專利名稱：：一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種烤煙醇化品質(zhì)的分析判定方法，尤其是一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法。
背景技術(shù)：
：煙葉醇化是巻煙生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，同時也是煙葉吸食品質(zhì)改善的一個重要步驟，在提高巻煙成品質(zhì)量和加強(qiáng)成本控制方面發(fā)揮著十分重要的作用。在醇化過程中，烤煙片煙內(nèi)部發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化及純化學(xué)的變化，導(dǎo)致內(nèi)部化學(xué)成分的改變，進(jìn)而引起煙葉品質(zhì)的改善。煙葉中的化學(xué)成分是決定煙葉品質(zhì)的內(nèi)在因素，煙葉的化學(xué)成分主要包括羰基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)及其含氮化合物、生物堿和其他含氮雜環(huán)化合物、酶、有機(jī)酸、酚類化合物、色素、石油醚提取物、礦物質(zhì)等；經(jīng)進(jìn)一步硏究表明，煙葉的化學(xué)成分變化主要有兩個特征，一是不具有香氣特征的大分子化合物如總糖、還原糖、淀粉、總氮、蛋白質(zhì)、氨基酸、煙堿、類胡蘿卜素和高級脂肪酸等發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，含量呈下降趨勢；二是芳香性的小分子化合物如總有機(jī)酸、羰基化合物如醇、醛、酮類、煙葉精油以及糖苷態(tài)香氣物質(zhì)得到合成、轉(zhuǎn)化和積累。在煙葉醇化過程中，煙葉揮發(fā)性酸、揮發(fā)性羰基化合物含量以及煙葉精油中絕大多數(shù)香氣成分含量顯著增加，并符合二次曲線變化規(guī)律；醇化過程中烤煙片煙中的還原糖、煙堿、揮發(fā)堿、淀粉含量及pH值均隨著醇化時間的延長呈持續(xù)降低趨勢，揮發(fā)酸含量則逐漸增加，總氮含量無明顯變化。依據(jù)煙葉醇化過程中化學(xué)成分變化的基本特征，探討以化學(xué)分析與感官評吸相結(jié)合的醇化質(zhì)量評價方式，對于減少和克服傳統(tǒng)評價方式的缺陷，增加客觀性和評價的準(zhǔn)確性具有積極的意義。多年來，煙草科研人員試圖用簡單有效的化學(xué)方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的感官質(zhì)量評吸方法。但是，由于影響煙葉抽吸品質(zhì)的因素是各化學(xué)成分的復(fù)雜平衡關(guān)系導(dǎo)致，所以利用化學(xué)指標(biāo)方法來判斷煙葉的醇化質(zhì)量顯得單一、片面；然而，目前還沒有廣泛適用的化學(xué)分析和儀器分析方法，這就限制了在生產(chǎn)上的應(yīng)用。我們在研究中發(fā)現(xiàn)指紋圖譜技術(shù)是對模糊物質(zhì)研究的最佳方法，通過指紋圖譜技術(shù)判斷煙葉的醇化質(zhì)量具有全面性和均一性。指紋圖譜的概念是從中藥藥材的藥性研究中首先提出來的，其定義是指樣品經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該樣品特性的共有峰的圖譜。當(dāng)前，色譜技術(shù)的多樣化和檢測能力的增強(qiáng)為指紋圖譜研究和應(yīng)用提供了良好的工作平臺，針對此項技術(shù)，所涉及的方法種類繁多，包括TLC、TLCS、HPLC、HPLC/MS、GC、GC/MS、HPCE、IR、NMR及X射線衍射等。其中色譜技術(shù)是主流，尤其是TLCS、HPLC和GC已是大家所公認(rèn)的三種常規(guī)的分析手段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，色譜分析儀器的完善與提高，在克服自身固有缺陷，發(fā)揮自身優(yōu)勢方面有了長足發(fā)展，成為三種互相補(bǔ)充、相互結(jié)合的分析手段。其中HPLC方法隨新的高效通用型檢測器的發(fā)展，使得HPLC的適用性和靈敏度得到顯著提高，從而使復(fù)雜樣品的成功分析成為可能。煙葉的指紋圖譜是利用色譜技術(shù)獲得的煙葉特征提取物的色譜圖，這是一種綜合的、可定性化的鑒別方法，借助MS，NMR法對煙葉的特征提取物進(jìn)行定性，通過內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)進(jìn)行定量的先進(jìn)方法。本發(fā)明對烤煙片煙在醇化過程中指紋圖譜變化規(guī)律研究的基礎(chǔ)上，建立了不同條件下煙葉醇化品質(zhì)與指紋圖譜特征之間的關(guān)系，篩選出適宜的煙葉醇化品質(zhì)的指紋圖譜判定方法，為指導(dǎo)煙葉醇化過程和準(zhǔn)確判斷醇化質(zhì)量提供技術(shù)支撐。研究對于減少和克服傳統(tǒng)評價方式的缺陷，增加客觀性和評價的準(zhǔn)確性具有積極的意義
