列的探針； 用于檢測(cè)支孢屬菌(Cladosporium sp.)的第^^一探針組，其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)37所示的堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)38或39所示的堿基序列的探針中的至少任一種；以及 霉菌共同的第十二探針組，其含有具有選自ITS區(qū)域的序列號(hào)40所示堿基序列的探針以及具有選自β -微管蛋白基因的序列號(hào)41所示堿基序列的探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的霉菌檢測(cè)用載體，其特征在于，所述第一至第十二探針組中的至少任一種的探針為以下的(I)~(3)中的任一種， (1)在序列號(hào)所示的堿基序列中I個(gè)或數(shù)個(gè)堿基缺失、被置換或被加成后的探針； (2)在嚴(yán)格的條件下能夠?qū)ο率龊怂崞瑪噙M(jìn)行雜交的探針，所述核酸片斷含有與序列號(hào)所示堿基序列相互補(bǔ)的堿基序列； (3)具有與(I)或(2)的探針相互補(bǔ)的堿基序列的探針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103635592SQ201280028342
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月9日
【發(fā)明者】一色淳憲, 田邊卓, 竹治仁詩(shī), 小梶真實(shí) 申請(qǐng)人:東洋制罐集團(tuán)控股株式會(huì)社