本發(fā)明涉及植物組織，特別是一種用于觀察植物花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)變化的染色方法。
背景技術(shù)：
花藥發(fā)育和結(jié)構(gòu)的研究一直是生殖生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在花藥中，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成花粉的過(guò)程中所需要養(yǎng)料以及構(gòu)成花粉外壁的孢粉質(zhì)是由花藥壁的絨粘層細(xì)胞分泌產(chǎn)生或者由絨粘層細(xì)胞解體產(chǎn)生，在花粉發(fā)育成熟之后，絨粘層消失；因而，絨粘層的在形成和解體的恰當(dāng)時(shí)間對(duì)花粉的正常發(fā)育是十分重要的。另外，在花藥發(fā)育的研究中，清晰地觀察到絨粘層形成、消失時(shí)間和花粉壁的結(jié)構(gòu)變化時(shí)間以及兩者變化在時(shí)間上的關(guān)系是非常必要的。以往對(duì)于花粉發(fā)育和結(jié)構(gòu)研究上常采用石蠟切片后染色，例如苯胺藍(lán)可以細(xì)胞中的多種大分子進(jìn)行染色顯示不同的顏色，而對(duì)多糖/淀粉、脂類和蛋白質(zhì)染色則分別采用高碘酸-希夫試劑（PAS）、蘇丹黑B和考馬斯亮藍(lán)染色，所有這些染色方法都是用顯微鏡在亮視野下觀察，由于花藥壁的結(jié)構(gòu)層次復(fù)雜（含有絨粘層在內(nèi)的四層結(jié)構(gòu)），上述這些花藥染色和觀察方法往往不能很清晰地觀察花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化。
以往對(duì)花藥結(jié)構(gòu)的發(fā)育研究中，常利用PAS法進(jìn)行染色，但是PAS法主要用于對(duì)不溶性多糖進(jìn)行染色，使得花藥的各層細(xì)胞壁和花粉以及其中的淀粉粒都染成紅色，由于都是在亮視野下觀察，不能清晰觀察到花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化。因此，發(fā)明一種簡(jiǎn)便、成本低廉、安全的用于觀察花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化的染色方法，是亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種用于觀察植物花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)變化的染色方法，可有效解決清晰觀察花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化的問(wèn)題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括以下步驟：
1、摘取花藥；
2、將花藥用甲醛、冰醋酸和酒精的混合液固定；
3、脫水：將固定后的花藥依次在不同濃度的酒精中脫水；
4、正丁醇處理：經(jīng)過(guò)酒精脫水后的花藥依次在正丁醇和酒精的混合液中處理三次，然后將花藥轉(zhuǎn)入正丁醇中浸泡處理；
5、浸蠟：將花藥轉(zhuǎn)入正丁醇和石蠟的混合液中，密封，60℃下6-10h，每隔3h倒出一半混合液，每次加入等重量的石蠟，連續(xù)進(jìn)行兩次；最后將混合液倒出，用100%的石蠟過(guò)夜8-12h浸泡；
6、包埋：將花藥用石蠟包埋成包埋有花藥的蠟塊；
7、切片：將包埋有花藥的蠟塊切成蠟帶；
8、沾片：用明膠涂在載玻片上，將切好的蠟帶沾在載玻片上，烤干，將沾有蠟帶的載玻片放入二甲苯中脫蠟，然后轉(zhuǎn)入酒精和蒸餾水各處理一次；
9、染色：配置希夫試劑：將堿性品紅和焦亞硫酸鈉加入到蒸餾水中，攪拌均勻，冷卻，加入濃鹽酸和活性炭，成希夫試劑，將沾有花藥的載玻片在高碘酸中處理，用蒸餾水沖洗，將載玻片轉(zhuǎn)入希夫試劑中染色；
10、封片：將載玻片用蒸餾水沖洗，加蓋玻片，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)變化的染色。
本發(fā)明方法易操作，染色效果好，對(duì)植物花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)變化的觀察清晰、準(zhǔn)確，有利于對(duì)藥用植物的研究和栽培，使用安全、成本低，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：
1、取花藥：采集植物的花或花序，用鑷子摘取花藥；
2、固定：將花藥用甲醛10ml、冰醋酸3ml和50%酒精87ml的混合液在4℃進(jìn)行固定12-24h；
3、脫水：室溫下，將固定后的花藥依次在質(zhì)量濃度50%、70%、85%的酒精中脫水20-40min，置入質(zhì)量濃度95%的酒精中脫水8-12h，而后轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度100%的酒精中脫水兩次，每次20-40min；