發(fā)明內(nèi)容《本發(fā)明的目的在于提供一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜分析方法，該方法測定的結(jié)果與感官評吸結(jié)果具有很好的一致性，有利于增強(qiáng)判定煙葉醇化品質(zhì)的客觀性。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案是它是采用高效液相色譜分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進(jìn)行主成分分析，建立特征峰的主成分值與煙葉樣品感官質(zhì)量的回歸關(guān)系模型；以感官評吸值Y為依變量，7個主成分值A(chǔ)!至A7為因變量，建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型Y二85.64+1.34A!+1.21A2+0.27A3-0.40A4-1.17A5-0.46A6+0.48A7，根據(jù)分析所得到的主成分值A(chǔ),至A7，計算出感官質(zhì)量Y。其中進(jìn)行高效液相色譜分析時，流動相A:0.1%的甲酸；B:乙腈，進(jìn)樣量10ul;流量5.0ml/vmin;柱溫25°C，采用剃度洗脫在0~40min乙腈由O.OV/V到50，40—5min由50變?yōu)?00，然后保留5min，在50—55min變?yōu)?，保留5min。本發(fā)明利用HPLC分析技術(shù)，建立烤煙指紋圖譜特征峰與感官質(zhì)量之間的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而建立指紋圖譜特征峰與感官質(zhì)量的多元回歸模型，利用多元回歸模型對煙葉的感官質(zhì)量進(jìn)行檢測，它的有益效果是提供了一種客觀的烤煙醇化品質(zhì)的判定方法，且準(zhǔn)確性和可靠性高；提出的指紋圖譜方法和感官評吸方法評價煙葉醇化質(zhì)量具有一樣的效果；該方法簡單實用，操作簡便，非常適合作為烤煙質(zhì)量的檢測方法。圖1為煙葉指紋圖譜特征峰示意圖具體實施例方式通過具體的實施例子對本發(fā)明進(jìn)一步說明。指紋圖譜的優(yōu)勢主要是能夠反應(yīng)具有復(fù)雜成分的植物材料及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。煙葉質(zhì)量因產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境、等級、部位及醇化時間的不同而有明顯差異，而指紋圖譜既具有判斷該對象真?zhèn)蔚?共性"，又能反映影響因素帶來的差異性特征，具有物種的唯一性和個體的相似性，從而能夠從整體上反應(yīng)煙葉的質(zhì)量。我們過去曾提出采用碘值法判斷煙葉醇化進(jìn)程，但該方法離生產(chǎn)實際應(yīng)用的需要還相差甚遠(yuǎn)，這些研究僅僅提供了應(yīng)用非感官方法判斷煙草醇化進(jìn)程和品質(zhì)的可行性認(rèn)識。在煙草醇化的理論與實踐研究中，我們在過去指紋圖譜理論與實踐研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討烤煙指紋圖譜特征值與醇化進(jìn)程和醇化品質(zhì)的關(guān)系，并建立了綜合預(yù)測模型。同時，本項目重點研究了所提出判斷方法的影響因子及指標(biāo)體系，明確其應(yīng)用條件和范圍，使該方法的應(yīng)用更具有廣泛的適用性和實際可操作性。實施例為推廣本發(fā)明的指紋圖譜方法，特將本發(fā)明的方法應(yīng)用與不同醇化時間、不同產(chǎn)地的烤煙進(jìn)行了醇化質(zhì)量判定實驗。采用的樣品見表l:表l:試驗驗證采用的樣品一覽表6大省份4個生態(tài)地區(qū)2個年份2005年福建C3F2005年湖北BLF2005年云南C3F-B2005年云南C3F2005年湖北XFL2005年四川C2L2005年四川C3F2005年云南BFL2005年湖北C2L-A2005年貴州CFL2005年云南XFL2005年東北C2L-A2005年湖北C3L2005年貴州BFL2004年云南C3F-B2005年東北CFL2005年貴州BFL2004年四川C2L2005年四川BFL-B3L2004年湖北C2L-A2005年四川BFL-CX1K2004年東北C2L-B6從打葉復(fù)烤線上取若干供試片煙，按照正常程序裝箱打包，然后運回武漢，存放在指定的試驗倉庫中。