本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種基于石墨烯量子點(diǎn)修飾電極的蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器件的構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

石墨烯量子點(diǎn)

當(dāng)石墨烯的尺寸縮小至100納米以?xún)?nèi)時(shí)，它具有量子約束電子狀態(tài)，因此稱(chēng)之為石墨烯量子點(diǎn)(gqds)。由于石墨烯量子點(diǎn)在水相及有機(jī)溶劑中都表現(xiàn)出良好的分散性能、優(yōu)良的光電學(xué)性能、良好的化學(xué)穩(wěn)定性和低毒性等特性，所以受到了研究人員的廣泛關(guān)注，并有望應(yīng)用在電化學(xué)生物傳感器的研究方面。

蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器

電化學(xué)生物傳感器是將生物活性材料與電化學(xué)換能器結(jié)合起來(lái)構(gòu)建的生物傳感器，它具有制作簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。這種傳感器中使用的生物活性材料包括酶和蛋白質(zhì)、微生物、細(xì)胞、組織、核酸、抗體、抗原等，其中蛋白質(zhì)的使用最為普遍也最具代表性。近年來(lái)，電化學(xué)蛋白質(zhì)傳感器的研究受到了廣泛的關(guān)注。常見(jiàn)的氧化還原蛋白質(zhì)主要有肌紅蛋白(mb)、血紅蛋白(hemoglobin，hb)、辣根過(guò)氧化物酶(hrp)、細(xì)胞色素c(cytc)等。而hb是一種氧化還原蛋白質(zhì)，主要負(fù)責(zé)高等生物體內(nèi)儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧。蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)都發(fā)生在帶電荷的生物膜或其附近，因而其電子的傳遞必然要受到電場(chǎng)的作用或影響，這與電化學(xué)研究中工作電極或其附近的情況相似。因此氧化還原蛋白質(zhì)在電極上的直接電化學(xué)研究，可以為研究生命體內(nèi)的電子交換提供模型，對(duì)理解和認(rèn)識(shí)它們真實(shí)的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。

本發(fā)明利用滴涂法在離子液體碳糊電極表面逐層修飾gqds，hb和nafion膜，自然晾干后，成功得到修飾電極nafion/hb/gqds/cile，實(shí)現(xiàn)了hb的直接電化學(xué)，并研究了該電化學(xué)傳感器對(duì)三氯乙酸的電催化還原性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于石墨烯量子點(diǎn)修飾電極的蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器件，通過(guò)滴涂法在離子液體碳糊電極(cile)表面修飾gqds、hb和nafion膜，得到相應(yīng)的修飾電極(nafion/hb/gqds/cile)，構(gòu)建了蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器。通過(guò)電化學(xué)方法對(duì)上述所制備的的傳感器進(jìn)行研究，結(jié)果顯示hb出現(xiàn)一對(duì)可逆性良好的氧化還原峰，說(shuō)明gqds的存在使得hb與電極的直接電子轉(zhuǎn)移得以實(shí)現(xiàn)，該傳感器對(duì)tca表現(xiàn)出良好的電催化還原性能。

本發(fā)明提供一種電極，其特征在于該電極包括基底電極、石墨烯量子點(diǎn)(gqds)涂層、血紅蛋白(hb)涂層、nafion涂層，所述基底電極為離子液體修飾碳糊電極(cile)。

本發(fā)明提供一種由內(nèi)向外依次為cile基底電極、gqds涂層、hb涂層、nafion涂層的電極，即nafion/hb/gqds/cile電極。

本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器件，其特征在于以本發(fā)明上述電極作為工作電極，優(yōu)選以nafion/hb/gqds/cile作為工作電極。

本發(fā)明提供一種制備上述電極的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取適量的石墨粉和正己基吡啶六氟磷酸鹽，混合研磨均勻得到碳糊，在玻璃電極管中塞入碳糊后壓實(shí)，內(nèi)插銅線作為導(dǎo)線，即得離子液體碳糊電極(cile)，使用前在打磨紙上打磨至鏡面；

(2)取一定量的石墨烯量子點(diǎn)(gqds)加入適量水中，超聲分散得到均一的懸浮液，將該懸浮液，滴涂在步驟(1)得到的離子液體碳糊電極(cile)表面，自然晾干，即得gqds/cile電極；

