1.基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于按照下述步驟進(jìn)行:
(1)魚(yú)肉蛋白樣品的制備:將新鮮的魚(yú)按照常規(guī)處理方法制成魚(yú)肉蛋白溶液,在魚(yú)肉蛋白溶液中加入相應(yīng)的氨基酸溶液,得到蛋白-氨基酸混合液(P-AA);
(2)掃描樣品的制備:將P-AA溶液按一定的熱誘導(dǎo)條件處理后,滴在新剝離的云母片表面使其自然干燥,用純凈水沖洗吸附層(1~5)次,吸走多余液體,再使其自然干燥,待測(cè);
(3)原子力顯微鏡掃描:原子力顯微鏡探針型號(hào)為TAP 150(MPP-12100-10),操作模式為分子力模式,掃描范圍為5 μm×5 μm;
(4)圖片處理:在NanoScope Analysis離線軟件上進(jìn)行,圖片進(jìn)行Flatten平整化處理,消除傾斜、扭曲、跳線等的影響,對(duì)每條掃描線進(jìn)行補(bǔ)償,使得到的數(shù)據(jù)更加真實(shí),得到2D、3D圖片,對(duì)二維圖像進(jìn)行“particle analysis”分析,以其深度直徑作為等效粒徑;
(5)最后可以從2D圖片中觀察蛋白在不同氨基酸存不同加熱方式下聚集行為表面形貌的變化,從3D圖片可以觀察聚集體的高度形狀等立體形貌的變化,可通過(guò)顆粒分析得到聚集體等效粒徑的變化范圍及均值,并以此為依據(jù)對(duì)游離氨基酸影響魚(yú)肌球蛋白聚集行為進(jìn)行評(píng)價(jià),未添加氨基酸作為對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(2)具體按照下述步驟進(jìn)行:提前將云母片剪成5 mm×5 mm大小,用雙面膠黏在具有鐵磁性物質(zhì)如直徑約為1 cm×1 cm的鐵片上,鐵片厚度不超過(guò)1 mm;將蛋白溶液稀釋至20 μg/mL,用雙面膠將云母片外表層剝離,吸取(1~6 μL)蛋白溶液滴于新剝離的云母片表面,室溫下在超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥,形成蛋白吸附層;為消除鹽分的干擾,用純凈水(15~30 ℃,35 μL)沖洗吸附層(1~5)次,超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥,所有操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行;掃描前樣品存放在帶蓋培養(yǎng)皿中,避免空氣中的灰塵落在樣品表面干擾掃描。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(5)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:純蛋白聚集體等效粒徑范圍為110.1 93-413.482 nm,添加半胱氨酸聚集體等效粒徑為110.193-371.402 nm(未加熱);純蛋白聚集體等效粒徑范圍為110.1 93-1266.024 nm,添加半胱氨酸聚集體等效粒徑為110.193-855.543 nm(90 ℃-30 min);純蛋白聚集體等效粒徑范圍為110.1 93-862.047nm,添加半胱氨酸聚集體等效粒徑為110.193-781.984 nm(40 ℃-60 min);純蛋白聚集體等效粒徑范圍為110.1 93-740.184 nm,添加半胱氨酸聚集體等效粒徑為110.193-490.329 nm(40 ℃-60 min然后90 ℃-30 min),聚集體等效粒徑范圍存在明顯差異。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(1)中添加的氨基酸為谷氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸,氨基酸的濃度為5 毫摩爾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(2)所述的一定的熱誘導(dǎo)條件為90 ℃加熱30 min;40 ℃加熱60 min;40 ℃加熱60 min后再90 ℃加熱30 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(2)吸取1~6 μL蛋白溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于原子力顯微鏡氨基酸影響魚(yú)蛋白聚集行為的評(píng)價(jià)方法,其特征在于其中所述的步驟(2)吸取35 μL是15~30 ℃的純凈水。