以放置時間為起始醇化時間，每3個月取一次樣，每次取2公斤；一份切絲巻煙，用于感官評吸；另一份磨粉，用于化學(xué)成分及酶的測定；一份留樣。試驗中經(jīng)過了6次取樣，時間分別分別是2006年7月、2006年10月、2007年1月、2007年4月、2007年7月和2007年10月。整個過程中，共取樣品132個。樣品用烘箱在6(TC下烘干，然后用植物粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，用塑料袋密封，置于冰箱中保存待測。樣品的感官質(zhì)量是由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心技術(shù)組評吸委員會評定。指紋圖譜分析是采用Agilent1100高效液相色譜儀，VWD檢測器，色譜柱為YMCC8柱，尺寸150*4.6mm，粒徑5pm，孔徑12nm。取樣品液，在Agilent1100高效液相色譜儀用DAD檢測器進(jìn)行3D掃描，通過對譜圖研究，選擇吸收波長為250nm;用VWD檢測器在250nm處對樣品進(jìn)行檢測。流動相A:0.1%的甲酸；B:乙腈。進(jìn)樣量10ul;流量5.0ml/vmin;柱溫25。C;采用剃度洗脫在040min乙腈由0.0(V/V)到50，40~45min由50變?yōu)?00，然后保留5min，在50—55min變?yōu)?，保留5min。在上述儀器條件下，得出烤煙指紋圖譜特征峰見圖1。用中草藥指紋圖譜軟件對煙葉的指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明所作煙葉特征圖譜具有高度的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性。表2:不同批次樣品指紋圖譜的相似度分析圖譜編號SlS2S3S4S5S20.9961S30.9860.99〗1S40.9880.9910.9971S50.9840.990.9990.9971S60.9830.990.9950.9950.997通過相似度計算可知，各個特征圖譜具有較高的相似度，但同時又能表現(xiàn)出醇化時間不同所帶來的差異性。通過比較不同醇化時間烤煙指紋圖譜的相似度來看，醇化21個月(S6)和醇化6個月(S1)的圖譜具有顯著差異。說明指紋圖譜一方面可以反映所選用的方法具有重現(xiàn)性，另一方面也可以反應(yīng)各指紋圖譜的差異性。主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)也稱主成量分析，是一種通過降維來簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)；如何把多個變量(指標(biāo))化為少數(shù)幾個綜合變量(綜合指標(biāo))，而這幾個綜合變量可以反映原來多個變量的大部分信息。表3:18個特征峰的主成分分析結(jié)果特征峰PrinlPrin2Prin3Prin4Prin5Prin6Prin7xl0.230.32-0.15-0.240.070.13-0.14x20.220.29-0.15-0.30.090.21-0.15x3-0.040.4-0.0100.01-0.21-0.25x40.16-0.12-0.460.030.120.180.36x50.230.250.11-0.33-0.28-0.110.26x60.290.18-0.220.13-0.29-0.280.22x70.21-0.150.34-0.370,27-0.190.33x80.24-0.32-0.020.010.18-0.140.21x90.3-0.090.180.36-0.02-0.19-0.41x100.210.02-0.29-0.050.61-0.28-0.17xll0.110.37-0.030.2-0.210.040.3x120.060.070.57-0.260.050.05-0.03x130.35-0.220.060.1-0.140.060.12x140.340.210.090.140.05-0.14-0.13x150.38-0.150.120.17-0.080.03-0.14x16-0.110.210.230.470.18-0.130,32x170.160.180.180.260.330,690.1x180.24-0,27-0.06-0.09-0.340.29-0.21417Ja4g力711:70000212j529452值值率征征,8利用SAS8.2軟件主成分分析方法對18個特征進(jìn)行主成分分析，主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)也稱主成量分析，是一種通過降維來簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)；如何把多個變量(指標(biāo))化為少數(shù)幾個綜合變量(綜合指標(biāo))，而這幾個綜合變量可以反映原來多個變量的大部分信息，分析結(jié)果見表3。