本發(fā)明涉及元素檢測領(lǐng)域，為一種全新的試劑盒組成，用于icp-ms檢測人血清中的元素。
背景技術(shù)：
：：根據(jù)人體內(nèi)元素含量的多少，礦物質(zhì)又可以被分為常量元素和微量元素，其中常量元素是指占人體比重超過萬分之一的元素，包括鈣(ca)、鈉(na)、磷(p)、鉀(k)、鎂(mg)、氯(cl)和硫(s)等。而微量元素則是指含量處于人體總量的萬分之一以下，且日需攝入量低于100mg微量元素。1995年，微量元素中的銅(cu)、鈷(co)、鉻(cr)、鐵(fe)、氟(f)、碘(i)、錳(mn)、鉬(mo)、硒(se)和鋅(zn)等10種元素被fao/who國際組織的專家委員會列為維持人體正常生命活動所不可缺少的必需微量元素，其中fe又稱為半微量元素；硅(si)、鎳(ni)、硼(b)、釩(v)這四種元素則被列為可能必需微量元素，而鉛(pb)、鎘(cd)、汞(hg)、鋁(al)，鉈(ti)，砷(as)和錫(sn)等六種元素則被列為具有潛在毒性，但低劑量時可能具有功能作用的微量元素。最后是近年來各國科研工作者所重點研究的對象，如銻(sb)，鎢(w)，鋇(ba)，它們有潛在可能為人體必須的微量元素。醫(yī)學(xué)研究表明，雖然人體中微量元素的含量不多，但其對人體健康有著至關(guān)重要的作用。分子生物學(xué)的研究揭示，微量元素通過與蛋白質(zhì)和其他有機基團結(jié)合，形成了酶、激素、維生素等生物大分子，發(fā)揮著重要的生理生化功能。微量元素是構(gòu)成生物體的基本組成要素，其參與多種人體生化反應(yīng)。微量元素是許多酶的組成成分，或是酶作用的輔助因子，在人體內(nèi)有不可替代的重要作用。微量元素是維持人體正常新陳代謝和生命活動的重要物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細胞膜的通透性和維持神經(jīng)肌肉興奮性的作用，也是反映人體營養(yǎng)狀況的重要指標，元素的缺失和富集可以引起多種疾病。微量元素亦是人體組織的重要組成成分，如鐵為血紅蛋白的重要組成成分，鈣、磷、鎂為組成牙齒、骨骼的成分，在體內(nèi)成為某些酶、激素和維生素等的組成部分，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)50％-70％的酶需要微量元素的參與或激活，如硒是人體內(nèi)硒谷胱甘肽過氧化物酶的組成成分，鐵參與血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素及許多酶的合成，錳是超氧化物歧化酶的重要成分。微量元素在人體中的作用具有二重性，當(dāng)它們的攝入不足時，會使有微量元素參與的生理功能無法正常進行，引起人體生理的異常，而當(dāng)他們攝入過量時，同樣會對人體產(chǎn)生損害，導(dǎo)致產(chǎn)生疾病等。某些對人體有益的微量元素，在含量過高時同樣會對人體產(chǎn)生毒副作用，如元素硒和銅等。人體攝入過多的某些微量元素，如砷，鎘，鉛等，會導(dǎo)致人中毒。長期某些礦物質(zhì)攝入不足，或人體對其吸收、利用障礙均可引起亞臨床缺乏癥狀甚至缺乏病，如缺鐵性貧血、兒童生長發(fā)育遲緩、骨質(zhì)疏松、克山病等，而盲目過量補礦物質(zhì)或食用污染的食物或飲料均可能引起過量或中毒，如攝入過量鈉會增加血液循環(huán)的負荷，導(dǎo)致血壓上升，久而久之，會引發(fā)中風(fēng)和心血管疾病。由于微量元素在人體中的作用的二重性，正常人體中對于微量元素是有一定的范圍的，若低于或高于此范圍提示身體的異常狀態(tài)。對于有益元素，鈣、鎂、鐵、鋅、硒等，若人血清中的含量低于標準范圍，提示該進行相應(yīng)的補充，或提示與相應(yīng)疾病如缺鐵性貧血、兒童生長發(fā)育遲緩、骨質(zhì)疏松、克山病的相關(guān)性。對于有害元素，鉛、鎘、汞、砷、鉈等，若血清中含量超限則提示中毒，必須進行相應(yīng)的解毒措施。對于與特異性疾病相關(guān)的一些微量元素，其含量的變化提示疾病的發(fā)展階段及預(yù)后情況。人體元素分析涉及的生物檢材有血液、尿液、頭發(fā)、骨頭和指甲等，其中最常用的是血液。研究表明，機體內(nèi)含鐵fe、銅cu、鋅zn總量減少時，均可減弱免疫能力，助長細菌感染，而且感染后的死亡率亦較高等；當(dāng)部分微量元素(重金屬元素)超過一定濃度時，可引起急性中毒或在人體內(nèi)畜積產(chǎn)生長久的毒害作用。尤其隨現(xiàn)今工業(yè)的發(fā)展，金屬污染涉及到了人類活動的各個領(lǐng)域，當(dāng)各金屬元素濃度超過一定生物接觸限值時即可引起中毒。研究表明，人體毒物或毒物代謝物的含量測定，是臨床上證實毒物中毒的最關(guān)鍵的客觀依據(jù)，生物材料中有毒物質(zhì)的增高能說明毒物在體內(nèi)的過度吸收。因此準確、快速的微量元素分析及檢測結(jié)果的醫(yī)學(xué)評價，對人體疾病診斷和環(huán)境、職業(yè)健康研究的生物監(jiān)測提供有力依據(jù)。此外，在掃毒禁毒中，對于各類新型毒品的微量元素的檢測已經(jīng)成為掃毒禁毒工作中的重點，而對于司法實踐工作中，以無機元素毒物投毒和自殺等案件也時有發(fā)生，例如在法醫(yī)學(xué)鑒定中，需要準確、快速對中毒原因和中毒程度作出判斷，但無機元素目標物的不確定性以及毒物種類的廣泛性，導(dǎo)致元素檢測存在一定的復(fù)雜性，且不同元素的急性中毒可能會出現(xiàn)相似的癥狀。另外，在體內(nèi)興奮劑的檢測工作中，由于各種新型興奮劑具有的代謝快、殘留低、難檢測的特點，對于超時的代謝后的興奮劑的微量成分的檢測，也一直成為體育界反興奮劑工作的研究熱點。