本發(fā)明屬于化合物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)的化合物，它們分子中有一個(gè)酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強(qiáng)酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)(苷元)的形式存在。絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。黃酮類化合物中有藥用價(jià)值的化合物很多，如：向天果、槐米中的蘆丁和陳皮中的陳皮苷，均能降低血管的脆性及改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇，用于防治老年高血壓和腦溢血。由銀杏葉制成的舒血寧片含有黃酮和雙黃酮類，主要用于冠心病及心絞痛的治療。全合成的乙氧黃酮又名心脈舒通或立可定，有擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈流量的作用。許多黃酮類成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，還能護(hù)肝、可解肝毒、抗真菌，用于治療急/慢性肝炎及肝硬化。

毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(英文名稱為：Capillary Electrophoresis Electrochemiluminescence，簡稱：CE-ECL)兼有CE微量(即樣品消耗量少)、迅速、高效和ECL高選擇性及高靈敏性(檢測(cè)限可達(dá)10^-12-10^-18mol/L)等特點(diǎn)。聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)₃²⁺)電化學(xué)發(fā)光是一種高靈敏度的檢測(cè)手段，其技術(shù)簡單、靈敏度高、線性范圍寬、分析控制性強(qiáng)，無須外加光源及分光系統(tǒng)，避免了雜散光和光源不穩(wěn)定的影響。聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)₃²⁺)與CE-ECL聯(lián)用技術(shù)是兼?zhèn)涓咝щ娪痉蛛x和靈敏電化學(xué)檢測(cè)的一種極具應(yīng)用潛力的新型分析技術(shù)。胺類化合物在聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)₃²⁺)體系中具有良好的電化學(xué)發(fā)光效應(yīng)。近年來，毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光被廣泛應(yīng)用于含氨基團(tuán)物質(zhì)和胺類藥物的研究。

就現(xiàn)有技術(shù)而言，黃酮類化合物的分析檢測(cè)通常是使用紫外分光光度法、高效液相色譜及液相質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)，但這些方法普遍存在樣品消耗量大的問題，無法對(duì)某些特殊珍貴的微量樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。而采用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行檢測(cè)分析則具有檢測(cè)限低、樣品消耗少及分離效率高的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。另外，黃酮類化合物普遍存在化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，容易在樣品分析或儲(chǔ)藏過程中發(fā)生氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確，而將黃酮類化合物衍生為穩(wěn)定的叔胺類化合物，能降低樣品氧化造成的分析結(jié)果不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具有檢測(cè)限低、樣品消耗少及分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1、吸取黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，向吸取的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中添加醋酸鹽緩沖液，經(jīng)混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度計(jì)對(duì)溶液Ⅰ-A進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-A；分別采用二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺與黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液在醋酸鹽緩沖液中反應(yīng)，得到五種溶液，用紫外分光光度計(jì)波譜掃描法分別檢驗(yàn)五溶液，并將得到結(jié)果與對(duì)照組圖Ⅰ-A進(jìn)行比較，判斷是否發(fā)生叔胺衍生化反應(yīng)；

步驟2、在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得電化學(xué)發(fā)光基準(zhǔn)圖，即圖Ⅱ-A；分別在五個(gè)毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液，再分別加入經(jīng)步驟1得到的五種溶液，分別經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得五種對(duì)照?qǐng)D，將得到的五種對(duì)照?qǐng)D與圖Ⅱ-A進(jìn)行對(duì)比，確定出電化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)的叔胺衍生化反應(yīng)試劑；

步驟3、待步驟1和步驟2完成后，制備出黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得線性范圍、檢測(cè)限、精密度、穩(wěn)定性及加樣相對(duì)回收率，以完成毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

本發(fā)明的特點(diǎn)還在于：

步驟1具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1.1、吸取250μL濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，向吸取的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中添加2500μL醋酸鹽緩沖液，經(jīng)混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度計(jì)對(duì)溶液Ⅰ-A進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-A；

分別取五份濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，且每份的量均為250μL；先向這五份黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中均添加2500μL醋酸鹽緩沖液；再分別加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，經(jīng)振蕩充分混勻后，靜置3min，分別得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺，圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺、圖Ⅰ-B-二戊胺；

步驟1.2、將步驟1.1中獲得的對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺、圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺及圖Ⅰ-B-二戊胺分別與對(duì)照組圖Ⅰ-A與進(jìn)行比較，根據(jù)吸收峰值的變化，判斷是否發(fā)生了叔胺衍生化反應(yīng)。

