本發(fā)明屬于生物成像領(lǐng)域，更具體地，涉及一種pH不敏感熒光蛋白標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法。

背景技術(shù)：

在生物組織中詳細(xì)地獲取分子和蛋白的空間分布，可以更加清楚地了解生物學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)通路，解析生物功能的形成，是理解生物體結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的重要基礎(chǔ)。熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)作為一種有用的基因標(biāo)記手段，能夠在活體狀態(tài)下，針對(duì)感興趣的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)，為了更好的研究這些細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，在同一生物體內(nèi)進(jìn)行多種熒光蛋白共標(biāo)記的方法，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

針對(duì)厚組織進(jìn)行光學(xué)成像時(shí)，目前已有的層析技術(shù)主要有兩種：一種是光學(xué)層析技術(shù)，通過光學(xué)方法抑制焦面以外的熒光從而提高z向分辨率。光學(xué)層析技術(shù)的主要限制在于其z向分辨率只能夠達(dá)到500nm，并且較低的z向分辨率極大地限制了多色熒光蛋白標(biāo)記的生物組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像的需求；另一種是物理層析技術(shù)，通過將生物組織包埋在樹脂中，通過物理切片的方式產(chǎn)生組織薄片，再對(duì)組織薄片進(jìn)行寬場(chǎng)成像，物理層析技術(shù)的主要限制在于通過這種方法進(jìn)行成像的過程中，組織薄片容易丟失，操做復(fù)雜，得到的圖像，其后期處理及三維配準(zhǔn)非常困難，無法用于大體積的生物組織。

pH不敏感的熒光蛋白，如紅色熒光蛋白DsRed用于標(biāo)記生物組織時(shí)，由于沒有合適的熒光控制方法，成像時(shí)只能采用物理層析進(jìn)行大體積成像，例如采用雙光子顯微鏡進(jìn)行點(diǎn)掃描，成像速度很慢，而且存在背景熒光干擾、軸向分辨率低的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法，其目的在于利用過渡金屬離子和氫離子的協(xié)同作用將紅色熒光蛋白標(biāo)記的生物組織熒光蛋白淬滅，利用金屬離子螯合劑和氫氧根離子的協(xié)同作用將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，實(shí)現(xiàn)DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制，由此解決現(xiàn)有技術(shù)的pH不敏感的熒光蛋白標(biāo)記生物組織由于熒光不能控制或缺乏合適的熒光控制方法而導(dǎo)致的進(jìn)行熒光成像時(shí)的背景熒光干擾、軸向分辨率低、成像速度慢的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記生物組織的熒光控制方法，包括如下步驟：

(1)熒光淬滅：采用淬滅化學(xué)試劑將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光淬滅，得到熒光淬滅的生物組織，所述淬滅化學(xué)試劑包括過渡態(tài)金屬離子，所述淬滅化學(xué)試劑的pH為3～6；

(2)熒光重激活：采用重激活化學(xué)試劑將步驟(1)所述的熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，所述重激活化學(xué)試劑包括金屬離子螯合劑，所述重激活化學(xué)試劑的pH為10～13。

優(yōu)選地，所述淬滅化學(xué)試劑的pH為3～5。

優(yōu)選地，所述淬滅化學(xué)試劑為過渡態(tài)金屬離子化合物的水溶液。

優(yōu)選地，所述淬滅化學(xué)試劑為過渡態(tài)金屬離子化合物的水溶液和酸的混合溶液。

優(yōu)選地，所述酸為醋酸。

優(yōu)選地，所述過渡態(tài)金屬離子為Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述過渡態(tài)金屬離子為Cu²⁺。

優(yōu)選地，所述過渡態(tài)金屬離子的濃度為10mM至500mM。

優(yōu)選地，所述過渡態(tài)金屬離子的濃度為100mM。

優(yōu)選地，所述重激活化學(xué)試劑的pH為11～12。

優(yōu)選地，所述重激活化學(xué)試劑為金屬離子螯合劑。

優(yōu)選地，所述重激活化學(xué)試劑為金屬離子螯合劑與堿的混合溶液。

優(yōu)選地，所述堿為碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

優(yōu)選地，所述金屬離子螯合劑為EDTA-Na₄、EDTA-Na₃和/或二乙二胺中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述金屬離子螯合劑為EDTA-Na₄。

優(yōu)選地，所述重激活化學(xué)試劑為原卟啉鈉和堿的混合溶液。

優(yōu)選地，所述金屬離子螯合劑的濃度為100mM至500mM。

優(yōu)選地，所述金屬離子螯合劑的濃度為200mM。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。