(3)將一定濃度的血紅蛋白(hb)溶液滴涂在步驟(2)得到的gqds/cile電極表面，自然晾干，即得到hb/gqds/cile電極；

(4)將一定濃度的nafion溶液，滴涂在步驟(3)制備的hb/gqds/cile電極表面，自然晾干，即得到nafion/hb/gqds/cile電極。

上述制備方法中，步驟(1)中石墨粉與正己基吡啶六氟磷酸鹽的質(zhì)量比為2:1，所用的玻璃電極管的內(nèi)徑為3～4mm；步驟(2)中石墨烯量子點(diǎn)(gqds)與水的用量為每毫升水中加入0.2-2.0mg石墨烯量子點(diǎn)(gqds)，優(yōu)選每毫升水中加入1.0mg石墨烯量子點(diǎn)(gqds)；步驟(3)中所述血紅蛋白(hb)溶液的濃度為10-30mg/ml(即每毫升水中含hb10-30mg)；步驟(4)中所述nafion溶液為杜邦d520型溶液或者用乙醇稀釋5-10倍體積的杜邦d520型溶液。

本發(fā)明制備方法中使用的水，優(yōu)選為蒸餾水，進(jìn)一步優(yōu)選為二次蒸餾水。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出了一種基于石墨烯量子點(diǎn)修飾電極的蛋白質(zhì)電化學(xué)傳感器，其優(yōu)越性體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)按照本發(fā)明方法所得nafion/hb/gqds/cile電極具有成本較低，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，步驟少，操作容易等優(yōu)點(diǎn)；(2)本發(fā)明在電極中引入gqds能有效提高蛋白質(zhì)與電極結(jié)合的活性表面積，gqds的存在有利于固定更多的hb分子，并加快了電極表面電子的轉(zhuǎn)移速率，降低了電荷轉(zhuǎn)移電阻，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子與電極之間的直接電子傳輸，實(shí)現(xiàn)hb的直接電化學(xué)；(3)制得的nafion/hb/gqds/cile可用于tca的電催化測(cè)定，且具有催化活性高，穩(wěn)定性好，靈敏度高，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1：不同ph值pbs緩沖液(ph值的范圍為4.0～8.0)對(duì)nafion/hb/gqds/cile中hb的直接電化學(xué)行為的影響，電位窗口為-0.8～0.4v，掃描速度100mv/s；圖1包含a、b兩圖，a:ph為4-8范圍內(nèi)的循環(huán)伏安疊加圖；b:示電位e^0’與不同ph值pbs緩沖液的線性關(guān)系圖

圖2：不同掃描速度(a→k:50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000mv/s)對(duì)nafion/hb/gqds/cile中hb直接電化學(xué)行為的影響，電位窗口為-0.8～0.2v，電解液為ph5.0的pbs；圖2包含a、b、c兩圖，a:不同掃描速度下的循環(huán)伏安疊加圖；b:氧化還原峰電流與掃速的線性關(guān)系圖；c:氧化還原峰電位與lnυ的線性關(guān)系圖

圖3：不同修飾電極(a-d分別為cile、nafion/hb/cile、nafion/gqds/cile、nafion/hb/gqds/cile)的循環(huán)伏安曲線，電位窗口為-0.8～0.2v，電解液為ph5.0的pbs，掃描速度為100mv/s。

圖4：修飾電極在不同濃度tca存在下的循環(huán)伏安圖(a到k為6.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0,80.0,90.0,100.0mmol/l)；電位窗口為-0.8～0.2v，電解液為ph5.0的pbs，掃描速度為100mv/s。(插圖為峰電流與tca濃度之間的關(guān)系曲線)

圖5：不同修飾電極的電化學(xué)交流阻抗譜圖：(a)nafion/gqds/cile,(b)nafion/hb/gqds/cile,(c)nafion/hb/cile；電解液10.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl混合溶液，掃描速度100mv/s。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍

以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售

實(shí)施例1

(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取1.6g石墨粉和0.8g正己基吡啶六氟磷酸鹽，放入研缽中，研磨均勻得到碳糊，然后將上述碳糊填入長(zhǎng)度為5cm，內(nèi)徑為4mm的玻璃電極管中用力壓實(shí)，內(nèi)插一根銅線作為導(dǎo)線，得到離子液體碳糊電極(cile)，使用前在潔凈的打磨紙上將碳糊電極表面打磨成鏡面。

(2)準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg的gqds放入5ml二次蒸餾水中，超聲分散均勻，得到濃度為2.0mg/ml的gqds溶液。以該濃度溶液為母液，配制濃度分別為0.2mg/ml,0.4mg/ml,0.6mg/ml,0.8mg/ml,1.0mg/ml,1.2mg/ml,1.4mg/ml,1.6mg/ml的溶液。以步驟(1)制備得到的碳糊電極(cile)為基底電極，將上述所配制的不同濃度的gqds溶液分別涂布在cile表面，自然晾干后，得到gqds/cile電極。