因此，除了疾病診斷和環(huán)境、職業(yè)病等健康監(jiān)測工作中，在司法、執(zhí)法工作以及其他領(lǐng)域中(如反興奮劑工作)中進行準確、快速的無機元素分析及檢測結(jié)果，對了解事實真相具有重要意義。由于血清中含有人體內(nèi)多種微量元素，血清中元素濃度能夠在很大程度上代表人體內(nèi)元素水平，對其中微量元素含量的檢測，在臨床上具有重要意義，因此人血液中元素的濃度常作為重要的生物學(xué)指標。然而，隨著微量元素與疾病關(guān)系的日益明確以及人們對健康問題的密切關(guān)注，準確、快速、方便的測定人體內(nèi)微量元素的含量，成為微量元素檢測領(lǐng)域急需解決的問題。人體體液中微量元素檢測的主要難點在于某些元素的濃度很低，甚至達到ng/l-ug/l級別，而且基體復(fù)雜，給檢測帶來干擾，因此如何準確快速的進行多元素同時測定，是亟待解決的問題。目前對于元素的檢測方法有：原子吸收光譜法(atomicabsorptionspectrometry：aas)、原子發(fā)射光譜法(atomicemissionspectrometry:aes)、原子熒光光譜法(atomicflorescencespectrometry:afs)、紫外可見分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry:uvs)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductivelycoupledplasma-massspectrometry:icp-ms)。表1：幾種不同微量元素檢測方法的特點比較血中微量元素的測定常采用原子吸收法(aas),根據(jù)原子化的方式不同，原子吸收光譜法又可以被分為石墨爐原子吸收光譜法(gf-aas)、流動注射-冷蒸汽發(fā)生原子吸收光譜法(fi-vgaas)以及火焰原子吸收光譜法(faas)。gf-aas具有取樣量少、前處理簡單、靈敏度高、能直接分析固體和高粘度液體試樣等優(yōu)點，適用于生物樣品的分析，在實際元素檢驗工作中被廣泛應(yīng)用，較為嚴重的基體干擾是其主要缺點，此外，一次只能對一種元素進行檢測，耗時較長。faas是一種經(jīng)典的分析技術(shù)，具有信號穩(wěn)定、干擾相對較小、分析速度快、操作簡單等優(yōu)點，在痕量元素檢測中多被采用。該方法的主要缺點是不適合測定分解不完全的耐高溫元素、堿土金屬元素以及共振吸收譜線在遠紫外區(qū)的元素。fi-vgaas可用于氫化物或冷蒸汽形成的元素檢測，如砷、硒、鉍、汞等。晏晟等[晏晟，李偉新，解原,原子吸收光譜法與icp-ms法測鉈的對比研究,[j]，廣東化工,2016,9:232-236],原子吸收光譜法與icp-ms法測定鉈，兩者準確度和精密度均較高，均能滿足地質(zhì)樣品的檢測要求。兩者比較而言，原子吸收光譜法操作過程較為繁瑣，檢出限與線性范圍均不如icp-ms，aas的檢出限5ug/l，icp-ms的檢出限為0.024ug/l。原子吸收光譜法的線性范圍在0～10mg/l，icp-ms法的線性范圍在0～100ug/l，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998?？垢蓴_能力較icp-ms更強。icp-ms的優(yōu)點在于能夠?qū)崿F(xiàn)多元素的同時測定，操作更為方便快速，適合大批量樣品。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductivelycoupledplasmaatomicemissionspectroscopy：icp-aes)，是一種采用電感耦合等離子體作為激發(fā)光源以及原子化裝置的原子發(fā)射光譜的分析檢測方法。icp-aes具有以下優(yōu)點：1、可以同時測定樣品中的多種元素，具有多元素同時檢測的能力；2、分析速度快，可在短時間內(nèi)定量分析多達幾十種元素；3、檢出限較低，一般為1-10ug/l；4、分析準確度和精密度高，是各種分析方法中所受干擾較小的一種，一般情況下其相對標準偏差≤10％，當(dāng)分析物濃度超過100倍檢出限時，相對標準偏差≤1％。icp-aes在實際元素分析檢測工作中應(yīng)用較為廣泛，如申治國等[申治國,徐新云,張順祥,張仁利,何雅青，icp-aes和icp-ms法測定血中微量元素[j]，現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2003,30(5)：644-645]，用icp-ms檢測學(xué)生血中砷、鉛、硒、鋇、銻、鍺，其值在0.004-1.08mg/kg，用icp-aes檢測學(xué)生血中鋁、鈣、鐵、鉀、鎂、錳、銅、鋅含量，其值在0.03-1409mg/kg。徐軍等[徐軍等，icp-ms/icp-aes法分析成年男性血清中18種元素含量參照值，廣東微量元素科學(xué)，2006,13(4):17-23]，對于k、mg、ca、na、fe采用icp-aes檢測，其檢出限為0.02-0.60ug/ml,對于as、cd、co、cr采用icp-ms檢測，其檢出限為0.005-0.1ng/ml。對于常量元素可以用icp-aes進行檢測，而對于痕量元素，其檢測限達不到痕量元素的要求，需用icp-ms檢測。電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)法使用icp焰炬作為儀器的原子化和離子化裝置，將質(zhì)譜作為檢測手段，可對元素周期表中大部分元素進行測定，同時可以滿足對測定靈敏度的要求。