由表可知，18個特征峰可分成七個主成分，這七個主成分是由SAS8.2軟件主成分運行程序所得，每個主成分表示不同的特征峰，一般選擇絕對值較大的峰，絕對值越大，對相應(yīng)的主成分貢獻(xiàn)率越大，也就是主成分能夠代表相對應(yīng)的特征峰所反映的信息。主成分1包括X13、X14、X15;主成分2包括XI、X3、X8、Xll;主成分3包括X4、X12;主成分4包括X5、X7、X9、X16;主成分5包括X10、X18;主成分6包括X17;主成分7包括X4、X9。7個主成分的特征值分別為5.29、5.12、2.48、1.27、1.08、0.74、0.57;7個主成分特征值貢獻(xiàn)率分別為29.4、28.5、13.8、7.1、6.0、4.1、3.2;七個主成分累計貢獻(xiàn)率為92%。從7個主成分的較高貢獻(xiàn)率可看出，利用主成分分析方法對煙葉的感官質(zhì)量判定具有可行性。以感官評吸值為依變量，7個主成分值(ArA7)為因變量，建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型，Y=85.64+1.34A!+1,21A2+0.27Ar0.40A4-1.17A5-0.46A6+0.48A7通過對回歸模型的分析(見表4)，結(jié)果表明，多元回歸模型達(dá)到了極顯著水平，其中主成分值A(chǔ),、A2和As達(dá)到了極顯著水平，這就說明了應(yīng)用主成分值對感官評吸結(jié)果可以進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)測。表4:7個主成分與感官質(zhì)量的多元回歸模型(常數(shù)F-31.1,PrO.OOOl)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>A70.48___0.2266模型應(yīng)用分析運用獲得的回歸模型對不同的樣品感官評吸值進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于模型樣品的預(yù)測誤差值在0.5%范圍內(nèi)，對于非模型95%的樣品預(yù)測值控制在2Q/。以內(nèi)。該結(jié)果表明本模型完成適合于對醇化樣品感官質(zhì)量的預(yù)測(表5)。表5:應(yīng)用主成分模型對感官評吸值的預(yù)測效果模型樣品非模型樣品樣品感官質(zhì)量樣品感官質(zhì)量實際值預(yù)測值誤差實際值預(yù)測值誤差%2005年福建C3F-01批86.184.10.592005年湖北BLF-01批85.288.2-0.862005年云南C3F-01批88.585.70.812005年湖北XFL-01批8682.80.952005年四川C3F-01批86.787.8-0.312005年云南BFL-01批86.787.7-0.282005年貴州CFL-01批85.384.50.252005年云南XFL-01批86.188.1-0.582005年湖北C3L-01批85.785.7-0.022005年貴州BFL-成熟-Ol批83.790.3-1.912005年東北CFL-01批73.375.6-0.782005年貴州BFL-尚熟-Ol批84.288.8-1.342005年福建C3F-02批86.288.5-0.652005年四川BFL-B3L-01批85.889.7-1.122005年云南C3F-02批88.987.40.422005年四川BFL-CX1K-01批85.582.60.852005年四川C3F-02批87.689.7-0.592005年湖北BLF-02批85.587.8-0.672005年貴州CFL-02批86.486.5-0.042005年湖北XFL-02批8680.31.712005年湖北C3L-02批8789.8-0.812005年云南BFL-02批86.989.8-0.842005年東北CFL-02批75.676.8-0.382005年云南XFL-02批86.488.1-0.48101.340.13跳62<扁11.210.1385.22<細(xì)10.270.192.100.1585-0.400.262.280.1422-1.170.2916.720扁3-0.460.341.750.197AAAAAA<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