(3)準(zhǔn)確稱(chēng)取30mg的hb，加入1ml水配制成30mg/ml的hb水溶液，然后將其稀釋?zhuān)纯傻玫綕舛葹?5mg/ml的hb水溶液。用移液槍準(zhǔn)確量取10μl杜邦d520型溶液，再加入90μl乙醇，即得所需nafion溶液。依次對(duì)步驟(2)制備得到的不同濃度的gqds修飾得到的電極gqds/cile電極分層滴涂一定量的上述hb溶液和nafion溶液，自然晾干后，依次將上述所制備的不同濃度的gqds修飾電極置于ph7.0pbs中，對(duì)其進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：gqds溶液在離子液體碳糊電極表面上的最優(yōu)濃度為1.0mg/ml。

實(shí)施例2

(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取2g石墨粉和1g正己基吡啶六氟磷酸鹽，放入研缽中，研磨均勻得到碳糊，然后將上述碳糊填入長(zhǎng)度為7cm，內(nèi)徑為3mm的玻璃電極管中用力壓實(shí)，內(nèi)插一根銅線作為導(dǎo)線，得到離子液體碳糊電極(cile)，使用前在潔凈的打磨紙上將碳糊電極表面打磨成鏡面。

(2)準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg的gqds放入5ml二次蒸餾水中，超聲分散均勻，得到濃度為2.0mg/ml的gqds溶液。以該濃度溶液為母液，配制濃度分別為0.2mg/ml,0.4mg/ml,0.6mg/ml,0.8mg/ml,1.0mg/ml,1.2mg/ml,1.4mg/ml,1.6mg/ml的溶液。以步驟(1)制備得到的碳糊電極(cile)為基底電極，將上述所配制的不同濃度的gqds溶液分別涂布在cile表面，自然晾干后，得到gqds/cile電極。

(3)準(zhǔn)確稱(chēng)取20mg的hb，加入1ml水配制成20mg/ml的hb水溶液，然后將其稀釋?zhuān)纯傻玫綕舛葹?0mg/ml的hb水溶液。依次對(duì)步驟(2)制備得到的不同濃度的gqds修飾得到的電極gqds/cile電極分層滴涂一定量(6-10μl)的上述hb溶液和杜邦d520型溶液，自然晾干后，依次將上述所制備的不同濃度的gqds修飾電極置于ph7.0pbs中，對(duì)其進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：gqds溶液在離子液體碳糊電極表面上的最優(yōu)濃度為1.0mg/ml。

實(shí)施例3

用適量(6-10μl)10mg/ml的hb水溶液滴涂實(shí)施例1步驟(1)得到的cile電極，自然晾干后，再用適量(6-10μl)實(shí)施例1步驟(3)配制的nafion溶液涂布，自然晾干后，得到nafion/hb/cile；

用適量(6-10μl)實(shí)施例1步驟(3)配制的nafion溶液滴涂實(shí)施例1步驟(2)得到的gqds/cile電極，自然晾干后，得到nafion/gqds/cile。

實(shí)施例4

配制ph值分別為4.0,5.0,6.0,7.0,8.0的pbs，并以上述配制的溶液為電解液，以nafion/hb/gqds/cile電極(實(shí)施例1制備的1.0mg/ml濃度的gqds修飾)為工作電極，鉑片為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，探索其在不同ph緩沖溶液中的電化學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，表明最佳條件為ph5.0pbs，此時(shí)氧化還原峰電流最大且峰電位差最小。