該方法譜圖簡單，試樣制備和進樣技術(shù)簡單，質(zhì)量掃描快速，分析速度快，運行周期短，且選擇性好，線性范圍寬，檢出限低，能進行多種元素檢測和同位素比測定，是一種前景廣闊的痕量(超痕量)無機多元素分析技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于冶金、環(huán)境、醫(yī)學(xué)、生物等領(lǐng)域，成為最強有力的元素分析技術(shù)，是一種適合檢測人體體液樣品的分析方法。icp-ms對大多數(shù)金屬元素具有ng/l級的檢出限,無需富集處理,從而減少了環(huán)境對樣品的污染,提高了分析方法的可靠性和準確性。血液的微量元素分析經(jīng)常作為疾病診斷和環(huán)境、職業(yè)健康研究的生物監(jiān)測手段。但是由于微量元素的含量很低，多數(shù)元素在ng/l-ug/l級別，而人體血液的基質(zhì)復(fù)雜，給檢測過程帶來了很多不確定影響因素，因此，在臨床上建立一套準確檢測血液微量元素的方法具有重要意義。icp-ms檢測人體中微量元素，需要首先對樣品進行前處理，由于血清成分復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、無機鹽、膽固醇等成分，復(fù)雜的基質(zhì)給測量帶來干擾，樣品前處理有助于減少基體干擾，并且適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒梢蕴岣邷y量準確度。主要前處理方法有灰化和熔融，濕法消解，微波消解以及直接稀釋法。樣品的處理，既要防止待測痕量組分因揮發(fā)逸出或生成難溶化合物或吸附于器壁不易洗脫等原因造成的損失，又要防止前處理過程中引入的污染，還要使最終得到的樣品溶液能滿足測定條件的要求，如盡可能減少或消除基體干擾等。因此選擇適當(dāng)?shù)臉悠诽幚矸椒▽Ψ治龉ぷ魇鞘种匾摹Ｈ廴诩夹g(shù)多用于含硅較多的樣品，由于其采用試劑空白較高，而血清中微量元素含量很低(ug/l～ng/l量級)，進而會對微量元素檢測造成很大影響，且熔融過程會造成元素的揮發(fā)，影響微量元素檢測的準確性和可靠性，而灰化法由于器皿在處理過程中會引入較大的干擾，因此血清樣品前處理不采用熔融和灰化方法。濕法消化是在生物樣品的痕量元素分析中一種可以使用的方法，雖然痕量元素在消解過程中揮發(fā)損失比灰化小，由于血清中微量元素含量很低，其同樣會干擾微量元素測定結(jié)果，故在血清微量元素檢測中同樣不宜采用。微波消解是近年來在生物樣品消化方面應(yīng)用較多，它能夠使樣品基質(zhì)中有機物分子破裂，使其轉(zhuǎn)化為澄清透明液體，將大分子轉(zhuǎn)化為無機元素形式存在，有利于icp-ms進行檢測。微波消解的過程中，由于要重復(fù)使用石英管或者特氟龍試管，兩次消解之間容易引入污染，使微量元素的檢測結(jié)果偏高。而且在消解過程中，需高溫加熱，血清樣本存在元素損失的可能性。同時應(yīng)用微波消解對血清樣品進行處理，過程繁瑣，雖然消解時間短，但消解完成后，冷卻時間較長，不利于對大樣本量的樣品檢測。直接稀釋法是通過向樣品中加入稀釋劑，對稀釋后的樣品進行直接檢測的方法。通過直接稀釋法對樣品進行前處理，能夠很好的避免消解過程中引入的干擾，同時我們采用了較高的稀釋倍數(shù)，能夠一定程度的抑制基體效應(yīng)，而且，直接稀釋法操作簡便，能夠盡量減少由于前處理過程引起的元素損失，處理樣本效率高，能夠在短時間內(nèi)對大量樣品進行前處理。本試劑盒所采用的前處理方法，為直接稀釋法處理血清樣本，適用于各種型號的icp-ms儀器平臺。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種定量檢測血清微量元素的試劑盒和檢測方法以及制備方法，可用于同時檢測人體血清中20種微量元素(鈣44ca、鎂25mg、鐵56fe、銅63cu、鋅66zn、硒78se、釩51v、鉻52cr、錳55mn、鈷59co、鎳58、60ni、砷75as、鉬96、98mo、鎘111cd、錫118sn、銻121sb、鋇137ba、汞201hg、鉈205tl、鉛207、208pb；選擇各內(nèi)標元素質(zhì)量數(shù)為鍺72ge、銦115in、镥175lu、銠103rh)。其中，所述20種元素，既包括人體生長的必需元素(如鈣，鎂，鉻，錳，鐵，鈷，鋅，硒，銅，鉬，碘)，也包括對人體有害的毒素元素(如砷，鎘，汞，鉈，鉛)，還包括成為人體必需的潛在微量元素(如釩，鎳，錫，銻，鋇)。該試劑盒所需樣品用量少，前處理簡單，檢測周期短、準確度和精密度高、檢測穩(wěn)定性好，適合于高通量樣本的檢測。因此，本發(fā)明第一目的是提供一種定量檢測血清20種微量元素的試劑盒，包括：標準溶液、稀釋液、內(nèi)標儲備液、質(zhì)控品，其中：(1)標準溶液由含有7點標準曲線濃度的20種元素標準溶液混合而成：對于元素鈣ca、鎂mg，7點標準曲線的濃度為0.1、0.2、0.5、1、5、10、20mg/l；對于元素鐵fe、銅cu、鋅zn、硒se，7點標準曲線的濃度為1、2、5、10、50、100、200ug/l；對于元素釩v,鉻cr,錳mn,鈷co,鎳ni,砷as,鉬mo,鎘cd,錫sn,銻sb,鋇ba,汞hg,鉈tl,鉛pb，7點標準曲線的濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2ug/l；然后將含有上述1-7點所對應(yīng)的20種元素分別混合成獨立的1管混合液，由此得到7管獨立的標準溶液混合液，每管均含有20種元素，另設(shè)1管稀釋液作為空白管；(2)血清質(zhì)控品分別是由20種元素的國家標準物質(zhì)和牛血清溶液配制而成。(3)稀釋液是含有2％(v/v)硝酸溶液。(4)內(nèi)標儲備液為銦,鍺,镥,銠四種元素，用稀釋液配制至濃度為100ug/l。在一個實施方案中，所述方法還包含用于承載大批量樣品的微孔平板。在一個具體實施方案中，所述平板是24孔板。