本發(fā)明涉及一種基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法。
背景技術：
三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖。具有活血化瘀、消腫止痛功效，與其藥效活性相關的成分為皂苷類成分，包括人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等。現代藥理研究表明，三七具有明顯抗凝、抑制血小板聚集、促進纖維蛋白溶解作用，且在抗炎鎮(zhèn)痛方面也具有良好效果。其中三七抗凝血作用與其傳統(tǒng)功效“活血化瘀”具有重要的相關性。
作為臨床大宗中藥，如何對三七質量進行有效評控將對保證其臨床療效和促進其產品開發(fā)具有重要意義。在2015版《中國藥典》中，以人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1為三七指標性成分，通過限定三個成分總量不少于5.0％來控制其質量。但是，與三七活性相關的不僅只是這三個成分，且這種簡單的含量相加并未反映出不同成分對其整體藥效的貢獻度差異，忽視了不同成分所關聯的藥效大小有所區(qū)別，實際應用時難以評價不同樣品的品質優(yōu)劣情況。例如，前期研究發(fā)現，兩批三七藥材中，一批樣品的人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1含量分別為3.0％、3.3％及1.0％，另一批為4.0％、2.6％及0.7％，兩批樣品的成分總量皆為7.3％，此時又如何通過這一指標來評價二者品質孰優(yōu)孰劣呢？除此，三七皂苷R1的主要活性為止血，根據前期研究發(fā)現，其抗凝血作用顯著低于其他皂苷類成分，這提示我們評價中藥質量，不應只尋求易獲取或特異性成分作為指標，而應考慮不同的臨床效用需求建立個體化的質量評價指標。
臨床效果是評價中藥質量的金標準，因此合理的質量評價方法及指標應關聯中藥功效或藥效活性。但若僅在當前成分含測的基礎上單純添加這些藥效活性指標，則會增加今后質控標準施行時的難度和復雜度。因為每個藥效指標的增添，會導致每種藥材有更多要滿足的標準，更多繁瑣的操作，耗費更多實驗材料和實驗動物，這勢必會造成能源資源的浪費。況且，這種多指標質控模式所帶來的貢獻度差異問題依然沒有解決，無法說明其中哪個指標對藥材質量有更重要的關聯。
因此，若能建立一種綜合的既能直接關切可控有效，又不會增加施行難度，同時能指導三七臨床用藥的質量評控方法，將對三七及其他中藥質量評控標準的完善具有重要意義。
技術實現要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種綜合的既能直接關切可控有效，又不會增加施行難度，同時能指導三七臨床用藥的質量評控方法的基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：
一種基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法，包括步驟：
1)測定三七中活性成分的含量；
2)檢測活性成分的抗凝血效應；
3)計算三七抗凝血生化指數；
4)根據抗凝血生化指數來評價三七的活血作用并指導其用藥劑量調節(jié)。
作為優(yōu)選的技術方案，所述步驟1)中的活性成分為人參皂苷Rg1，Re，Rb1和Rd。
作為優(yōu)選的技術方案，所述步驟2)中抗凝血效應檢測包括步驟：
①樣品溶液配制：精取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd，分別用生理鹽水配制成濃度梯度為0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液；
②小鼠眼球靜脈取血，全血與抗凝劑9:1體積比混勻，2500r/min離心15min制備待測血漿，以體積比血漿：生理鹽水＝2:1比例共50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫3～5min的0.1mol/L pH 7.4Tris-HCl緩沖液稀釋的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下凝血酶原初始時間PT0，用不同濃度的凝血活酶，測得凝血酶原時間PT，計算PT延長率(％)，以lgPT延長率(％)對凝血酶原復合物濃度作圖，得到凝血活酶濃度對lgPT延長率(％)的影響的標準曲線，每個樣品至少重復測定3次；
③血漿-活性成分(2：1)混合血漿樣品50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫3～5min的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下PT'，計算lgPT'延長率(％)；
④根據標準曲線相對應的凝血活酶濃度(Ui)，計算活性成分對應的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
⑤根據活性成分對凝血活酶的抑制率計算各成分抗凝血效應EC50。
作為優(yōu)選的技術方案，所述抗凝劑為0.109mol/L的枸櫞酸鈉。
作為優(yōu)選的技術方案，所述步驟3)中計算三七抗凝血生化指數：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分別代表每0.3g三七中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，％。
作為優(yōu)選的技術方案，所述步驟(4)根據抗凝血生化指數來評價三七的活血作用并指導其用藥劑量調節(jié)，包括以下步驟：
①根據抗凝血生化指數值大小評價三七活血作用；
②調節(jié)三七實際用藥劑量：
D實際＝D目標/BCI抗凝血；其中，D實際為待測三七的實際用量，D目標為待測三七的目標用量。
作為優(yōu)選的技術方案，所述三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、側根、飲片。