實(shí)施例5

對(duì)nafion/hb/gqds/cile(實(shí)施例1制備的1.0mg/ml濃度的gqds修飾)進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，研究了掃速對(duì)該電極的影響，見(jiàn)圖2，電解液為ph5.0pbs緩沖溶液，鉑片為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，在電位窗口-0.8～0.2v內(nèi)，掃描速度分別為50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000mv/s的條件下進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。氧化還原峰電流和掃速呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2(b)，線性回歸方程為ipc(μa)＝58.95υ(mv/s)+22.25(γ＝0.983)和ipa(μa)＝-92.49υ(mv/s)-33.96(γ＝0.997)，說(shuō)明電極表面上的電極反應(yīng)過(guò)程為擴(kuò)散控制過(guò)程。根據(jù)法拉第定律：q＝nafγ*，計(jì)算可得：hb的電極覆蓋度γ*的值為3.46×10^-9mol/cm²，在實(shí)驗(yàn)中固定在修飾電極表面上的hb的總濃度為1.48×10^-8mol/cm²，電活性hb在電極表面的比率約為23.38％，即有23.38％hb參與電化學(xué)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：引入gqds能有效提高蛋白質(zhì)與電極結(jié)合的活性表面積，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子與電極之間的直接電子傳輸。掃速增加使氧化峰電位發(fā)生正移，同時(shí)還原峰電位發(fā)生負(fù)移，但曲線形狀沒(méi)有特別顯著的變化，峰電位ep與lnυ呈線性關(guān)系，見(jiàn)圖2(c)，線性回歸方程為epc＝-0.0496lnυ-0.340(γ＝0.997)和epa＝0.0412lnυ-0.0856(γ＝0.999)。根據(jù)laviron方程，可以計(jì)算出電極反應(yīng)的電化學(xué)參數(shù)：電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(α)，電活性物質(zhì)發(fā)生電極反應(yīng)時(shí)的電子轉(zhuǎn)移數(shù)(n)和電極反應(yīng)速率常數(shù)(ks)分別為0.45,1.13和1.36s^-1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明gqds有利于hb的固定，使得hb在修飾電極上加快了電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。

實(shí)施例6

在ph為5.0的pbs中研究了hb在不同修飾電極中的電化學(xué)行為，見(jiàn)圖3。從圖中可觀察到裸cile(曲線a)和nafion/gqds/cile(曲線c)在緩沖溶液中循環(huán)伏安掃描沒(méi)有氧化還原峰出現(xiàn)，表明電極表面不存在電活性物質(zhì)。然而nafion/gqds/cile的背景電流大大增加，這表明在電極表面gqds的出現(xiàn)增加了充電電流。當(dāng)hb固定在cile表面后，出現(xiàn)一對(duì)較小的不對(duì)稱(chēng)的氧化還原峰(曲線b)，表明hb與cile之間的直接電子轉(zhuǎn)移速度緩慢。在nafion/hb/gqds/cile(曲線d)上，氧化還原峰電流大大增加，峰形比nafion/hb/cile更加對(duì)稱(chēng)，所以說(shuō)gqds有利于固定更多的hb分子，加速其在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例7

對(duì)nafion/hb/gqds/cile(實(shí)施例1制備的1.0mg/ml濃度的gqds修飾)進(jìn)行tca的電催化還原測(cè)試，在ph為5.0的pbs中加入tca后，在-0.244v出現(xiàn)新的還原峰，且隨著tca加入量的增大，還原峰電流明顯增大而氧化峰逐漸減少甚至消失，結(jié)果見(jiàn)圖4。還原峰電流和tca的濃度在6.0～100.0mmol/l的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為iss(μa)＝0.00275c(mmol/l)+0.0246(γ＝0.986)，檢測(cè)限為2.0mmol/l(3σ)，表明nafion/hb/gqds/cile對(duì)三氯乙酸的催化效果良好。

實(shí)施例8

對(duì)多種電極進(jìn)行交流阻抗測(cè)試，見(jiàn)圖5。通過(guò)高頻區(qū)的半圓可以求解電荷轉(zhuǎn)移電阻(ret)，三種電極的ret值依次為55.13ω(nafion/gqds/cile，曲線a)；60.11ω(nafion/hb/gqds/cile，曲線b)；79.17ω(nafion/hb/cile，曲線c)，由數(shù)據(jù)可知nafion/gqds/cile的ret值最小，這是由于石墨烯量子點(diǎn)具有良好的導(dǎo)電性和大的比表面積為電荷轉(zhuǎn)移提供了快速通道。而nafion/hb/cile的ret值最大，是因?yàn)椴粚?dǎo)電的蛋白質(zhì)的存在使電極表面電荷轉(zhuǎn)移的阻力增大。當(dāng)加入gqds后，ret值降低，說(shuō)明石墨烯量子點(diǎn)材料的存在有效的降低了電荷轉(zhuǎn)移電阻。

實(shí)施例2制備的1.0mg/ml濃度的gqds修飾的nafion/hb/gqds/cile也可達(dá)到與實(shí)施例1制備的相應(yīng)濃度的gqds修飾的nafion/hb/gqds/cile電極的相同效果，實(shí)施例1、2制備的其他濃度gqds修飾的nafion/hb/gqds/cile也可得到較好的效果；限于篇幅，不一一贅述。本發(fā)明引用在先專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01610168460.4)的全部?jī)?nèi)容。