4、正丁醇處理：經(jīng)過(guò)酒精脫水后的花藥依次在正丁醇和酒精的混合液中處理三次，每次20-40min；第一次：水15ml、質(zhì)量濃度95%酒精50ml和正丁醇35ml；第二次：水5ml、質(zhì)量濃度95%酒精40ml和正丁醇55ml；第三次：質(zhì)量濃度95%酒精25ml和正丁醇75ml；然后將花藥轉(zhuǎn)入正丁醇中60℃下浸泡處理6-10h；
5、浸蠟：將花藥轉(zhuǎn)入按重量計(jì)的正丁醇和石蠟各占50%的混合液中，密封，在60℃下，保持6-10h，每隔3h倒出一半混合液，每次加入等重量的石蠟，連續(xù)進(jìn)行兩次；最后將混合液倒出，全部更換為100%的石蠟，去掉蓋子，60℃保溫；
6、包埋：60℃下，花藥在石蠟中過(guò)夜8-12h，將花藥轉(zhuǎn)入包埋盒中，用石蠟包埋，將包埋好的蠟塊取出，用刀片修理平整，成包埋有花藥的蠟塊；
7、切片：將包埋有花藥的蠟塊切成厚度4-6μm的蠟帶；
8、沾片：用質(zhì)量濃度1%的明膠涂在載玻片上，將切好的蠟帶沾在載玻片上，在38-40℃下烤干，將沾有蠟帶的載玻片放入二甲苯中脫蠟1-3h，然后依次轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度100%酒精、質(zhì)量濃度70%酒精和蒸餾水各處理一次，每次處理時(shí)間為20-40min；
9、染色：配置希夫試劑：將堿性品紅0.5-1.5g和焦亞硫酸鈉1.0-2.0g加入到蒸餾水50-100ml中，攪拌均勻，冷卻1-2h，加入濃鹽酸0.5-1.5ml，加入5g活性炭6-10h后，過(guò)濾，成希夫試劑；
將沾有花藥的載玻片在0.5%-1.0%的高碘酸中處理10-20min，用蒸餾水沖洗，將載玻片轉(zhuǎn)入希夫試劑中染色處理20-30min；
10、封片：將載玻片用蒸餾水沖洗3-5min，加蓋玻片，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)變化的染色，用于觀察花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化；
11、觀察：用激光共聚焦顯微鏡在波長(zhǎng)為400-500nm的激發(fā)光照射、照相，清晰看到花藥絨粘層和花藥壁的熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)花藥壁絨粘層和花藥壁結(jié)構(gòu)變化的觀察。
本發(fā)明在具體實(shí)施中，為了全面看到花藥壁各層細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，可將同一花藥先在亮視野下用激光共聚焦顯微鏡DIC功能照相，然后再用400-500nm激發(fā)光照相，利用操作及分析軟件的圖像疊加功能，將圖像疊加后可以得到花藥各個(gè)部分清晰完整的圖像。
由上述可以看出，本發(fā)明提供了一種利用熒光顯微鏡研究絨粘層發(fā)育和花藥壁形成的新穎而簡(jiǎn)單的染色及觀察方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是將花藥經(jīng)過(guò)FAA固定，酒精脫水，正丁醇處理后浸蠟，石蠟包埋后切片，脫蠟后，用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色，封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察照相。
本發(fā)明方法以冬凌草、山茱萸、山楂等的花藥為例，按上述方法，對(duì)花藥進(jìn)行染色，經(jīng)多次反復(fù)試用和實(shí)驗(yàn)，觀察結(jié)果清晰，花藥的的絨粘層和花粉壁熒光強(qiáng)烈，絨粘層的形成、解體消失以及花藥壁的形成都能清晰地觀察到，結(jié)合DIC觀察圖像，花藥的各部分結(jié)構(gòu)可以清晰看到，與現(xiàn)有的染色方法相比，具有使用安全、成本低、操作容易的特點(diǎn)，染色劑方面可節(jié)約成本90%以上（即僅是原成本的1/10），觀察結(jié)果不亞于現(xiàn)有的任何染色方法，成功率達(dá)99.9%，工作效率提高50%以上，可廣泛有效用于多種植物花藥的觀察，清晰地觀察花藥壁絨粘層和花藥壁的結(jié)構(gòu)變化，本方法特在藥用植物、農(nóng)學(xué)和植物分類、園藝學(xué)等方面的研究上有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明染色和觀察方法的簡(jiǎn)易、成本低廉及安全有效，使用效果和染色質(zhì)量之好是未曾料到的，其顯著進(jìn)步是現(xiàn)行方法無(wú)可相比的，是石蠟切片染色方法的一大創(chuàng)造，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。