(1)本發(fā)明利用過渡金屬離子和氫離子的協(xié)同作用將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織熒光蛋白淬滅，利用金屬離子螯合劑和氫氧根離子的協(xié)同作用將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，實(shí)現(xiàn)DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光的精確控制，淬滅徹底完全，激活方便，效果好，其熒光強(qiáng)度對(duì)比度大大增加，其重新激活后的熒光強(qiáng)度是淬滅狀態(tài)的熒光強(qiáng)度的20倍以上，保證了其用于進(jìn)一步成像的成像效果；

(2)本發(fā)明pH不敏感的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記生物組織的熒光控制方法可以應(yīng)用于生物組織的層析成像，由于熒光淬滅完全，因此成像時(shí)，不存在背景熒光干擾的問題；

(3)本發(fā)明的熒光控制方法應(yīng)用于DsRed標(biāo)記的生物組織的層析成像時(shí)，重激活熒光可以只激活生物組織樣品表層被淬滅的熒光，這樣激活表層的厚度即為層析成像時(shí)的軸向分辨率，從而能夠穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)微米或納米級(jí)層析厚度；

(4)本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法，結(jié)合寬場(chǎng)成像系統(tǒng)能夠?qū)t色熒光標(biāo)記的樣品同時(shí)進(jìn)行化學(xué)層析成像，實(shí)現(xiàn)大體積生物組織的快速成像；pH不敏感的DsRed紅色熒光蛋白，在過渡態(tài)金屬離子的作用下使DsRed紅色熒光蛋白產(chǎn)生pH值敏感性，可以兼容pH敏感的熒光蛋白實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記成像，實(shí)現(xiàn)鼠腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)研究的雙通道標(biāo)記和大樣本軸向高分辨成像；

(5)本發(fā)明的熒光控制方法簡(jiǎn)單易行，采用的化學(xué)試劑價(jià)廉易得。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記生物組織的熒光控制方法流程圖；

圖2是本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed的淬滅-重激活機(jī)理；

圖3是不同濃度的CuSO₄水溶液的PH值；

圖4是不同濃度的EDTA-Na₄水溶液的PH值；

圖5是實(shí)施例1的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦組織的淬滅-激活成像圖。圖5(a)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片在100mM CuSO₄溶液中淬滅30分鐘后的圖像，其為對(duì)比度增大20倍處理后的圖像；圖5(b)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片浸漬在200mM EDTA-Na₄溶液中重激活的圖像。

圖6是實(shí)施例2的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦組織的淬滅-激活成像圖。圖6(a)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片在200mM FeCl₃溶液中淬滅30分鐘后的圖像，其為對(duì)比度增大10倍處理后的圖像；圖6(b)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片浸漬在400mM原卜啉鈉溶液并采用氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至11～12后重激活的圖像。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供的一種紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記生物組織的熒光控制方法，包括如下步驟：

(1)熒光淬滅：采用淬滅化學(xué)試劑將紅色熒光蛋白標(biāo)記的生物組織的熒光淬滅，得到熒光淬滅的生物組織，所述淬滅化學(xué)試劑包括過渡態(tài)金屬離子，所述淬滅化學(xué)試劑的pH為3～6,優(yōu)選為3～5。

其中，所述淬滅化學(xué)試劑可以為水解呈酸性的過渡態(tài)金屬離子溶液；也可以為過渡態(tài)金屬離子溶液和酸的混合溶液，其pH均為為3～6，優(yōu)選為3～5，其中酸優(yōu)選為弱酸，如醋酸。太強(qiáng)的酸會(huì)導(dǎo)致淬滅不可逆，不能重激活，因此淬滅化學(xué)世界的pH控制很重要。

過渡態(tài)金屬離子為Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一種或多種，優(yōu)選為Cu²⁺。所述的二價(jià)銅離子(Cu²⁺)的離子化合物為CuSO₄、CuCl₂、Cu(NO₃)₂、Cu(CH₃COO)₂等試劑。更優(yōu)選的，所述的二價(jià)銅離子(Cu²⁺)的離子化合物為CuSO₄水溶液。

過渡態(tài)金屬離子的濃度為10mM至500mM，優(yōu)選為100mM。

(2)熒光重激活：采用重激活化學(xué)試劑將步驟(1)所述的熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，所述重激活化學(xué)試劑包括金屬離子螯合劑，所述重激活化學(xué)試劑的pH為10～13，優(yōu)選為11～12。