在另一具體實施方案中，所述試劑盒是通過電感耦合等離子質(zhì)譜系統(tǒng)定量檢測血清20種微量元素的試劑盒。在另一實施方案中，選擇各待測元素質(zhì)量數(shù)為鈣44ca、鎂25mg、鐵56fe、銅63cu、鋅66zn、硒78se、釩51v、鉻52cr、錳55mn、鈷59co、鎳58、60ni、砷75as、鉬96、98mo、鎘111cd、錫118sn、銻121sb、鋇137ba、汞201hg、鉈205tl、鉛207、208pb；選擇各內(nèi)標元素質(zhì)量數(shù)為鍺72ge、銦115in、镥175lu、銠103rh。在另一個實施方案中，所述產(chǎn)品還包含用于采血的元素采血管。在一個具體實施方案中，所述元素采血管選自6ml的藍蓋采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)。本發(fā)明第二目的是利用上述檢測產(chǎn)品，來檢測人體血清中20種元素的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)使用元素采血管，連續(xù)采集2管血，并棄去第1管血樣和保留第2管血樣；(2)將血液靜置30min后，離心分離；(3)取2例1ml上層血清樣本，加入1ml內(nèi)標儲備液，用稀釋液定容至10ml；(4)將1g血清質(zhì)控品，用3ml超純水混勻20min后，取3例1ml血清質(zhì)控品，加入1ml內(nèi)標儲備液，用稀釋液定容至10ml；(5)通過標準溶液建立標準曲線，對血清質(zhì)控品和待測血清樣本進行20種元素的icpms分析檢測；其中步驟3和步驟4的稀釋液是2％(v/v)的硝酸。其中步驟3和步驟4的內(nèi)標儲備液是銦,鍺,镥,銠四種元素，用含有2％(v/v)硝酸配制至濃度為100ug/l。其中，步驟(5)中，首先利用20種元素標準溶液，包括1例空白，7例不同濃度的標準溶液建立標準曲線，然后計算相關(guān)系數(shù)r2，對待測血清樣本進行icpms檢測，并將所測定值代入標準曲線，計算元素的含量。在一個實施方案中，所述元素采血管選自6ml的藍蓋采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)。在一個實施方案中，樣品準備過程中所使用的試管(優(yōu)選聚丙烯)，均采用10％硝酸浸泡過夜，并用超純水清洗3遍待用。在上述任一實施方案中，所述血清是來自人體血清，其中人體血清既包括健康成年人的血清，也包括兒童和孕婦及懷疑中毒的職業(yè)人群。在上述任一實施方案中，在用聚光expec7000icp-ms對各元素的檢測中，選擇各待測元素質(zhì)量數(shù)為鈣44ca、鎂25mg、鐵56fe、銅63cu、鋅66zn、硒78se、釩51v、鉻52cr、錳55mn、鈷59co、鎳58、60ni、砷75as、鉬96、98mo、鎘111cd、錫118sn、銻121sb、鋇137ba、汞201hg、鉈205tl、鉛207、208pb；選擇各內(nèi)標元素質(zhì)量數(shù)為鍺72ge、銦115in、镥175lu、銠103rh。在另一實施方案中，所述步驟1-4為用于icp-ms檢測的血清前處理方法。在其他實施方案中，所述檢測方法用于檢測環(huán)境微量毒素污染、檢測微量興奮劑成分、人體或尸體的法醫(yī)毒物檢測。本發(fā)明第三目的提供一種制備上述定量檢測血清20種微量元素的試劑盒的方法，步驟包括：(1)配制微量元素的標準溶液儲備液將鈣ca、鎂mg元素的單元素標準液或單標液等量混合稀釋成100mg/l，得到標準溶液儲備液1；將鐵fe、銅cu、鋅zn、硒se元素的單元素標準液或單標液等量混合稀釋成10mg/l，得到標準溶液儲備液2；將鋇ba,釩v,鉻cr,錳mn,鈷co,鎳ni,砷as,鉬mo,鎘cd,錫sn,銻sb,汞hg,鉈tl,鉛pb元素的單元素標準液或單標液等量混合稀釋成10mg/l，得到標準溶液儲備液3，再把儲備液3稀釋100倍得儲備液3-1；其中，單元素標準液或單標液起始濃度均為1000mg/l；(2)配制中標液將上述標準溶液儲備液1、儲備液2、儲備液3-1配成混合中標液儲備液4、儲備液4-1、儲備液std7和std4；(3)配制7點標準曲線的標準溶液：分別從儲備液4中取2.5ml、5ml，并用稀釋液補足至9ml配制儲備液std5、std6；分別從儲備液4-1中取1ml、2ml、5ml，并用稀釋液補足至9ml配制儲備液std1、std2、std3；(4)配制內(nèi)標儲備液將內(nèi)標元素銦,鍺,镥,銠四種元素的單標液加硝酸和超純水配制成濃度為100ug/l，得到內(nèi)標儲備液，其中四種單元素標準液或單標液起始濃度均為1000mg/l。(5)配制質(zhì)控品測定外購的牛血清中的20種元素，確定其中各待測元素的含量后，根據(jù)各元素的血清中微量元素參考值上限加入各元素的標準溶液，直至將牛血清中20種元素的濃度調(diào)節(jié)至目標濃度，得到血清質(zhì)控品，并冷凍干燥和滅菌后低溫保存(6)配制稀釋液將原硝酸10ml，加入超純水定容至500ml，混勻即得稀釋液；(7)產(chǎn)品包裝將所制備的標準溶液、稀釋液、內(nèi)標儲備液、質(zhì)控品獨立包裝后，滅菌包裝成試劑盒，并于低溫保存。在一個實施方案中，所述方法還包含用于承載大批量樣品的微孔平板。在一個具體實施方案中，所述平板是24孔板。在另一個實施方案中，所述產(chǎn)品還包含用于采血的元素采血管。在一個具體實施方案中，所述元素采血管選自6ml的藍蓋采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)。本發(fā)明第四目的是提供上述試劑盒或上述方法所制備的試劑盒，用于檢測血清中微量元素的用途。在一個實施方案中，所述用途是檢測環(huán)境微量毒素污染、檢測微量興奮劑成分、人體或尸體的法醫(yī)毒物檢測。