本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種檢測(cè)人胃蛋白酶原ii的試劑盒。

背景技術(shù)：

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前體，根據(jù)其生化性質(zhì)和免疫原性將其分成2個(gè)亞群1-5組分的免疫原性相同稱(chēng)pgi。主要由胃腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌，組分6-7稱(chēng)pgii，由胃體的胃底黏膜的泌酸腺的主細(xì)胞分泌，泌酸腺的黏液頸細(xì)胞、賁門(mén)腺和胃竇的幽門(mén)腺的黏液細(xì)胞以及十二指腸上段的brunner腺也能產(chǎn)生pgii，前列腺和胰腺也產(chǎn)生少量pgii。正常情況下約1％的pg進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)入的量十分穩(wěn)定，因此血清pgi、ii反映胃黏膜腺體和細(xì)胞的數(shù)量，也間接反應(yīng)胃黏膜不同部位的分泌功能。當(dāng)胃黏膜發(fā)生病理變化時(shí)，血清pg含量也隨之改變。被稱(chēng)為胃黏膜的“血清學(xué)活檢”。因此血清pgi反映胃黏膜腺體和細(xì)胞的數(shù)量，也間接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。

國(guó)內(nèi)外臨床研究表示，pgi升高提示胃黏膜破損可能性高，萎縮性胃炎是胃癌的主要癌前病變，當(dāng)發(fā)生萎縮性胃炎時(shí)，腺體和主細(xì)胞數(shù)量減少，引起胃蛋白酶原i分泌下降，而胃蛋白酶原ii含量保持穩(wěn)定，因此血清胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值降低。胃潰瘍患者血清胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值升高，但在癌變患者中胃蛋白酶原i/胃蛋白酶原ii比值是降低的。由于在胃部感染-萎縮性胃炎-胃癌的發(fā)展過(guò)程中，均伴隨著胃蛋白酶原的變化，胃蛋白酶原不僅成為這三種病變的良好診斷析指標(biāo)，而且是治療和預(yù)防干預(yù)過(guò)程中最要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。因此，檢測(cè)血清胃蛋白酶原i與胃蛋白酶原ii的含量以及比值變化對(duì)胃部疾病的診斷具有多方面的臨床意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種檢測(cè)人胃蛋白酶原ii蛋白的試劑盒。

本發(fā)明至少包括樣本稀釋液、酶標(biāo)液、胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品、包被胃蛋白酶原ii抗體的酶聯(lián)板、顯色底物、洗滌液，酶聯(lián)板上包被有動(dòng)物抗人胃蛋白酶原ii多抗。動(dòng)物抗人胃蛋白酶原ii多抗作為酶聯(lián)包被捕獲抗體，從而獲得更多的表位，提高人胃蛋白酶原ii捕獲率，酶標(biāo)液為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人胃蛋白酶原ii蛋白單克隆抗體。另外用于免疫動(dòng)物的人胃蛋白酶原ii蛋白先經(jīng)過(guò)ph7.3～7.5的pbs預(yù)處理，使其弱堿性化，從而與人體血液中人胃蛋白酶原ii形態(tài)一致，從而其暴露表位與人體血液中人胃蛋白酶原ii，避免非特異位點(diǎn)暴露，提高特異性。另外本發(fā)明還可以包括2～4m硫酸作為終止液，使顯色完成后，顯色穩(wěn)定方便檢測(cè)。本發(fā)明為了提高檢測(cè)的穩(wěn)定性，將樣本稀釋液酸堿度調(diào)整為ph7.0～8.0的pbs緩沖體系，從而使之更加接近人體血液體系酸堿度。為了獲得更加特異性的檢測(cè)抗體，本發(fā)明使用人胃蛋白酶原ii免疫小鼠，獲得鼠抗人胃蛋白酶原ii抗體。