步驟1.1中采用的醋酸鹽緩沖液的濃度為0.4mol/L，pH值為4.5。

步驟2具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟2.1、在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得電化學(xué)發(fā)光基準(zhǔn)圖，即圖Ⅱ-A；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二甲胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二甲胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二乙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丁胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二戊胺；

步驟2.2、將經(jīng)步驟2.1得到的圖Ⅱ-B-二甲胺、圖Ⅱ-B-二乙胺、圖Ⅱ-B-二丙胺、圖Ⅱ-B-二丁胺及圖Ⅱ-B-二戊胺分別與圖Ⅱ-A進(jìn)行比較，確定出電化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)的叔胺衍生化反應(yīng)試劑：二丙胺。

步驟2中聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液包括有5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺和50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液。

步驟3具體按照以下步驟實(shí)施：

黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液具體按照以下步驟制備：

在容器內(nèi)依次加入84μL的醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)、10μL濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液及3μL的二丙胺，混合均勻后靜置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺經(jīng)反應(yīng)后成為三丙胺，即得到濃度為10mg/L～20mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液；

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件具體按照以下方法實(shí)施：

將濃度為10mg/L～20mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液作為待檢樣品，進(jìn)樣緩沖液采用硼酸鹽緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，依次優(yōu)化進(jìn)樣緩沖液-硼酸鹽緩沖液濃度10mmol/L～200mmol/L，進(jìn)樣緩沖液-硼酸鹽緩沖液pH 5.0～8.5，檢測(cè)電位，分離電壓、進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間，完成對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化；

線性范圍的獲得方法具體如下：

線性范圍的獲得方法具體如下：

對(duì)檢測(cè)終濃度為10ng/mL～2000ng/mL范圍內(nèi)黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液，以濃度遞增20％方式從10ng/mL開始設(shè)置濃度梯度，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程分析，將相關(guān)性系數(shù)R²＞9.5的區(qū)域視為線性范圍；

檢測(cè)限：S/N＝3時(shí)的濃度為檢測(cè)限濃度，S為峰高，N為基線噪音，即峰高約在基線噪音高的3倍；

精密度：在線性范圍內(nèi)，隨機(jī)選擇固定濃度的黃酮標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液進(jìn)行5～10次重復(fù)檢測(cè)，得到其遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即RSD，標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的精密度；

穩(wěn)定性：每隔12h，重復(fù)精密度的操作過程，持續(xù)48h，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

加樣相對(duì)回收率：在已知濃度的樣品里加該樣品量的80％、100％、120％的對(duì)照品，然后測(cè)定結(jié)果各3次共9次，將得到的結(jié)果減去已知的量再除以加入量即為回收率，回收率試驗(yàn)至少要進(jìn)行3次試驗(yàn)，n＝3，或三組平行試驗(yàn)n＝6。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，與現(xiàn)有的紫外分光光度法、液相色譜法及液相質(zhì)譜聯(lián)用等方法相比，具有樣品消耗少(pL級(jí))、設(shè)備簡單及分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，非常適合珍貴樣品的分析檢測(cè)。

(2)本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法其原理是：利用黃酮類化合物含有酮式羰基，可與仲胺在酸性條件下反應(yīng)生成叔胺類化合物，形成的叔胺類化合物可利用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)。

(3)本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，經(jīng)衍生化以后，將黃酮類化合物衍生為化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的叔胺類化合物，降低了樣品氧化造成的分析結(jié)果不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)。

(4)本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具有分離效率好、靈敏度高、樣品消耗量少、分析周期短、分析設(shè)備簡單以及設(shè)備可小型化的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是實(shí)施例中的對(duì)照組圖Ⅰ-A；

圖2是實(shí)施例中的圖Ⅰ-B-二甲胺；

圖3是實(shí)施例中的圖Ⅰ-B-二乙胺；

圖4是實(shí)施例中的圖Ⅰ-B-二丙胺；

圖5是實(shí)施例中的圖Ⅰ-B-二丁胺；

圖6是實(shí)施例中的圖Ⅰ-B-二戊胺。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

毛細(xì)管電化學(xué)發(fā)光技術(shù)不能檢測(cè)黃酮類化合物，但是聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)₃²⁺)與叔胺類化合物可以發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，且具有很強(qiáng)的發(fā)光效應(yīng)。若能利用衍生化反應(yīng)，將黃酮類化合物轉(zhuǎn)化為叔胺類化合物，則可使用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)黃酮類化合物的目的。