技術(shù)效果：(1)建立了一種適用于icp-ms檢測血清中微量元素的靈敏、特異的前處理試劑盒，受血清中其他成分的干擾較少。(2)檢出限低：本發(fā)明在icpms的檢測平臺上，定量檢出限在ng/l-ug/l級別，as≤100ng/l；se≤1ug/l；pb≤100ng/l；cu≤100ng/l；cd≤80ng/l；tl≤10ng/l；zn≤1ug/l；hg≤100ng/l；co≤20ng/l；mn≤100ng/l；mg≤10ng/l；ca≤100ng/l；fe≤1ug/l；v≤100ng/l；cr≤100ng/l；ni≤1ug/l；mo≤100ng/l；sn≤100ng/l；sb≤80ng/l；ba≤100ng/l。(3)專屬性強：icp-ms檢測是基于元素的質(zhì)核比，因此本發(fā)明對于血清中的微量元素檢測專屬性強，定量準確。(4)簡便安全：樣品前處理簡單、操作簡單安全、譜圖解析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計對人員要求低。(5)快速：質(zhì)量掃描快速，分析速度快，運行周期短，可實現(xiàn)批量處理，可在2分鐘內(nèi)完成1個樣本的20種元素的檢測。(6)驗證了5種不同的采血管對于采集血液過程中，管材的微量元素含量對于血清檢測的影響，并優(yōu)選采血管使用6ml的藍蓋采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)。原理與定義術(shù)語“icp-ms”是將電感耦合等離子體作為離子源的一種無機多元素分析技術(shù)，通常情況下，氬氣流由高能的射頻能量激發(fā)形成等離子體，而被檢測的樣品通過水溶液的氣溶膠的形式進入等離子體中，進行去溶劑化、汽化解離和電離。部分等離子體進入真空系統(tǒng)中，其中的正離子被按照質(zhì)荷比進行分離。電感耦合等離子體質(zhì)譜通常情況下是由樣品引入系統(tǒng)、離子源、接口部分、離子聚焦系統(tǒng)、質(zhì)量分析器、檢測系統(tǒng)這幾部分組成，此外，儀器中還配備真空系統(tǒng)、供電系統(tǒng)以及用于儀器控制與數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)。術(shù)語“元素采血管”是專用于采集生物血液或生物流體(組織液、尿液等)的專用管，該采血管通常由特殊的材料聚丙烯制成，管壁經(jīng)過特殊工藝處理，極度光滑，以避免血細胞或待測樣品液的附壁，減少標本體外溶血，其材質(zhì)應(yīng)當(dāng)不含任何由管壁硅化而帶入的外來元素。術(shù)語“檢測產(chǎn)品”，指用于檢測人體血清中元素的任何常規(guī)產(chǎn)品，包括：檢測試劑、檢測芯片(如固體芯片、液體芯片等)、檢測載體，以及檢測試劑盒等。術(shù)語“元素”指具有相同的核電荷數(shù)(即核內(nèi)質(zhì)子數(shù))的一類原子的總稱。在人體中，同一元素存在著不同質(zhì)子數(shù)的情況，例如c12、c14。本發(fā)明中對于檢測元素同位素的選擇，參考以下2個標準：選擇相對豐度較高的同位素，選擇相對干擾(氧化物，多原子等質(zhì)譜干擾)較小的同位素。以se元素為例，se存在同位素77、78、80、82，相對豐度較高的是78和80兩個同位素，而80同位素存在ar雙原子的干擾，會嚴重影響檢測結(jié)果，因此，選擇78同位素作為檢測對象。附圖說明圖1為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鎂(mg)的標準曲線。圖2為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鈣(ca)的標準曲線。圖3為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中釩(v)的標準曲線。圖4為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鉻(cr)的標準曲線。圖5為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中錳(mn)的標準曲線。圖6為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鐵(fe)的標準曲線。圖7為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鈷(co)的標準曲線。圖8為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鎳(ni)的標準曲線。圖9為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中銅(cu)的標準曲線。圖10為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鋅(zn)的標準曲線。圖11為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中砷(as)的標準曲線。圖12為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中硒(se)的標準曲線。圖13為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鉬(mo)的標準曲線。圖14為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鎘(cd)的標準曲線。圖15為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中錫(sn)的標準曲線。