本發(fā)明胃蛋白酶原i抗體采用以下方法獲得：我們從臨床標(biāo)本中獲得人胃蛋白酶原ii又稱(chēng)為胃蛋白酶原c(pepsinogenc，pgc)的編碼基因，并將其克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pet-28a，然后在大腸桿菌bl21[de3]中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。sds-page的結(jié)果顯示，我們?cè)诖竽c桿菌表達(dá)體系中成功地表達(dá)了高水平的胃蛋白酶原ii。經(jīng)鑒定，表達(dá)的胃蛋白酶原ii在大腸桿菌中以包涵體的形式存在。采用鎳親和層析純化重組胃蛋白酶原ii。使用所獲得的胃蛋白酶原ii免疫動(dòng)物，制得動(dòng)物抗人胃蛋白酶原ii多抗。單抗的制備及純化，使用上述dna重組技術(shù)原核表達(dá)的胃蛋白酶原ii蛋白為抗原，分別免疫balb/c小鼠，按常規(guī)雜交瘤技術(shù)獲得陽(yáng)性克隆。經(jīng)生物學(xué)特性鑒定后，將穩(wěn)定傳代和穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射balb/c小鼠制備腹水。腹水經(jīng)50％飽和硫酸銨沉淀粗提，pbs透析后，再經(jīng)proteinasepharose-4bfastflow柱層析純化，獲得胃蛋白酶原ii單抗。

本發(fā)明為了提高雙抗夾心法信號(hào)強(qiáng)度采用了生物素與親和素放大系統(tǒng)，使用親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，同時(shí)使用生物素標(biāo)記抗人胃蛋白酶原ii單抗，然后按效價(jià)混合獲得偶聯(lián)物，將偶聯(lián)物稀釋到一定比例后使用，其中抗人胃蛋白酶原ii單抗優(yōu)選為鼠抗人胃蛋白酶原i單抗。

本發(fā)明為了提高特異性反應(yīng)減少反應(yīng)過(guò)程中封閉蛋白釋放從而導(dǎo)致酶標(biāo)板固相載體表面非特異性吸附，在樣本稀釋液與酶標(biāo)液中均加入了0.5％～1％的bsa作為反應(yīng)過(guò)程封閉蛋白，降低非特異性吸附。

本發(fā)明為了滿(mǎn)足定量檢測(cè)及質(zhì)控需求，在試劑盒中加入了胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)正常人分布區(qū)間，在正常人分布區(qū)間上兩端0～10ng/ml、15～25ng/ml進(jìn)行分布設(shè)計(jì)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，從而使之達(dá)到對(duì)正常人區(qū)間質(zhì)控，同時(shí)可以用于制作定量曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度，另外胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)選為5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，一個(gè)低值標(biāo)準(zhǔn)品，濃度≤5ng/ml，優(yōu)選2.5ng/ml、一個(gè)高值標(biāo)準(zhǔn)品，濃度≥20ng/ml，優(yōu)選25ng/ml一個(gè)中值標(biāo)準(zhǔn)品，濃度10～15ng/ml之間，優(yōu)選12.5ng/ml，兩個(gè)正常區(qū)間端值標(biāo)準(zhǔn)品，濃度區(qū)間分別5～10ng/ml、15～25ng/ml，優(yōu)選7.5ng/ml，20ng/ml。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

一種由樣本稀釋液、酶標(biāo)液、胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品、包被胃蛋白酶原ii抗體的酶聯(lián)板、

tmb顯色底物、洗滌液組成的試劑盒，其組分配方如下：

樣本稀釋液：ph7.0～8.0的pbs加入1％的bsa，0.05％吐溫-20；

酶標(biāo)液：hrp標(biāo)記的親和素-生物素化的鼠抗人胃蛋白酶原ii抗體，經(jīng)過(guò)ph7.3-7.5的pbs稀釋后得到；

包被胃蛋白酶原ii抗體的酶聯(lián)板：使用兔抗人胃蛋白酶原ii多抗包被的酶聯(lián)板；

tmb顯色底物：sigma商品化tmb顯色底物

洗滌液：ph7.3-7.5的pbs加入0.05％吐溫-20。

胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品：重組胃蛋白酶原ii蛋白溶于ph7.3-7.5的pbs，0.05％吐溫-20，2份，濃度分別為7.5ng/ml、20ng/ml；

經(jīng)過(guò)對(duì)試劑盒進(jìn)行線(xiàn)性、最低檢出限和準(zhǔn)確度評(píng)估：

1)采用陰性山羊血清作為稀釋液將胃蛋白酶原ii配制成濃度為5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5ng/m的標(biāo)準(zhǔn)濃度樣本，通過(guò)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在7.5～20ng/ml區(qū)間內(nèi)其線(xiàn)性r＞0.99，在25～25ng/ml區(qū)間內(nèi)其線(xiàn)性r＞0.99；