由于采用了上述技術方案，一種基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法，包括步驟：1)測定三七中活性成分的含量；2)檢測活性成分的抗凝血效應；3)計算三七抗凝血生化指數；4)根據抗凝血生化指數來評價三七的活血作用并指導其用藥劑量調節(jié)；本發(fā)明能整合化學分析及生物評價優(yōu)勢，具有關聯功效、重現性強、操作易行等特點，可僅通過檢測三七中活性成分含量而體現其活血作用，對評價三七藥材及飲片質量、指導臨床用藥標準的完善具有重要意義。
具體實施方式
下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
一種基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法，包括步驟：
1)測定三七中活性成分的含量；
2)檢測活性成分的抗凝血效應；
3)計算三七抗凝血生化指數；
4)根據抗凝血生化指數來評價三七的活血作用并指導其用藥劑量調節(jié)。
所述步驟1)中的活性成分為人參皂苷Rg1，Re，Rb1和Rd。
所述步驟2)中抗凝血效應檢測包括步驟：
①樣品溶液配制：精取人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd，分別用生理鹽水配制成濃度梯度為0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液；
②小鼠眼球靜脈取血，全血與抗凝劑9:1體積比混勻，2500r/min離心15min制備待測血漿，以體積比血漿：生理鹽水＝2:1比例共50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫3～5min的0.1mol/L pH 7.4Tris-HCl緩沖液稀釋的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下凝血酶原初始時間PT0，用不同濃度的凝血活酶，測得凝血酶原時間PT，計算PT延長率(％)，以lgPT延長率(％)對凝血酶原復合物濃度作圖，得到凝血活酶濃度對lgPT延長率(％)的影響的標準曲線，每個樣品至少重復測定3次；
③血漿-活性成分(2：1)混合血漿樣品50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫3～5min的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下PT'，計算lgPT'延長率(％)；
④根據標準曲線相對應的凝血活酶濃度(Ui)，計算活性成分對應的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
⑤根據活性成分對凝血活酶的抑制率計算各成分抗凝血效應EC50。
所述抗凝劑為0.109mol/L的枸櫞酸鈉。
所述步驟3)中計算三七抗凝血生化指數：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分別代表每0.3g三七中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，％。
所述步驟(4)根據抗凝血生化指數來評價三七的活血作用并指導其用藥劑量調節(jié)，包括以下步驟：
①根據抗凝血生化指數值大小評價三七活血作用；
②調節(jié)三七實際用藥劑量：
D實際＝D目標/BCI抗凝血；其中，D實際為待測三七的實際用量，D目標為待測三七的目標用量。
所述三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、側根、飲片。
實施例：
基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法可對三七藥材及飲片進行活血作用評價和臨床用量調節(jié)實驗：
試驗中所用到的儀器：粉碎機(FW-135型，上海隆拓儀器設備有限公司)；電子分析天平(CP114型，上海奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗儀(BL10-250A型，上海比朗儀器有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(RE-5205型，上海亞榮生化儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(DZKW型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SII-01-00，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；LC-20AB高效液相色譜儀(SPD-20A檢測器，日本島津公司)；超純水器(UPT-1-20T優(yōu)普系列，成都超純科技有限公司)；臺式高速冷凍離心機(H1650R型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；血凝儀(XN06系列，武漢景川診斷技術股份有限公司)。
(1)測量所收集的三七樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的含量：
(i)三七粉制備：將采自不同產地的三七主根、剪口、側根和飲片洗凈、曬干、粉碎，過40目篩。
(ii)三七水提物制備：分別稱取不同三七粉末各5g，每次加入50mL水，80℃下回流提取2次，每次2小時，合并濾液，減壓提取液，濃縮至50mL生藥濃度為0.1g.mL-1的水提液備用。
(iii)混合對照品溶液制備：分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd對照品置于2mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質量濃度分別為0.55、0.50、0.60、0.50mg/mL的混合對照品溶液。
(iv)供試品溶液制備：分別取三七各樣品粉末0.30g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入70％甲醇25mL，稱定質量，放置過夜。超聲處理40min，冷卻至室溫，稱定質量，用70％甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
(v)液相色譜法測量：