圖16為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中銻(sb)的標準曲線。圖17為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鋇(ba)的標準曲線。圖18為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中汞(hg)的標準曲線。圖19為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鉈(tl)的標準曲線。圖20為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定人體血清中微量元素方法中鉛(pb)的標準曲線。具體實施方式為了更好地說明本發(fā)明，下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例一：元素采血管的選擇目前，商業(yè)可購買采血管包括：no.1：規(guī)格vacutainertraceelementserum，bd公司，型號368380。no.2：規(guī)格vacutainerserum，bd公司，型號367812。no.3：規(guī)格zserumsepclotactivator，greinerbioone公司，型號454067cn。no.4：規(guī)格zserumclotactivator，greinerbioone公司，型號454204。no.5：規(guī)格vacutainersstiiadvance，bd公司，型號367957。術(shù)語“微量元素采血管”是指用于容納血樣或生物組織的特殊采血管。雖然理論上采血管材質(zhì)應(yīng)當(dāng)不含任何由管壁硅化而帶入的外來元素，但在實際生產(chǎn)過程中，由于材質(zhì)、加工設(shè)備以及空氣環(huán)境等，并不能完全避免引入外來元素。在實驗過程中，雖然可以通過陰性或陽性對照來消除背景元素，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由于部分微量元素的可檢測值已經(jīng)低于背景元素值，因此并非所有的微量元素采血管都適合本發(fā)明。鑒于本發(fā)明之前未有針對商業(yè)上的采血管的背景微量元素的相關(guān)報道，因此，發(fā)明人通過以下預(yù)備試驗，對比以上5種血清采血管，使用10％hno3溶液或水作為浸出液，確定最適宜的采血管。icp-ms檢測5種采血管中的20種元素(包含：鋁、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鉬、鎘、錫、銻、鋇、鎢、汞、鉈和鉛，與本發(fā)明的20種元素相比，少鈣和鎂，增加鎢)實驗：1儀器及工作參數(shù)本文采用agilent8800icp-qqq儀器(安捷侖公司，美國)進行元素分析，儀器配備360個樣本的agilentsps4自動進樣器(安捷倫公司，美國)，儀器的基本參數(shù)設(shè)置如表1所示。表2icpms8800儀器參數(shù)設(shè)置table2instrumentalsettings由于碰撞反應(yīng)池對于減少干擾，提高檢測限有明顯幫助，因此，對于硒元素我們采用h2模式，對于元素釩，鉻，錳，鐵，鈷，鎳，銅，鋅，我們采用he模式，元素砷采用o2模式，其余元素采用標準模式。2樣品處理對于5種不同的血液采集管，我們每種型號各取12只，向其中6只采血管注入與其額定容量相等容積的超純水，向另外6只采血管注入與其額定容量相等容積的10％hno3。然后將采集管置于混勻器上，室溫下混勻1小時。混勻后，用移液槍移取4ml浸出液至離心管，加入1ml內(nèi)標，1ml硝酸，定容至10ml。3試劑與標準溶液實驗所用超純水由milliq超純水儀制備(millipore公司，奧地利)，硝酸(≥65％,p.a.,iso,roth,karlsruhe,德國)，硝酸經(jīng)過低沸點蒸餾進行純化。實驗所用單標液，鋁、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鉬、鎘、錫、銻、鋇、鎢、汞、鉈和鉛(1000mg/l,rosa，美國)，混標液(icpmulti-elementstandardsolutionvi,merck,德國)，天然水1640a(nist，gaithersburg,美國)包含有15種元素的標定值。4樣品測定標準曲線用單標液混合進行配制，對于血液中含量較高的元素鐵，銅，鋅，硒，鋇，7點標準曲線的濃度為1,2,5,10,50,100,200ug/l，對于其余血液中含量較低的元素，7點標準曲線的濃度為0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1,2ug/l。內(nèi)標選擇銦,鍺,镥,銠四種元素，檢測溶液中的最終濃度為10ug/l。在icp-ms優(yōu)化的條件下，對處理好的樣品中的20種元素進行測定，儀器根據(jù)7點標準溶液自動建立標準曲線，并計算出被測樣本的濃度。5結(jié)果與討論5.1儀器檢出限和準確度10％硝酸作為空白溶液，同時測定這20種元素的系列標準溶液，得到元素的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。通過連續(xù)測量4次空白溶液，以其的平均值加上3倍標準偏差作為儀器的檢出限。為了檢測標準曲線的準確性，我們采用nist1640a天然水作為標準物質(zhì)，其標定元素含量范圍，本方法檢出值及相對標準偏差如表3所示。由表3可知，本方法中所檢測的20種元素信號值與濃度均呈現(xiàn)出良好的線性，相關(guān)系數(shù)均在0.9991以上。