2)采用陰性山羊血清作為0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10復(fù)孔檢測(cè)，其最低檢出限為0.77ng/ml；

3)采用10次復(fù)孔檢測(cè)確定胃蛋白酶原ii濃度為2ng/ml的人血清樣本，分別分裝為50ul每支，分別加入50ul濃度為5、10、20ng/ml，配制成理論濃度分別為3.5、6、11ng/ml的樣本，另取一份加入50ul濃度為0ng/ml的陰性山羊血清作為基礎(chǔ)濃度，所有樣本進(jìn)行3復(fù)孔同步檢測(cè)其濃度，計(jì)算回收率，

回收率＝2×(理論濃度-基礎(chǔ)濃度)/加入濃度

回收率依次為：88.0％、93.0％、95.0％、100.0％

實(shí)施例2：

一種由樣本稀釋液、酶標(biāo)液、胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品、包被胃蛋白酶原ii抗體的酶聯(lián)板、

tmb顯色底物、洗滌液、終止液組成的試劑盒，其組分配方如下：

樣本稀釋液：ph7.3-7.5的pbs加入1％的bsa，0.05％吐溫-20；

酶標(biāo)液：hrp標(biāo)記的鼠抗人胃蛋白酶原ii抗體，經(jīng)過(guò)ph7.3-7.5的pbs稀釋后得到；

包被胃蛋白酶原ii抗體的酶聯(lián)板：使用兔抗人胃蛋白酶原ii多抗包被的酶聯(lián)板，其中免抗人胃蛋白酶原ii多抗由重組人胃蛋白酶原ii經(jīng)過(guò)ph7.35的pbs堿性化后免疫家兔，取血清經(jīng)過(guò)純化后獲得多抗；

tmb顯色底物：sigma商品化tmb顯色底物

洗滌液：ph7.3-7.5的pbs加入0.05％吐溫-20。

終止液：2m硫酸

胃蛋白酶原ii標(biāo)準(zhǔn)品：重組胃蛋白酶原ii蛋白溶于ph7.3-7.5的pbs，0.05％吐溫-20，5份，濃度分別為2.5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/ml、20ng/ml、25ng/ml；

經(jīng)過(guò)對(duì)試劑盒進(jìn)行線(xiàn)性、最低檢出限和準(zhǔn)確度評(píng)估：

1)采用陰性山羊血清作為稀釋液將胃蛋白酶原ii配制成濃度為5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5ng/m的標(biāo)準(zhǔn)濃度樣本，通過(guò)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在7.5～20ng/ml區(qū)間內(nèi)其線(xiàn)性r＞0.99，在25～25ng/ml區(qū)間內(nèi)其線(xiàn)性r＞0.99；

2)采用陰性山羊血清作為0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10復(fù)孔檢測(cè)，其最低檢出限為0.693ng/ml；

3)采用10次復(fù)孔檢測(cè)確定胃蛋白酶原ii濃度為2ng/ml的人血清樣本，分別分裝為50ul每支，分別加入50ul濃度為5、10、20ng/ml，配制成理論濃度分別為3.5、6、11ng/ml的樣本，另取一份加入50ul濃度為0ng/ml的陰性山羊血清作為基礎(chǔ)濃度，所有樣本進(jìn)行3復(fù)孔同步檢測(cè)其濃度，計(jì)算回收率，

回收率＝2×(理論濃度-基礎(chǔ)濃度)/加入濃度

回收率依次為：98.0％、97.0％、105.0％、109.0％

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明。

本說(shuō)明書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”旨在包括嵌合或重組抗體以及單克隆抗體和多克隆抗體或其蛋白水解片段，例如片段fab或f(ab’)2等。此外，編碼抗體的可變區(qū)的dna能夠被插入到另外的抗體中，以通過(guò)此方式產(chǎn)生嵌合抗體。簡(jiǎn)單鏈抗體(scfv)能夠是由具有抗體的與抗原結(jié)合的特征性能力且包含一對(duì)與免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區(qū)同源或類(lèi)似的氨基酸序列(vh-vl或scfv鍵)的簡(jiǎn)單鏈形成的多肽?？贵w的輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽類(lèi)似物，如果需要，能夠通過(guò)連接多肽結(jié)合。產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且被包括在現(xiàn)有技術(shù)中。