本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1稱AFB1）是真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要是由黃曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）和特曲霉（Aspergillusnomius）產(chǎn)生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麥和稻米等農(nóng)作物中，具有強(qiáng)烈的毒性和致癌性；它是目前化學(xué)致癌物中最強(qiáng)的一種致癌誘變劑，其毒性比氰化鉀強(qiáng)10倍，其致癌性比二甲基亞硝胺強(qiáng)75倍。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，其作用的靶器官主要為肝臟。我國國標(biāo)中規(guī)定，大米中的黃曲霉素含量不得高于10μg/kg。
目前，黃曲霉素B1的檢測方法主要有：薄層色譜法、高效液相色譜法。這類方法雖然檢測精度較高，但存在儀器昂貴，檢測成本高，操作不便捷等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種低成本、操作簡便、快速而準(zhǔn)確的食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒，包括酶標(biāo)板、黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品、大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液、底物液A雙氧水、熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)和濃縮洗滌液；所述的大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液的制備：用0.006～0.08mol/L、pH值7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液，將大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1稀釋成1：4000而得；所述的大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1的制備，步驟為：取0.5mg黃曲霉素B1溶解于500μL、0.8mg/mL的四氫呋喃溶液中，加入0.9～1.1mg N-羥基丁二酰亞胺和1.8～2.0mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應(yīng)45～50min；10000r/min離心15min，取上清揮發(fā)溶劑，取殘留物溶于200μL二甲基甲酰胺中，得到活化產(chǎn)物；將活化產(chǎn)物緩慢滴加于含大豆過氧化氫酶濃度為3.6～3.8mg/mL的碳酸氫鈉溶液中，室溫避光劇烈振蕩過夜，反應(yīng)產(chǎn)物在0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中透析3天，去除游離的黃曲霉素B1；透析結(jié)束后，將樣品冷凍干燥得到大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1，分裝，-20℃保存。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的酶標(biāo)板的制備：用0.042～0.045mol/L、pH值9.2～9.3的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將蛋白G稀釋成18.5～19.5μg/mL，100μL/孔，1～4℃放置過夜；取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340μL/孔，洗板3次，30s/次；然后將抗黃曲霉素B1單克隆抗體稀釋成0.65～0.72μg/mL，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340μL/孔，洗板3次，30s/次；最后加入0.5wt.%牛血清白蛋白封閉，340μL/孔，37℃放置2h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板置于常溫條件下晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4℃下保存。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的底物液A雙氧水的制備：用0.006～0.08mol/L、pH值7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋至10μmol/L。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)的制備，步驟為：取新鮮配置的硫化鈉溶液加入到醋酸鋅溶液中，加入1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11.2，向混合溶液中加入甘氨酸溶液做穩(wěn)定劑，形成的硫化鋅前體溶液水浴加熱到95℃；前體溶液中加入各溶液的濃度為醋酸鋅溶液的終濃度為8～9mmol/L，甘氨酸的終濃度為21～22mmol/L，硫化鈉的終濃度為6～7mmol/L；用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋成1：400倍。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.42～0.45wt.％吐溫-20、0.007～0.009mol/L的pH值7.1～7.3的磷酸鹽緩沖液。
利用所述的食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，包括以下步驟：
（1）樣品前處理
取粉碎好的樣品過20目篩，并徹底混合；稱取5g樣品，加入12.5mL提取液（甲醇：水＝7：3），劇烈震蕩30min；5000rpm離心10min，用濾紙過濾；取1mL濾液用1mL磷酸鹽緩沖液稀釋，備用。
（2）用上述試劑盒檢測樣品中黃曲霉素B1殘留量
取酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL/孔到對應(yīng)的微孔中；加入大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液，50μL/孔，用蓋板膜蓋板后置室溫37℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；加入底物液A雙氧水（10μmol/L）稀釋液，100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min；加入熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)稀釋液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min，設(shè)定熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為610nm處檢測，測定每孔熒光值（請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；以標(biāo)準(zhǔn)品測試的熒光值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃曲霉素B1的含量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過樣品中的黃曲霉素B1與大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1競爭性的與酶標(biāo)板上固定的抗黃曲霉素B1單克隆抗體結(jié)合，通過大豆過氧化氫酶催化雙氧水分解，降低對甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)的熒光淬滅，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小來判斷樣品中黃曲霉素B1的含量。如果樣品中的黃曲霉素B1含量少，熒光強(qiáng)度高；反之，則熒光強(qiáng)度低。即熒光強(qiáng)度的高低與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中黃曲霉素B1的含量成反比例關(guān)系。本發(fā)明的檢測試劑盒操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，可直接用于檢測食品中的黃曲霉素B1，適用于大批量樣品的檢測。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