本方法檢出限低，對于元素鈷，鉬，鎘，錫，銻，鋇，鎢，汞，鉈和鉛，檢測限低于0.01μg/l；對于元素釩，鉻，錳，鎳，銅，砷和硒，檢測限低于0.1μg/l；對于元素鋁，鐵，鋅檢測限低于1ug/l。本方法的背景等效濃度低，對于元素鈷，鉬，鎘，銻，鋇，鎢，鉈和鉛，背景等效濃度低于0.01ug/l；對于元素釩，錳，砷，硒，錫和汞，背景等效濃度低于0.1ug/l；對于元素鋁，鉻，鐵，鎳，銅和鋅，背景等效濃度低于1ug/l，說明在該測量條件下，有非常好的抑制背景干擾的能力。本方法對標準物質(zhì)(天然水)的檢測結(jié)果良好，元素鋁，錳，鐵，鋅，硒，鎘，鋇，鉈和鉛的測量值均在天然水的標定范圍之內(nèi)，元素釩，鈷，銅，砷和鉬的測量值與標定值的相對標準偏差rsd小于5％，元素鉻，鎳，銻的測量值與標定值的相對標準偏差rsd小于10％。5.2樣品分析根據(jù)上述所列的儀器條件和方法，對5種采血管中的20種元素進行了測定，測定結(jié)果如表4所示。為了進一步對比采血管中元素的濃度是否會對血液元素分析造成影響，我們總結(jié)了文獻中提到的人體血液(血清、血漿、全血)元素檢測的含量范圍，以此作為判斷采血管中的元素含量是否會對檢測結(jié)果造成影響的基礎(chǔ)。人體血液(血清、血漿、全血)元素的含量范圍如表3所示。表3儀器的檢測限、背景等效濃度，天然水檢測結(jié)果，文獻中元素參考值和兩種血清采血管元素檢測值表45種采血管中20種元素含量發(fā)明人經(jīng)過比較，浸出液中(包括h2o和10％hno3作為溶劑)各種元素的含量由低到高為：采血管1<采血管2<采血管5<采血管4<采血管3根據(jù)人體血液(血清、血漿、全血)微量元素含量的參考范圍，我們詳細分析了5種采血管中微量元素含量可能對檢測結(jié)果造成的影響。我們將采血管中微量元素含量低于文獻中血液(血清、血漿、全血)微量元素含量最小值10％的，作為確定能夠檢測該種元素的采血管；介于文獻中血液微量元素含量最小值10％和最大值10％之間的，作為潛在可檢測該種元素的采血管；高于血液微量元素含量最大值的10％的，作為不可檢測該種元素的采血管。由此，我們制作了表5。表55種不同采血管對20種微量元素的分析能力注：√表示采血管中元素含量低于文獻中人體血液微量元素最小值的10％o表示采血管中元素含量介于文獻中人體血液微量元素最小值的10％和最大值的10％之間空白表示采血管中元素含量大于文獻中人體血液微量元素最大值的10％試管中的微量元素含量采用純水浸出液的檢測值由表5可知，血清微量元素采血管中，采血管1能夠完全滿足種11種元素的檢測要求，而采血管1中的元素鋁、鉻、錳、鈷、鎳和鋇的含量會一定程度上受到采血管中微量元素含量的影響，元素銻和鎢在采血管1中含量相對較高，會顯著影響血清微量元素的檢測結(jié)果。由表3可知，采血管1和采血管3對實際血清樣本檢測結(jié)果的影響，采血管1的檢測結(jié)果中幾乎所有微量元素含量都低于采血管3的檢測結(jié)果，尤其是鋁，釩，鉻，錳，砷，錫，銻等幾種元素，說明在實際采血過程中，采血管的選擇對微量元素檢測結(jié)果影響很大。因此，本發(fā)明元素采血管優(yōu)選使用6ml的藍蓋采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)。實施例二：試劑盒的生產(chǎn)及檢測要求：標準溶液的配制:1標準物質(zhì)：單標液，鈣、鎂、鐵、銅、鋅、硒、釩、鉻、錳、鈷、鎳、砷、鉬、鎘、錫、銻、鋇、汞、鉈、鉛(1000mg/l,國家有色金屬及電子材料分析測試中心)2配制中標液：硝酸、純化水、已有的標準溶液3目標濃度標準溶液的配制：標準溶液中各元素的目標濃度：4.稀釋液的配制：原硝酸：超純水＝2:98(v/v)，即得2％硝酸溶液。5.內(nèi)標儲備液的制備方法是：稱取一定質(zhì)量的銦,鍺,镥,銠的單標液與2％硝酸配制成濃度為100ug/l的內(nèi)標儲備液。6.質(zhì)控品的配制：測定外購的牛血清中的20種元素，確定其中各待測元素的含量。根據(jù)各元素的血清中微量元素參考值上限加入各元素的標準溶液，將牛血清中20種元素的濃度調(diào)節(jié)至目標濃度，混勻30min(搖勻)，離心去除纖維沉淀物。3ml/瓶分裝。冷凍干燥：-70℃預(yù)冷凍過夜，冷凍干燥機中干燥3-4天。樣品凍干后立即蓋緊瓶蓋。60co輻射滅菌，輻射劑量為2*105rad。2-8℃保存，備用。此試劑盒中的血清質(zhì)控品為本公司自制，其中的各待測元素含量更接近人體的含量水平。7.試劑盒檢測要求(1)外觀物理性狀：產(chǎn)品擁有24人份/盒，96人份/盒2種規(guī)格。產(chǎn)品外包裝清潔，無污漬，密封良好，內(nèi)外包裝濃度標識相符，內(nèi)容物齊全，構(gòu)造完整。液體內(nèi)容物清澈無沉淀及絮狀物，凍干粉為淺黃色粉末。(2)裝量試劑裝量應(yīng)不少于標示裝量或規(guī)定限。(3)準確度：用質(zhì)控參考品對試劑(盒)進行測試，平行檢測20人份，檢測結(jié)果應(yīng)與標定值一致，相對偏差應(yīng)不超過±10％。(4)檢出限用樣本稀釋液作為樣本進行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果，計算其平均值(m)和標準差(sd)，得出m+2sd。(5)精密度(5.1)重復(fù)性同一批次的某一個檢測試劑盒對檢測范圍內(nèi)某個濃度的質(zhì)控品進行重復(fù)檢測至少20次，計算20次測量結(jié)果的平均值(m)和標準差(sd)，根據(jù)公式cv＝sd/m×100％得出變異系數(shù)，變異系數(shù)cv(％)≤5％。(5.2)批內(nèi)(瓶間)差(適合凍干的質(zhì)控品)用已知濃度的質(zhì)控樣品對該批號的1個待檢試劑盒重復(fù)測試10次，計算結(jié)果的均值(2)和標準差(sd2)。