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中都含有酮基，其結(jié)構(gòu)式具體如下：

含有酮基的化合物在酸性條件下能與仲胺反應(yīng)生成叔胺類化合物，其反應(yīng)式具體如下：

本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1、吸取黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，向吸取的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中添加醋酸鹽緩沖液，經(jīng)混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度計(jì)對(duì)溶液Ⅰ-A進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-A；分別采用二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺與黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液在醋酸鹽緩沖液中反應(yīng)，得到五種溶液，用紫外分光光度計(jì)波譜掃描法分別檢驗(yàn)五溶液，并將得到結(jié)果與對(duì)照組圖Ⅰ-A進(jìn)行比較，判斷是否發(fā)生叔胺衍生化反應(yīng)，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1.1、吸取250μL濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，向吸取的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中添加2500μL醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)，經(jīng)混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度計(jì)對(duì)溶液Ⅰ-A進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-A；

分別取五份濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液，且每份的量均為250μL；先向這五份黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液中均添加2500μL醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)；再分別加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，經(jīng)振蕩充分混勻后，靜置3min，分別得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行波譜掃描，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺，圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺、圖Ⅰ-B-二戊胺；

步驟1.2、將步驟1.1中獲得的對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺、圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺及圖Ⅰ-B-二戊胺分別與對(duì)照組圖Ⅰ-A與進(jìn)行比較，根據(jù)吸收峰值的變化(吸收峰發(fā)生藍(lán)移或者消失，且峰高趨向于扁平變化，則認(rèn)為發(fā)生了叔胺衍生化反應(yīng))，判斷是否發(fā)生了叔胺衍生化反應(yīng)。

步驟2、在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得電化學(xué)發(fā)光基準(zhǔn)圖，即圖Ⅱ-A；分別在五個(gè)毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液，再分別加入經(jīng)步驟1得到的五種溶液，分別經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得五種對(duì)照?qǐng)D，將得到的五種對(duì)照?qǐng)D與圖Ⅱ-A進(jìn)行對(duì)比，確定出電化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)的叔胺衍生化反應(yīng)試劑，具體按照以下方法實(shí)施：

步驟2.1、在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得電化學(xué)發(fā)光基準(zhǔn)圖，即圖Ⅱ-A；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二甲胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二甲胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二乙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丁胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二戊胺；

步驟2.2、將經(jīng)步驟2.1得到的圖Ⅱ-B-二甲胺、圖Ⅱ-B-二乙胺、圖Ⅱ-B-二丙胺、圖Ⅱ-B-二丁胺及圖Ⅱ-B-二戊胺分別與圖Ⅱ-A進(jìn)行比較，確定出電化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)的叔胺衍生化反應(yīng)試劑，比如：二丙胺。

步驟3、待步驟1和步驟2完成后，制備出黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得線性范圍、檢測(cè)限、精密度、穩(wěn)定性及加樣相對(duì)回收率，以完成毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，具體方法分別如下：

黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液具體按照以下步驟制備：

在容器內(nèi)依次加入84μL的醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)、10μL濃度為100mg/L～200mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品母液及3μL的二丙胺，混合均勻后靜置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺經(jīng)反應(yīng)后成為三丙胺，即得到濃度為10mg/L～20mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液；

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件具體按照以下方法實(shí)施：

將濃度為10mg/L～20mg/L的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液作為待檢樣品，進(jìn)樣緩沖液采用硼酸鹽緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，依次優(yōu)化進(jìn)樣緩沖液-硼酸鹽緩沖液濃度10mmol/L～200mmol/L，進(jìn)樣緩沖液-硼酸鹽緩沖液pH 5.0～8.5，檢測(cè)電位，分離電壓、進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間，完成對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化；

線性范圍的獲得方法具體如下：

對(duì)檢測(cè)終濃度為10ng/mL～2000ng/mL范圍內(nèi)黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液，以濃度遞增20％方式從10ng/mL開始設(shè)置濃度梯度，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程分析，將相關(guān)性系數(shù)R²＞9.5的區(qū)域視為線性范圍；

檢測(cè)限：S/N＝3時(shí)的濃度為檢測(cè)限濃度，S為峰高，N為基線噪音，即峰高約在基線噪音高的3倍；

精密度：在線性范圍內(nèi)，隨機(jī)選擇固定濃度的黃酮標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液進(jìn)行5～10次重復(fù)檢測(cè)，得到其遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的精密度；

穩(wěn)定性：每隔12h，重復(fù)精密度的操作過程，持續(xù)48h，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

加樣相對(duì)回收率：在已知濃度的樣品里加該樣品量的80％、100％、120％的對(duì)照品，然后測(cè)定結(jié)果各3次共9次，將得到的結(jié)果減去已知的量再除以加入量即為回收率，回收率試驗(yàn)至少要進(jìn)行3次試驗(yàn)(n＝3)，或三組平行試驗(yàn)(n＝6)。