色譜條件：色譜柱：Vision HT C18柱(250mm×4.6mm)；流動相：水(A)-乙腈(B)，線性梯度洗脫：(0～20min，20％B；20～45min，20％～46％B；45～55min：46％～5％B；55～60min：55％B)；檢測波長：203nm；流速：1.0mL/min；柱溫：24℃；進樣量：10μL。
測量結果如表1所示。
表1所收集的三七樣品活性成分含量(％)
(2)三七抗凝血生化指數的構建：
(i)樣品溶液配制：精取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd分別用生理鹽水配制成濃度梯度為0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液。
(ii)抗凝血效應檢測：
小鼠眼球靜脈取血，全血與抗凝劑(0.109mol/L枸櫞酸鈉)9:1混勻，2500r/min離心15min制備待測血漿。以血漿：生理鹽水＝2:1比例共50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫一定時間的0.1mol/L PH 7.4Tris-HCl緩沖液稀釋的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下PT0。每個樣品至少重復測3次。
用不同濃度的凝血活酶，測得凝血酶原時間PT，計算PT延長率(％)。
PT延長率(％)＝(PT-PT0)/PT0*100％。
以lgPT延長率(％)對凝血酶原復合物濃度作圖，得到凝血活酶濃度對lgPT延長率(％)的影響的標準曲線。
血漿-單體皂苷(2：1)混合血漿樣品50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫一定時間的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下PT'，計算lgPT'延長率(％)。
PT'延長率(％)＝PT'(加單體皂苷)-PT0'(生理鹽水)/PT0'(生理鹽水)*100％；
根據標準曲線相對應的凝血活酶濃度(Ui)，并計算對應的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
相應數據通過Origin 8.5軟件(Origin Lab公司，美國)作圖。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美國)進行抗凝血效應EC50計算。結果見表2。
表2三七樣品中活性成分抗凝血效應
將此四種活性成分的量效關系方程加和得到三七抗凝血效應加和值，與對照藥材成分抗凝血效應加和值1.5267之比，即為不同生、熟三七樣品的抗凝血效應當量因子方程，即公式：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；
(3)驗證三七抗凝血生化指數對其藥效活性的代表性：
(i)樣品溶液配制：將上述三七水提物分別用生理鹽水稀釋為原溶液的1/2，1/3，1/4，1/5，1/8，1/10濃度。
(ii)抗凝血效應檢測：
采集健康小鼠靜脈血，立即與0.109mol/L枸櫞酸鈉溶液按9:1的比例充分混合均勻。以每分鐘3000轉離心10～15min分離出上層貧血小板血漿。將上述配制成的不同濃度生、熟三七水提物溶液分別按1:2比例與貧血小板血漿混合均勻，即得待測混合血漿。血漿-單體皂苷(2:1)混合血漿樣品50μL加入測定杯中，37℃預溫3min后加入共同預溫一定時間的10U/mL凝血活酶溶液100μL，記錄下PT'，計算lgPT'延長率(％)。
PT'延長率(％)＝PT'(加提取物)-PT0'(生理鹽水)/PT0'(生理鹽水)*100％；
根據標準曲線相對應的凝血活酶濃度(Ui)，并計算對應的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％。
(iii)相應數據通過Origin 8.5軟件(Origin Lab公司，美國)作圖。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美國)進行抗凝血效應EC50計算。
(iv)將不同三七水提物的活性成分含量值帶入公式BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd，計算它們的BCI抗凝血，將各樣品的實測EC50與BCI抗凝血進行相關性分析，結果如表3所示，說明二者具有顯著相關性，BCI抗凝血能較好地代表三七抗凝血效應，即BCI抗凝血高者，其抗凝血效應較好，活血作用較優(yōu)；反之，BCI抗凝血較低者，其抗凝血效應較差，活血作用稍次。
表3三七BCI抗凝血與實測抗凝血效應的相關性分析
三七抗凝血生化指數BCI抗凝血的具體應用：
根據以上實施例結果可以看出，不同部位、不同炮制條件處理的三七藥材，其抗凝血生化指數存在較大差異。例如生三七主根的抗凝血效應遠遠優(yōu)于120℃蒸制2h的主根樣品，因此在臨床應用中應注意區(qū)別用量，對用于活血功效的同一目標劑量而言，抗凝血生化指數低的藥材應通過換算適當增加劑量；反之，以此保證三七臨床功效的有效性。例如針對表3中具有不同抗凝血生化指數的12批三七樣品，假設目標劑量D目標為1克，通過公式D實際＝D目標/BCI抗凝血，換算后的實際用量如表4所示：
表4三七藥材的實際用量
同理可以計算其他三七藥材或飲片用于活血功效時的實際劑量，以保證用藥效果的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所建立的基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法經驗證能較好地代表三七抗凝血活性。由于直接給每個活性成分分配了藥效權重系數，系數越大，則該成分對三七抗凝血效應的代表性越強。在臨床使用評控三七質量時，可直接通過檢測成分含量去體現該三七之“效”，不增加質量標準的施行難度，實現中藥質量評控模式的簡單易行、科學有效。同時，抗凝血生化指數可在一定程度指導三七用于活血功效時的臨床用藥，指數高的藥材在臨床使用時可適當降低用量，指數低的藥材可增加臨床用量，以保證用藥效果的穩(wěn)定性。綜上，基于抗凝血生化指數評價三七活血作用的方法，使科學量化地關聯三七功效和指導臨床用藥成為可能。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
一切從本發(fā)明的構思出發(fā)，不經過創(chuàng)造性勞動所作出的結構變換均落在本發(fā)明的保護范圍之內。