>C3L-06比2005年東北CFL-06批76.677.8-0.392005年云南XFL-05批84.980.51.312005年貴州BFL-成熟-05批84.386.7-0.692005年貴州BFL-尚熟-05批86.186.5-0.122005年四川BFL-B3L-05批86.388.4-0.612005年四川BFL-CX1K-05批82.9781.532005年湖北BLF-06批84.984.20.212005年湖北XFL-06批87.274.43.952005年云南BFL-06批84.786.2-0.442005年云南XFL-06批84.480.71.112005年貴州BFL-成熟-06批85.189.9-1.362005年貴州BFL-尚熟-06批86.986.50.112005年四川BFL-B3L-06批86.986.20.212005年四川BFL-CX1K-06批83.674.62.84綜上所述，本發(fā)明指紋圖譜主成分分析方法具有較高的準(zhǔn)確率。這種方法在煙葉的醇化過程中是首次提出，并首次來加以利用。煙葉醇化過程中的指紋圖譜主要是為了表現(xiàn)和控制煙葉化學(xué)成分群的整體，所以指紋圖譜能夠有較好的重現(xiàn)性。由于煙葉是一種復(fù)雜的體系，包含了一定的不確定度和模糊性，所以煙葉的指紋圖譜也能夠大量的表達(dá)煙葉的共性。通過利用煙葉指紋圖譜方法判定上述煙葉醇化質(zhì)量的效果可以看出，該方法具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的特點，實際操作中可節(jié)省大量的人力物力財力，使用方便，完全代替利用傳統(tǒng)的感官評吸方法對煙葉醇化質(zhì)量的判定。1權(quán)利要求1、一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法，它是采用高效液相色譜分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進(jìn)行分析，建立特征峰的主成分值與煙葉樣品感官質(zhì)量的回歸關(guān)系模型；以感官評吸值Y為依變量，7個主成分值A(chǔ)1至A7為因變量，建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型Y＝85.64+1.34A1+1.21A2+0.27A3-0.40A4-1.17A5-0.46A6+0.48A7，根據(jù)分析所得到的主成分值A(chǔ)1至A7，計算出感官質(zhì)量Y。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法，其中進(jìn)行高效液相色譜分析時，流動相A:0.1%的甲酸；B:乙腈，進(jìn)樣量10ul;流量5.0ml/vmin;柱溫25"。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法，其中進(jìn)行高效液相色譜分析時，采用剃度洗脫在0"40min乙腈由O.OV/V到50，40~45min由50變?yōu)?00，然后保留5min，在50—55min變?yōu)?，保留5min。全文摘要本發(fā)明涉及一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法。它是采用高效液相色譜分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進(jìn)行分析，建立特征峰主成分值與煙葉樣品感官質(zhì)量的回歸關(guān)系模型；以感官評吸值Y為依變量，7個主成分值A(chǔ)₁至A₇為因變量，建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型Y＝85.64+1.34A₁+1.21A₂+0.27A₃-0.40A₄-1.17A₅-0.46A₆+0.48A₇，根據(jù)分析所得到的主成分值A(chǔ)，計算出感官質(zhì)量Y。本發(fā)明具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的特點，實際操作中可節(jié)省大量的人力物力財力，使用方便，完全能夠代替利用傳統(tǒng)的感官評吸方法對煙葉醇化質(zhì)量的判定。文檔編號G01N30/00GK101661024SQ20081019680公開日2010年3月3日申請日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者何結(jié)望,輝司,吳風(fēng)光,孫敬國,涂書新,閆鐵軍申請人:湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司