根據(jù)公式cv＝sd/m×100％計算瓶間差的變異系數(shù)(cv)，批內(nèi)瓶間差均應(yīng)不大于5％。(5.3)試劑盒批間差三個批次的檢測試劑對檢測范圍內(nèi)某個已知濃度的質(zhì)控品(中陽性或強陽性)各重復(fù)檢測10次，計算30次測量結(jié)果的平均值(m)和標準差(sd)，根據(jù)公式cv＝sd/m×100％得出變異系數(shù)，變異系數(shù)cv(％)值應(yīng)≤20％。(6)穩(wěn)定性(6.1)效期穩(wěn)定性：生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)規(guī)定產(chǎn)品的有效期。取到有效期后的樣品檢測，準確度應(yīng)符合技術(shù)要求。(6.2)熱穩(wěn)定性試驗：取同一批號的產(chǎn)品，37℃放置20天，對最低檢出限、準確度、精密度進行檢驗，檢測結(jié)果應(yīng)符合要求。凍干品應(yīng)同時進行復(fù)溶穩(wěn)定性試驗，復(fù)溶后放置到有效期末，產(chǎn)品性能應(yīng)符合線性區(qū)間、準確度的技術(shù)要求。實施例三：健康人血清中20種元素的icp-ms檢測采集健康人的空腹靜脈血，按照本發(fā)明中的試劑盒的檢測程序，利用電感耦合離子體質(zhì)譜儀對血清中的20種元素(包含：鋁、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鉬、鎘、錫、銻、鋇、鈣、汞、鉈、鉛和鎂)檢測的實驗：1儀器及工作參數(shù)采用clin-icp-qms進行元素分析，儀器的調(diào)諧液為10ppbli、co、in、ba、ce、u，儀器的基本參數(shù)設(shè)置如表6所示。表6clin-icp-qms儀器參數(shù)設(shè)置由于碰撞反應(yīng)池對于減少干擾，提高檢測限有明顯幫助，因此對于待測的20種元素我們采用氦氣的碰撞池模式。2樣品處理：利用本發(fā)明中制備的試劑盒中的內(nèi)標儲備液、稀釋液、血清質(zhì)控品，按要求程序進行血樣及質(zhì)控品的前處理制備。用專用的元素采血管(368380-bdspcplusplastictubewithbdhemogardtmclosure,6ml)，普通針頭，每人采2管血，第一管血不要，第二管用來分析。將血液靜置30min。將采血管放置在離心機上，4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，常溫。取2例1ml上層血清樣本，加入1ml內(nèi)標儲備液，用2％(v/v)的稀釋液將血清樣本稀釋至10ml。使用環(huán)境溫度10～30℃,取1g質(zhì)控品復(fù)溶至超純水3ml中，混勻20分鐘。取3例1ml血清質(zhì)控品，加入1ml內(nèi)標儲備液，用2％(v/v)的稀釋液將血清質(zhì)控品稀釋至10ml。本前處理過程對于離心后的血清可在10分鐘內(nèi)進行處理并進樣分析，制樣簡單，快速，易于大批量的操作。3樣品測定：利用本發(fā)明中制備的試劑盒中的標準溶液，包括1例空白，7例不同濃度的標準溶液建立標準曲線。對于元素鈣和鎂，7點標準曲線的濃度為0.1,0.2,0.5,1,5,10,20mg/l，對于元素鐵，銅，鋅，硒，7點標準曲線的濃度為1,2,5,10,50,100,200ug/l，對于其他元素，7點標準曲線的濃度為0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1,2ug/l。產(chǎn)品基質(zhì)2％hno3溶液。內(nèi)標選擇銦,鍺,镥,銠四種元素，檢測溶液中的最終濃度為10ug/l。在icp-ms優(yōu)化的條件下，先進標準溶液，儀器根據(jù)7點標準溶液自動建立標準曲線，然后對空白溶劑、血清質(zhì)控品和待測樣本若干進行20種元素的檢測，儀器根據(jù)標準溶液建立的標準曲線計算出被測樣本的濃度。檢測結(jié)果的定量分析,根據(jù)混合元素標準溶液中待測元素信號和內(nèi)標信號的比值和混合元素標準溶液中待測元素的濃度繪制標準曲線，標準曲線需滿足r2＞0.999。利用樣品中待測元素信號和內(nèi)標信號的比值定量樣品中待測元素的含量。各元素的標準曲線見(圖1-圖20)。利用樣品中待測元素信號和內(nèi)標信號的比值定量樣品中待測元素的含量。4儀器檢出限：根據(jù)上述所列的儀器條件和方法，空白溶液為2％硝酸，連續(xù)測量11次空白溶液，4個平行樣，以其3倍標準偏差作為該方法的檢出限。說明在該測量條件下，有非常好的抑制背景干擾的能力。5.血清質(zhì)控品分析根據(jù)上述所列的儀器條件和方法，對血清質(zhì)控品進行了測定，測定結(jié)果的準確度和精密度如下：對于血清質(zhì)控品中的各元素，其檢出值均在標準值范圍內(nèi)，精密度在20％的范圍內(nèi)，即本發(fā)明對于各元素的檢測真實可信。實施例四、健康人血清的檢測根據(jù)上述所列的儀器條件和方法，對100例健康人血清進行了測定，根據(jù)測定結(jié)果并結(jié)合大量文獻數(shù)據(jù)，初步確定人血清中20種元素的含量范圍：把待測樣本中的各元素含量值，與以上標準進行對比，可以初步推斷人體中20種元素的水平是否在正常范圍內(nèi)，及時實施相應(yīng)的治療及保健措施。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
：的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護范圍為準。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12