本發(fā)明實(shí)施例中，一種食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒，包括酶標(biāo)板、黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品、大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液、底物液A雙氧水、熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)和濃縮洗滌液。
酶標(biāo)板的制備：用0.042～0.045mol/L、pH值9.2～9.3的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將蛋白G稀釋成18.5～19.5μg/mL，100μL/孔，1～4℃放置過夜；取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340μL/孔，洗板3次，30s/次；然后將抗黃曲霉素B1單克隆抗體稀釋成0.65～0.72μg/mL，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340μL/孔，洗板3次，30s/次；最后加入0.5wt.%牛血清白蛋白封閉，340μL/孔，37℃放置2h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板置于常溫條件下晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4℃下保存。
黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。
大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1的制備，步驟為：取0.5mg黃曲霉素B1溶解于500μL、0.8mg/mL的四氫呋喃溶液中，加入0.9～1.1mg N-羥基丁二酰亞胺和1.8～2.0mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應(yīng)45～50min；10000r/min離心15min，取上清揮發(fā)溶劑，取殘留物溶于200μL二甲基甲酰胺中，得到活化產(chǎn)物；將活化產(chǎn)物緩慢滴加于含大豆過氧化氫酶濃度為3.6～3.8mg/mL的碳酸氫鈉溶液中，室溫避光劇烈振蕩過夜，反應(yīng)產(chǎn)物在0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中透析3天，去除游離的黃曲霉素B1；透析結(jié)束后，將樣品冷凍干燥得到大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1，分裝，-20℃保存。
大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液的制備：用0.006～0.08mol/L、pH值7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液，將大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1稀釋成1：4000而得。
底物液A雙氧水的制備：用0.006～0.08mol/L、pH值7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋至10μmol/L。
熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)的制備，步驟為：取新鮮配置的硫化鈉溶液加入到醋酸鋅溶液中，加入1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11.2，向混合溶液中加入甘氨酸溶液做穩(wěn)定劑，形成的硫化鋅前體溶液水浴加熱到95℃。前體溶液中加入各溶液的濃度為醋酸鋅溶液的終濃度為8～9mmol/L，甘氨酸的終濃度為21～22mmol/L，硫化鈉的終濃度為6～7mmol/L。用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋成1：400倍。
濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.42～0.45wt.％吐溫-20、0.007～0.009mol/L的pH值7.1～7.3的磷酸鹽緩沖液。
利用所述的食品中黃曲霉素B1的檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，包括以下步驟：
（1）樣品前處理
取粉碎好的樣品過20目篩，并徹底混合；稱取5g樣品，加入12.5mL提取液（甲醇：水＝7：3），劇烈震蕩30min；5000rpm離心10min，用濾紙過濾；取1mL濾液用1mL磷酸鹽緩沖液稀釋，備用。
（2）用上述試劑盒檢測樣品中黃曲霉素B1殘留量
取酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL/孔到對應(yīng)的微孔中；加入大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1工作液，50μL/孔，用蓋板膜蓋板后置室溫37℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液340μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；加入底物液A雙氧水（10μmol/L）稀釋液，100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min；加入熒光底物液B甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)稀釋液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min，設(shè)定熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為610nm處檢測，測定每孔熒光值（請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；以標(biāo)準(zhǔn)品測試的熒光值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃曲霉素B1的含量。
（3）分析結(jié)果
用上述制備的試劑盒中的10個(gè)黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。在激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為610nm處檢測熒光強(qiáng)度。
百分熒光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分熒光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分熒光強(qiáng)度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的熒光強(qiáng)度值，再乘以100%，即百分熒光率（%）＝F/F0×100%，其中F為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均熒光強(qiáng)度值，F(xiàn)0為0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均熒光強(qiáng)度值。
以標(biāo)準(zhǔn)品百分熒光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)進(jìn)行實(shí)際樣本檢測時(shí)，將樣本的百分熒光率（F/F0×100％）值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所對應(yīng)樣本的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉素B1的實(shí)際濃度。
本發(fā)明通過樣品中的黃曲霉素B1與大豆過氧化氫酶標(biāo)記黃曲霉素B1競爭性的與酶標(biāo)板上固定的抗黃曲霉素B1單克隆抗體結(jié)合，通過大豆過氧化氫酶催化雙氧水分解，降低對甘氨酸修飾的硫化鋅量子點(diǎn)的熒光淬滅，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小來判斷樣品中黃曲霉素B1的含量。如果樣品中的黃曲霉素B1含量少，熒光強(qiáng)度高；反之，則熒光強(qiáng)度低。即熒光強(qiáng)度的高低與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中黃曲霉素B1的含量成反比例關(guān)系。本發(fā)明的檢測試劑盒操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，可直接用于檢測食品中的黃曲霉素B1，適用于大批量樣品的檢測。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。