實(shí)施例

矢車菊-3-O-葡萄糖苷的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法：

目前，將主要的天然黃酮類化合物分類為：黃酮類(flavones)、黃酮醇(flavonol)、二氫黃酮類(flavonones)、二氫黃酮醇類(flavanonol)、花色素類(anthocyanidins)、黃烷-3，4二醇類(flavan-3,4-diols)、雙苯吡酮類(xanthones)、查爾酮(chalcones)和雙黃酮類(biflavonoids)等十五種；其中，自然界中花色素類化合物約有600多種；

這里以矢車菊-3-O-葡萄糖苷的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法為例進(jìn)行說明，具體如下：

取100mg/L～200mg/L的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品母液250μL，并向其中添加2500μL醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)，經(jīng)混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度計(jì)計(jì)進(jìn)行波譜掃描，如圖1所示，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-A；

分別取五份濃度為100mg/L～200mg/L的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品母液，且每份的量均為250μL；先向這五份矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品母液中均添加2500μL醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)；再分別加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，經(jīng)振蕩充分混勻后，靜置3min，分別得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行波譜掃描，分別如圖2、圖3、圖4、圖5及圖6所示，獲得對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺，圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺、圖Ⅰ-B-二戊胺；

將獲得的對(duì)照組圖Ⅰ-B-二甲胺、圖Ⅰ-B-二乙胺、圖Ⅰ-B-二丙胺、圖Ⅰ-B-二丁胺及圖Ⅰ-B-二戊胺分別與對(duì)照組圖Ⅰ-A與進(jìn)行比較，根據(jù)吸收峰值的變化，判斷是否發(fā)生了叔胺衍生化反應(yīng)；將圖2～圖6分別與圖1對(duì)比可知：吸收峰發(fā)生藍(lán)移或者消失，且峰高趨向于扁平變化；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得電化學(xué)發(fā)光基準(zhǔn)圖，即圖Ⅱ-A；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/L pH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二甲胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二甲胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二乙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丙胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二丁胺；

在毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)池中加入聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸鹽緩沖液)300μL，再加入1μL經(jīng)步驟1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，經(jīng)循環(huán)伏安法檢測(cè)，待穩(wěn)定后獲得圖Ⅱ-B-二戊胺；

步驟2.2、將經(jīng)步驟2.1得到的圖Ⅱ-B-二甲胺、圖Ⅱ-B-二乙胺、圖Ⅱ-B-二丙胺、圖Ⅱ-B-二丁胺及圖Ⅱ-B-二戊胺分別與圖Ⅱ-A進(jìn)行比較，確定出電化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)的叔胺衍生化反應(yīng)試劑，即二丙胺；

毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光分析方法的實(shí)施具體如下：

矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液的制備具體如下：

在容器中依次加入84μL的醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 4.5)，10μL濃度為100mg/L～200mg/L矢車菊花青苷標(biāo)準(zhǔn)品母液及3μL的二丙胺，混合均勻后靜置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺經(jīng)反應(yīng)后形成三丙胺，得到濃度為10mg/L～20mg/L矢車菊-3-O-葡萄糖苷衍生化母液；

對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化處理，方法具體如下：

以制備得到的濃度為10mg/L～20mg/L矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液為待檢樣品，進(jìn)樣緩沖液為硼酸鹽緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，依次優(yōu)化進(jìn)樣緩沖液濃度10mmol/L～200mmol/L，進(jìn)樣緩沖液pH 5.0～8.5，檢測(cè)電位，分離電壓、進(jìn)樣電壓，進(jìn)樣時(shí)間，以完成實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化處理；

獲取線性范圍、檢測(cè)限、精密度、穩(wěn)定性、加樣相對(duì)回收率，具體如下：

在最佳檢測(cè)條件下，測(cè)定系列不同濃度的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算獲得線性范圍及檢測(cè)限；

在線性范圍內(nèi)，隨機(jī)選擇固定濃度的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品衍生化母液進(jìn)行5～10次重復(fù)檢測(cè)，得到其遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的精密度；每隔12小時(shí)，重復(fù)此過程，持續(xù)48小時(shí)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

加樣相對(duì)回收率：在已知矢車菊-3-O-葡萄糖苷濃度的樣品里加該樣品量的80％、100％、120％的對(duì)照品，然后測(cè)定結(jié)果各3次共9次，結(jié)果減去已知的量再除以加入量就是回收率；回收率試驗(yàn)至少需進(jìn)行3次試驗(yàn)(n＝3)，或三組平行試驗(yàn)(n＝6)。

本發(fā)明一種黃酮類化合物的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具有檢測(cè)限低、樣品消耗少及分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。