重激活化學(xué)試劑可以為水解呈堿性的金屬離子螯合劑，其pH為10～13，優(yōu)選為11～12；重激活化學(xué)試劑也可以為金屬離子螯合劑與堿的混合溶液，其pH為10～13，優(yōu)選為11～12，其中堿優(yōu)選為碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

能水解呈堿性的金屬離子螯合劑為EDTA-Na₄、EDTA-Na₃和/或二乙二胺中的一種或多種，優(yōu)選為EDTA-Na₄。

重激活化學(xué)試劑也可為原卟啉鈉和堿的混合溶液，其pH為10～13，優(yōu)選為11～12。

金屬離子螯合劑的濃度為100mM至500mM，優(yōu)選為200mM。

本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織首先織采用4％的PFA溶液進(jìn)行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗處理，然后再使用本發(fā)明的熒光控制方法進(jìn)行熒光的淬滅和重激活。圖1為本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法的流程圖。

本發(fā)明提供的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法，利用過渡金屬離子和氫離子的協(xié)同作用將紅色熒光蛋白標(biāo)記的生物組織熒光蛋白淬滅，利用金屬離子螯合劑和氫氧根離子的協(xié)同作用將熒光淬滅的生物組織的熒光重激活，實(shí)現(xiàn)DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光的精確控制，淬滅徹底完全，重激活熒光程度高，試劑便宜易得且操作簡(jiǎn)單。紅色熒光蛋白DsRed來源于紅珊瑚，對(duì)pH值不敏感，本發(fā)明采用過渡態(tài)金屬離子作用于紅色熒光蛋白DsRed，使之產(chǎn)生pH敏感性。

圖2為本發(fā)明的熒光控制方法對(duì)紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記生物組織時(shí)的熒光的淬滅-重激活機(jī)理示意圖，過渡金屬離子如二價(jià)銅離子的水溶液由于水解產(chǎn)生弱酸性，如圖3所示，圖3為不同銅離子濃度對(duì)應(yīng)的PH值，因此二價(jià)銅離子的水溶液中具有氫離子，銅離子與DsRed熒光蛋白發(fā)色團(tuán)周圍的蛋白質(zhì)結(jié)合，使得氫離子可以和DsRed熒光蛋白分子結(jié)合形成氫鍵，降低DsRed熒光發(fā)色團(tuán)的共軛π電子云的密度，達(dá)到淬滅熒光的效果。但是DsRed本身不是pH敏感的熒光蛋白，不會(huì)由于氫離子的存在而淬滅。本發(fā)明的申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在有過渡金屬離子的存在下，由于氫離子和過渡金屬離子的協(xié)同作用，才使得DsRed熒光蛋白分子發(fā)生淬滅。

熒光重激活的過程是熒光淬滅的逆過程。圖4為不同濃度的EDTA-Na₄水溶液與pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以看出其水解呈堿性，pH為10～12，EDTA-Na₄溶液水解后產(chǎn)生氫氧根離子。采用金屬離子的螯合劑，尤其是水解呈堿性的金屬離子螯合劑，通過螯合劑和氫氧根離子的協(xié)同作用，從而實(shí)現(xiàn)熒光蛋白分子標(biāo)記生物組織的熒光的重激活。直接用氫氧根離子也可以重激活被淬滅的熒光，但是效果不如加入金屬離子螯合劑，即不如利用氫氧根離子和螯合劑的協(xié)同效果好。

本發(fā)明的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的生物組織的熒光控制方法熒光淬滅效果好，重激活熒光強(qiáng)度高，對(duì)比度高，可以結(jié)合寬場(chǎng)成像系統(tǒng)對(duì)紅色熒光蛋白標(biāo)記的生物組織樣品進(jìn)行化學(xué)層析成像，實(shí)現(xiàn)大體積生物組織的多色快速成像。首先采用本發(fā)明的熒光淬滅化學(xué)試劑將生物組織的熒光信號(hào)全部進(jìn)行可逆的淬滅，然后在成像過程中通過激活化學(xué)試劑將表面的熒光信號(hào)進(jìn)行重新激活。用光化學(xué)層析技術(shù)結(jié)合寬場(chǎng)顯微成像方法，在成像過程中通過用熒光激活化學(xué)試劑激活被包埋組織的表層，表層激活厚度即為z向?qū)游龊穸?，能夠穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)微米或納米級(jí)層析厚度，z向的層析不依賴于光學(xué)系統(tǒng)，能夠?qū)Χ嗌珶晒獾鞍讟?biāo)記的生物組織進(jìn)行z軸向高分辨率成像；由于熒光淬滅完全，因此成像時(shí)，該熒光控制方法能夠抑制照明光對(duì)下層熒光蛋白的激發(fā)，不存在背景熒光干擾的問題。

以下為實(shí)施例：

實(shí)施例1

(1)將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦采用4％的PFA溶液進(jìn)行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗處理；

(2)將固定和漂洗后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用100mM的CuSO₄溶液(pH為4～5)進(jìn)行淬滅處理30分鐘并進(jìn)行熒光成像；

(3)將猝滅后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用200mM的EDTA-Na₄水溶液(pH為11～11.5)進(jìn)行重激活30分鐘同時(shí)進(jìn)行熒光成像。

圖5是本實(shí)施例的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦組織的淬滅-激活成像圖。圖5(a)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片在100mM CuSO₄溶液中淬滅30分鐘后的圖像，其對(duì)比度進(jìn)行了增大20倍的處理，以便于和重激活后的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較；圖5(b)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片浸漬在200mM EDTA-Na₄溶液中重激活的圖像。

可以看出，重激活后的鼠腦熒光強(qiáng)度與淬滅后的鼠腦圖像對(duì)比度增大20倍的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明采用本實(shí)施例的熒光淬滅-重激活控制方法，可以將鼠腦組織的熒光對(duì)比度增大20倍或更高。

實(shí)施例2

(1)將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦采用4％的PFA溶液進(jìn)行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗處理；

(2)將固定和漂洗后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用200mM的FeCl₃溶液(pH為3.5～4.5)進(jìn)行淬滅處理30分鐘并進(jìn)行熒光成像；

(3)將猝滅后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用400mM的原卟啉鈉水溶液并采用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至11～12后進(jìn)行重激活30分鐘同時(shí)進(jìn)行熒光成像。

圖6是實(shí)施例2的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦組織的淬滅-激活成像圖。圖6(a)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片在200mM FeCl₃溶液中淬滅30分鐘后的圖像，其對(duì)比度進(jìn)行了增大10倍的處理，便于和重激活后的鼠腦組織的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比對(duì)；圖6(b)是紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記鼠腦片浸漬在400mM原卟啉鈉溶液并采用氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至11～12后重激活的圖像。

可以看出，重激活后的鼠腦組織的熒光強(qiáng)度與淬滅后的鼠腦圖像對(duì)比度增大10倍的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明采用本實(shí)施例的熒光淬滅-重激活控制方法，可以將鼠腦組織的熒光對(duì)比度增大10倍或更高。

實(shí)施例3

(1)將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦采用4％的PFA溶液進(jìn)行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗處理；

(2)將固定和漂洗后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用10mM的CoSO₄溶液及醋酸將溶液的pH調(diào)至3～4，進(jìn)行淬滅處理30分鐘并進(jìn)行熒光成像；

(3)將猝滅后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用100mM的EDTA-Na₃水溶液(pH為11～11.4)進(jìn)行重激活30分鐘同時(shí)進(jìn)行熒光成像。

重激活后的鼠腦組織的熒光強(qiáng)度與淬滅后的鼠腦圖像對(duì)比度增大10倍的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明采用本實(shí)施例的熒光淬滅-重激活控制方法，可以將鼠腦組織的熒光對(duì)比度增大10倍或更高。

實(shí)施例4

(1)將紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦采用4％的PFA溶液進(jìn)行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗處理；

(2)將固定和漂洗后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用500mM的FeCl₂溶液(pH為3.0～4.1)進(jìn)行淬滅處理30分鐘并進(jìn)行熒光成像；

(3)將猝滅后的紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記的鼠腦中的熒光蛋白采用500mM的二乙二胺水溶液(pH為11～12)進(jìn)行重激活30分鐘同時(shí)進(jìn)行熒光成像。

重激活后的鼠腦組織的熒光強(qiáng)度與淬滅后的鼠腦圖像對(duì)比度增大10倍的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明采用本實(shí)施例的熒光淬滅-重激活控制方法，可以將鼠腦組織的熒光對(duì)比度增大10倍或更高。

按以下方法將實(shí)施例進(jìn)行了各項(xiàng)性能的測(cè)試：

pH值測(cè)試：

根據(jù)GB6920-86玻璃電極法測(cè)試。樣品：不同梯度濃度的待測(cè)溶液。儀器：美國奧豪斯PH計(jì)。

熒光強(qiáng)度測(cè)試：

樣品：100微米鼠腦冠狀面腦片。儀器：德國Zeiss雙飛秒激光器多光子顯微鏡。DsRed測(cè)試條件：Laser 561nm,10％；pinhole 40；gain master 600；像素1024×1024，16bit；成像深度60微米，×20W。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。